Abstract
Galectin-9 er en allment uttrykt protein som er involvert i immunregulering og tumorpathogenesis og fungerer som en markør for en dårlig prognose i ulike typer kreft. Imidlertid, den kliniske virkning og den eksakte mekanismen ved hvilken dette proteinet bidrar til kolon tumor progresjon er uklare. I denne studien, vi har oppdaget uttrykk for galectin-9 og CD56 celler ved hjelp av immunhistokjemi. Spearmans rank korrelasjon ble brukt til å klargjøre sammenhengen mellom galectin-9 uttrykk og naturlig killer (NK) celle infiltrasjon. Påvirkningen av galectin-9 på NK-92 cellemigrering ble evaluert in vitro ved bruk av Transwell kjemotakse analyser. Rollen rh-galectin-9 i F-aktin polarisering i NK-92 celler ble undersøkt ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi. Vi viste at galectin-9 ble uttrykt i 101 (78,91%) tykktarm tumorvev og som ble uttrykt på lavere nivåer i disse vev enn i para-tumorvev. Lave nivåer av galectin-9 ekspresjon var positivt korrelert med et dårlig histologisk karakter og lymfeknutemetastase (P 0,05). En Kaplan-Meier metoden og Cox regresjonsanalyse viste at total overlevelse var lengre hos pasienter med høy galectin-9 uttrykk i en 8-års oppfølging (P 0,05). Spearmans rank korrelasjon indikerte at det var en lineær sammenheng mellom galectin-9 uttrykk og CD56
+ NK celle infiltrasjon (R
2 = 0,658; P 0,0001). Galectin-9 stimulert migrasjon i humane NK-92 celler ved å påvirke F-aktin polarisering gjennom Rho /ROCK1 signalveien. Disse resultatene tyder på at galectin-9 uttrykk potensielt representerer en ny mekanisme for svulster å unnslippe immun overvåking i colontumorer
Citation. Wang Y, Sun J, Ma C, Gao W, Song B, Xue H, et al. (2016) Redusert Uttrykk for Galectin-9 bidrar til et dårlig resultat i Colon Cancer ved å hemme NK Cell Chemotaxis Delvis gjennom Rho /ROCK1 signalveien. PLoS ONE 11 (3): e0152599. doi: 10,1371 /journal.pone.0152599
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA
mottatt: 21 desember 2015; Godkjent: 16 mars 2016; Publisert: 30 mars 2016
Copyright: © 2016 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Xun Qu (No. 31470885, 31270971, 81072406); Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Jintang Sun National Natural Science (nr 31300752); Foundation National Natural Science of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Qianqian Shao (nr 81300510); og National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til Meixiang Yang (nr 30901326)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hvert år ca 1,2 millioner pasienter utvikle tykktarmskreft (CRC) og 600.000 mennesker dør av denne sykdommen i verden [1]. Til tross for at det har vært positive forbedringer i kirurgiske og farmasøytiske strategier, forblir CRC langt fra terapeutisk kontroll [2]. Den nåværende mangel på kunnskap om immunologiske og molekylærbakenforliggende årsaker til CRC er et stort hinder for å bedre behandlinger for denne disease.Hence identifisere nye biomarkører er nødvendig for fremtidig utvikling av målrettede CRC terapier.
Utviklingen av kreft er en flertrinnsprosess som styres ikke bare av en rekke celle indre faktorer men også av ytre faktorer i svulsten mikromiljøet [3, 4]. Som viktige komponenter av svulsten mikromiljøet, visse typer av leukocytter påvirke tumorprogresjon og prognose [5-7]. Naturlige dreper (NK) -celler er en av de store celletyper i det uspesifikke immunsystemet. I CRC, er omfattende intratumoral infiltrasjon av NK-celler assosiert med en bedre prognose, avhengig av deres cytotoksiske effekter på kreftceller [8, 9]. Men en fersk studie fant at NK-celler er generelt knappere i CRC mikromiljøet enn i tilstøtende normal slimhinne tross for tilstedeværelsen av relativt høye nivåer av NK celle-respons kjemokiner i tumorvev [10]. Denne motsetningen antydet at kjemokiner alene ikke kan være tilstrekkelig til å rekruttere NK-celler til svulsten.
Galectins er oppløselige medlemmer av superfamilien lektin som er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av en karbohydrat-gjenkjenning domene og β-galaktosid bindende affinitet. Totalt 15 pattedyr galectins har så langt identifisert [11]. Blant disse galectins, galectin-9 utstillinger immunregulerende virkninger der det forstyrrer funksjonen og biologiske atferd av ulike typer immunceller, inkludert T-celler, dendrittiske celler og NK-celler [12, 13]. I tumor-bærende mus, galectin-9 økte antall NK-celler i det peritoneale eksudat [14], noe som indikerer at det spiller en potensiell regulerende rolle som omfatter NK-celler i løpet av tumorprogresjon. Spesielt har lavere nivåer av galectin-9 blitt observert i de fleste typer kreftceller, inkludert oral karsinomer [15], melanom [16], brystkreft [17] og magekreft, [18], enn i deres normale motstykker . Gitt den nære sammenhengen mellom galectin-9 ekspresjon og NK-celletall, er det rimelig å spekulere i at et redusert nivå av galectin-9 i en svulst bidrar til dårlig infiltrering av NK-celler inn i tumoren mikromiljøet. Men fordi tilstedeværelsen og betydningen av galectin-9 uttrykk ennå ikke er påvist i tykktarm kreft vev, er det fortsatt uklart om denne foreningen skjer i tykktarmskreft og hva regulatoriske mekanismer som er involvert, om noen.
I denne studien fant vi at galectin-9 uttrykk ble redusert i tykktarm tumorvev, som er assosiert med dårlig prognose hos disse pasientene. Vi tilbyr også bevis ved hjelp av
in vitro
studier som galectin-9 forbedrer NK celle migrasjon ved å utøve effekter på F-aktin polarisering via Rho /ROCK1 signalveien. Disse resultatene representerer en potensielt ny mekanisme som svulster kan flykte fra immunovervåkning.
Materialer og metoder
Pasienter og vev
Vår studie inkluderte data som ble innhentet fra 128 pasienter med histologisk bekreftet tykktarmskreft som gjennomgikk kirurgi ved Qilu Hospital of Shandong University fra januar 2004 til desember 2011 (Jinan, Shandong, Kina), Dette inkluderer en gruppe av 38 pasienter der vi sammenlignet para-tumor med svulstvev og en annen gruppe 90 pasienter ble tatt med i overlevelsesanalyse. Innsamling og bruk av vevsprøver oppfylt de relevante retningslinjer og institusjonelle praksis av etikkomiteen av Qilu Hospital of Shandong University, og skriftlig godkjenning ble oppnådd i hvert tilfelle før vevsprøve samling. Den etiske komiteen av Qilu Hospital of Shandong University godkjent denne studien (Kyll-2013-069). Nøkkel clinicopathological data er vist i Tabell 1 og supplerende materialer og metoder (S1 fil).
Immunohistochemistry og evaluering
Avsnitt (4 mikrometer) av formalinfiksert parafin-embedded tykktarmskreft vevsprøver ble avvokset, utvannet, og inkubert med følgende primære antistoffer: kanin polyklonale anti-human galectin-9 (sc-366141, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og monoklonalt anti- human CD56 (3576, 01:50, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Seksjonene ble deretter farget med de tilsvarende sekundære antistoffer. To uavhengige patologer som var blindet for den kliniske data, evaluert immunhistokjemiske resultatene. Den brukes til å evaluere vev metoden er beskrevet i Supplerende Materialer og metoder (S1-fil).
Celler og behandlinger
cellene ble inkubert i henhold til standard prosedyrer som er beskrevet i ATCC kulturen guide. De humane kolontumorcellelinjer SW480, SW620 og HT29 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, USA) supplert med 5% føtalt bovint serum (FCS) (Bio International, USA). Den menneskelige NK92 cellelinjen var en gave fra The Second Military Medical University (Shanghai, Kina) [19] og dyrket med Alpha Minimum Essential medium (Gibco, USA) som inneholder 2 mM L-glutamin og 1,5 g /l natriumbikarbonat men uten ribonukleosider og deoksyribonukleosider, og ulike komponenter ble tilsatt for å oppnå fullstendig vekstmedium: 0,2 mM inositol (17508, Sigma, USA); 0,1 mM 2-merkaptoetanol (ES-007E, Merck Millipore, Tyskland); 0,02 mm folsyre (F8758, Sigma, USA); 100-200 U /ml rekombinant IL-2; og justering til en sluttkonsentrasjon på 12,5% hesteserum (16050, Gibco, USA) og 12,5% føtalt bovint serum. Alle celler ble inkubert med 5% CO
2 i henhold til standard prosedyrer i den ATCC kulturen guiden.
Isolering av humane NK-celler
Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble oppnådd etter sentrifugering med Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, Sverige). NK-celler ble isolert ved bruk av NK Cell Isolation Kit (MiltenyiBiotec, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Renheten av CD3
-CD56
+ celler ble konsekvent over 95%, målt gjennom flowcytometrisk analyse.
RNA interferens
Vi transient transfektert med siRNA mot humant galectin-9 (siRNA # 378 og siRNA # 690, GenePharma, Shanghai, Kina) eller rykke siRNA inn i HT-29 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Knockdown Effektiviteten av sirnas målrettet mot galectin-9 ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR, western blot analyse og ELISA ved 36 timer etter transfeksjon. Følgende siRNA sekvenser rettet mot menneske galectin-9 ble brukt:
siRNA378: forstand, 5′-GGAAGACACACAUGCCUUUTT-3 «; antisense, 5»-AAAGGCAUGUGUGUCUUCCTT-3 «; og siRNA 690: forstand, 5»-CCAUUACCCAGACAGUCAUTT-3 «; antisense, 5»-AUGACUGUCUGGGUAAUGGTT-3 «.
Migrasjon analysen
Vi brukte Transwell kamre med en 5-mm pore membran (Costar, Corning, NY, USA). NK-92-celler eller primære NK-celler ble sådd ut i de øverste kamre. Kolon tumorcellekulturoverstående eller i varierende konsentrasjoner av rh-galectin-9 (2045-GA-050, R 0,001, figur 1D).
Galectin-9 uttrykk i kolon svulsten og para-tumor vevsprøver ble påvist ved anvendelse av immunohistokjemi ved hjelp av en isotypekontroll (A) eller et anti-galectin-9-antistoff (B). (C), representant galectin-9
høy (til venstre) og galectin-9
lav (til høyre) uttrykk i tumor og para-tumorvev. (D), Grafisk illustrasjon av den statistiske fordelingen av galectin-9 ekspresjonsnivåer på 38 tykktarmskreft vev og deres tilsvarende normale slimhinneprøver. Uttrykket intensitet var representert som en histologisk score (Σpi), hvor p er prosentandelen av galectin-9 positive cancerceller (som mottok 1, 1-10%, 2, 11-50%, 3, 51-80%; eller 4, 81-100%) og jeg representerer den fargeintensitet (scoret som 0, ingen farging, 1, svak farging, 2, moderat farging, eller tre, sterk farging). Strong (++++), moderat (+++), mild (++), svak (+) og negative (-) flekker var 10-12, 7-9, 4-6, 1-3 og 0, henholdsvis.
Galectin-9 uttrykk og kliniske resultater i kolon kreftpasienter
Vi har utforsket den prognostiske verdien av galectin-9 i tykktarmskreft. Totalt 90 tykktarmskrefttilfeller og deres knytte kliniske og overlevelse informasjon ble analysert for å bestemme rollen til galectin-9 uttrykk. Basert på medianen av de observerte nivåer av galectin-9 ble kolon kreftpasienter delt inn i lav (0-1, n = 39) og høy (2-4, n = 51) uttrykker grupper. Signifikante forskjeller ble funnet i galectin-9 uttrykk ble ifølge TNM stadium, lymfeknutemetastase, og histologisk grad, men ikke kjønn, alder, ordistant metastase (tabell 3).
Univariat analyse av clinicopathological faktorer indikerte at tidlig TNM trinn (I /II), og ingen lymfeknutemetastase (N) var signifikant assosiert med gode resultater (P = 0.001and P = 0,001, henholdsvis). Spesielt ble høy galectin-9 uttrykk signifikant assosiert med god overlevelse (hazard ratio (HR): 0,483; 95% konfidensintervall (CI): 0,269 til 0,867; P = 0,015) (tabell 4). Median overlevelse ganger hos pasienter med galectin-9
høy og galectin-9
lav var 87 og 34 måneder, henholdsvis. Overlevelseskurven er vist i figur 2A (log-rank-test, p = 0,012). Resultatene av Kaplan-Meier-analysen var i overensstemmelse med den univariate analyse (Fig 2B og 2C). I tillegg total overlevelse var bedre hos pasienter med godt til moderat differensiering var bedre enn i dårlig differensierte tilfeller, men denne foreningen nådde ikke signifikans (fig 2D, P = 0,051).
Kaplan-Meier-kurver vises for å beskrive forholdet mellom galectin-9 ekspresjon og total overlevelse (A), lymfeknutemetastase og total overlevelse (B), TNM scene og total overlevelse (C), og histologiske differensiering og total overlevelse (D). Testprøve (n = 90). Galectin-9
høy uttrykk, ble ingen lymfeknutemetastase og TNM stadium (I /II) funnet å forutsi lengre overlevelsestid (P 0,05, log-rank test)
Videre er de uavhengige parametre som ble funnet å være av betydning i den univariate analyser, deriblant TNM scene og galectin-9 ekspresjon, ble deretter benyttet i en annen multivariat analyse. Resultatene antydet at galectin-9 uttrykk i tykktarm tumorvev (HR: 0,549, 95% KI: 0,303 til 0,995, P = 0,048) og TMN scenen (HR: 2,371, 95% KI: 1,306 til 4,304, p = 0,005) var uavhengige prognostiske markører, viser at galectin-9-ekspresjon i tykktarmen tumorvev er en positiv prognostisk faktor for total overlevelse (tabell 4).
Forholdet mellom tettheten av CD56
+ NK-celler og galectin-9 uttrykk i CRC tumorceller
Vi neste undersøkt infiltrasjon av CD56
+ NK-celler i tykktarm kreft vev og sin tilknytning til galectin-9 uttrykk. CD56
+ celler ble oppdaget i løpet av tykktarmskreft celle reir, kolon kjertler og stroma (fig 3A). Median antall CD56
+ celler var 0,3 (spredning: 0,0 ~ 26,6) per enkelt høyeffekts feltet (HPF) i tykktarmen svulstvev og 16.25 (område: 0,0 til 42,4). I para-tumorvev
(A), ble CD56-ekspresjon detektert i tykktarm tumor og prøvene para-tumorvev (38 tilfeller) ved hjelp av immunhistokjemi med et anti-CD56-antistoff eller et isotype-kontroll. Pilen viser NK-celler; Panelene viser antall CD56
+ NK-celler som ble observert i alle mikroskopiske felt i tumor og para-tumorvev. (B), Representant bilder fra tumorer uttrykker høye eller lave mengder galectin-9 (øverst) og CD56 (nedenfor) på samme sted. (C), Paneler som viser antall CD56
+ NK-celler som ble observert i alle mikroskopiske felt i galectin-9
høy eller galectin-9
lave vevsprøver. (D), Korrelasjonen mellom galectin-9 og CD56 uttrykk i vevsprøver.
Da vi analyse av kliniske betydningen av NK-celler i 38 tykktarmskreftpasienter. Basert på medianen av den NK-celler infiltrasjon, ble kolon tumor pasientene delt i negative og positive grupper. Signifikante forskjeller ble funnet i NK-celler infiltrasjon i henhold til TNM stadium (tabell 5).
Hvor mye CD56
+ celleinfiltrasjon var signifikant høyere i para-tumorvev enn i tumorvev (P range 0 til 42,4 vs. 0-0,8; P 0,0001) (fig 3B og 3C). Galectin-9 uttrykk var signifikant korrelert med CD56
+ NK celleinfiltrasjon i tykktarm kreft og para-tumorprøver (P 0,0001, R
2 = 0,658, fig 3D)
Galectin-ni økt chemotaxis i humane NK-celler
resultatene ovenfor tyder på en sammenheng mellom galectin-9 uttrykk og NK celleinfiltrasjon i tykktarm kreft vev. Virkningene av galectin-9 på NK-celler ble undersøkt ved in vitro. Vi først undersøkt om sekresjon av galectin-9 fra tumorcellene hadde en kjemotaktisk effekt på migrasjon i NK-celler. I disse eksperimentene, bestemt vi nivået av galectin-9 uttrykk i 3 tykktarm kreft cellelinjer, inkludert SW480, SW620 og HT29, ved hjelp QRT-PCR og Western blot analyse. Resultatene viste at HT29-celler hadde den høyeste galectin-9 ekspresjonsnivået blant disse 3 cellelinjer (figur 4A og 4B), og disse celler ble derfor valgt for den følgende test. Vi har utformet siRNA å slå ned galectin-9 uttrykk i HT29 celler. Som vist i figur 4C-4E, galectin-9-mRNA og proteinnivåer og konsentrasjonen av galectin-9 i kultursupernatanten ble signifikant redusert ved to forskjellige siRNA sekvenser, siRNA # 378 og # 690 siRNA. Interessant, HT-29 kultursupernatantene induserte signifikant forbedrede kjemotaksen i NK-92 celler, som er CD56
+ humane NK-celler [19]. Disse virkning av HT-29-supernatantene for NK-92 kjemotakse var signifikant reversert ved tilsetning av galectin-9 sirnas # 378 og # 690 grupper (figur 4F) .og ved hjelp av en annen colon carcinoma cellelinje SW620, gjennomgående har vi funnet at galectin-9 utskilt fra SW620 hadde også en kjemotaktisk effekt på NK-92 celler migrasjon (S1 figur).
Galectin-9 uttrykk ble undersøkt i tykktarm tumorcellelinjer (HT29, SW480, og SW620) ved hjelp qRT- PCR (A) og western blot analyse (B). HT29-celler ble delt inn i 5 grupper: en kontrollgruppe (dyrket med bare medium), en lipo gruppe (behandlet med Lipofectamine 2000), en NC gruppe (transfektert med den negative controlsiRNA), en galectin-9-siRNA (# 378) -gruppe og en galectin-9-siRNA (# 690) gruppe. Knockdown efficacies sirnas rettet mot galectin-9 ble undersøkt ved hjelp av QRT-PCR (C) og western blot analyse (D). * P 0,05 vs. kontroll. (E), Galectin-9 sekresjon nivåene ble målt i forskjellige grupper som bruker galectin-9 ELISA kits. Alle resultater er vist som middelverdien og SEM av kvadruplikat eksperimenter * P .. 0,05 vs. kontroll (F), Chemotaxis av NK-92-celler som respons på HT29-supernatanter ble behandlet med galectin-9 siRNA; * P 0,05 vs. kontroll, og # P 0,05 vs. NC. Vi analyserte kjemotakse i NK-92 cellene i respons til varierende konsentrasjoner av galectin-9 (G). En migrasjonsindeks (MI) ble brukt til å ta hensyn til det høye antallet tilfeldig migrasjon som skjedde i NK-celler. IL-12 ble anvendt som en positiv kontroll for å initiere chemotaxis i NK-92-celler. * P 0,05 vs. kontroll, ** P 0,001 vs. kontroll. Representative data vises fra minst 3 forsøk.
Neste, vi undersøkt om galectin-9 er en kjemotiltrekkende for NK-celler. I disse forsøk ble forskjellige doser av rh-galectin-9 analysert for å bestemme galectin-9 er kjemotaktisk effekt på NK-92-celler. Resultatene viste at 25 og 50 ng /ml rh-galectin-9 induserte kjemotaksen i NK-92-celler, men at forskjellen var ikke signifikant. Ved en konsentrasjon på 100 ng /ml NK-92 cellemigrering ble spesielt øket over transwell membranen med omtrent to ganger (P 0,001, sammenlignet med kontrollen, figur 4G)
Galectin-9 fremmer. F-aktin rearrangementer i NK-celler ved å forbedre Rho familie ekspresjon på NK-celler
Lymfocytter gjennomgå dramatiske cytoskeletal rearrangementer i løpet av celle migration.The liten GTPase Rho er en sentral regulator av aktin cytoskjelettet, og Rho-kinase, som også er kjent som Rho-assosiert kveilet spiral kinase (ROCK), er en Rho effektor protein. For å vurdere den medvirkning av Rho /ROCK i trans av NK-celler, ble chemotaxis analyser utføres i nærvær av godt karakterisert ROCK-inhibitor, Y27632, og en annen Rho-spesifikke inhibitor, C3-transferase. Resultatene viste at Y27632 og C3 transferase betydelig hemmet NK-92 celle migrasjon (Fig 5A).
(A), Chemotaxis ble hemmet av Rho og rock-hemmere i NK-92 celler. NK-92-celler ble stimulert ved hjelp av medium alene i 4 timer eller medium inneholdende Y27632 (20 uM) eller C3-transferase (2 ug /ml) i 1,5 timer. En migrasjonsindeks (MI) ble brukt til å ta høyde for den høye tilfeldig migrasjon som ble observert i NK-celler. * P 0,05 vs. kontroll. (B) Ekspresjon av RhoA, RHOB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ og RhoT1 mRNA ved hjelp av RT-PCR i NK-92-celler som ble inkubert i nærvær eller fravær av rh-galectin-9 med en konsentrasjon på 100 ng /ml i 4 timer; * P 0,05 vs. kontroll. (C) Ekspresjon av ROCK1 protein i NK-92-celler som ble inkubert i nærvær eller fravær av rh-galectin-9 ved en konsentrasjon på 100 ng /ml i 24 timer. (D), Representative mikrografer av NK-92-celler som ble inkubert i nærvær eller fravær av rh-galectin-9 ved en konsentrasjon på 100 ng /ml i 4 timer. F-aktin ble beiset med rhodamin-merkede phalloidin (rød), og cellekjerner ble merket med DAPI (blå) (630 x). Representative data vises fra minst 3 forsøk.
Resultatene ovenfor viser at galectin-9 regulerer NK celle migrasjon. Derfor vi neste undersøkte effekten av rh-galectin-9 på Rho familierelaterte molekyler i NK-celler. Resultatene viste at rh-galectin-9 signifikant økt ekspresjon av flere medlemmer av Rho familien, herunder RhoA, RHOB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, og RhoT1 (figur 5B). Som vist i figur 5C, ROCK1 protein nivåer var signifikant oppregulert i NK-celler som var stimulert med rh-galectin-9 i 24 h.These resultater antydet at galectin-9 regulerer en rekke Rho familie molekyler i NK-celler.
Vi neste undersøkt om galectin-9 påvirker rearrangements i F-aktin cytoskjelettet i NK-92 celler. NK-92-celler ble behandlet med rh-galectin-9 ved en konsentrasjon på 100 ng /ml i 4 timer, og endringer i F-aktin polymerisasjon i NK-92-celler ble deretter undersøkt. I kontrollgruppen, F-aktin i NK-92-celler dannet et tydelig phalloidin farget ring rundt cellemembranen. Etter behandling med rh-galectin-9, ble F-aktin aggregert i den ene ende av cellen, som vist i figur 5D.
Galectin-9 forbedrer primære NK-celle kjemotakse
For for ytterligere å validere våre resultater, utfører vi de viktigste forsøk med primær NK-celler. Resultatene viser at migreringen av primære NK-celler kan være påvirket av både galectin-9 utskilt av HT29 (figur 6A) eller rh-galectin-9 (figur 6B). Rho og ROCK hemmere hemmer kjemotakse av primær NK celle (Fig 6C). I tillegg, rh-galectin-9 også øke ekspresjonen av Rho familien (figur 6D) og ROCK1 (figur 6E).
Chemotaxis av primære NK-celler som respons på HT29-supernatanter ble behandlet med galectin-9 siRNA (A ) eller varierende konsentrasjoner av galectin-9 (B). En migrasjonsindeks (MI) ble brukt til å ta hensyn til det høye antallet tilfeldig migrasjon som oppstod i grunnskolen NK-celler. IL-12 ble anvendt som en positiv kontroll for å initiere kjemotaksi primære NK-celler. * P 0,05 vs. kontroll. Og # P 0,05 vs. NC. (C), Chemotaxis ble hemmet av Rho og ROCK hemmere primære NK-celler. Primær NK-celler ble stimulert ved hjelp av medium alene i 4 timer eller medium inneholdende Y27632 (20 uM) eller C3-transferase (2 ug /ml) i 1,5 timer. * P 0,05 vs. kontroll. (D), Ekspresjonen av RhoA, RHOB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ og RhoT1 mRNA ved hjelp av RT-PCR i primær NK-celler som ble inkubert i nærvær eller fravær av rhGalectin-9 ved en konsentrasjon på 100 ng /ml i 4 timer; * P 0,05 vs. kontroll. (E), ekspresjon av ROCK1 protein i primær NK-celler som ble inkubert i nærvær eller fravær av rhGalectin-9 ved en konsentrasjon på 100 ng /ml i 24 timer. Representative data vises fra minst 3 forsøk.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at galectin-9 uttrykk er lavere i tykktarm svulstvev enn i tilsvarende normalt vev og galectin-9 nivåer er assosiert med NK-celleinfiltrasjon og pasientens overlevelse. In vitro studier viste at galectin-ni økt NK celle rekruttering ved å utøve effekter på Rho /ROCK1 uttrykk og F-aktin polarisering. Vi har derfor identifisert en ny mekanisme som galectin-9 påvirkninger NK celle rekrutterings under tykktarmskreftutvikling, og dette øker vår nåværende kunnskap om molekylære involvering av galectin-9 i tumor immunitet.
Galectin-9 har vært observert å bli nedregulert i ulike krefttyper, for eksempel melanom [16], livmorhals plateepitelkreft [23], brystkreft [24] og leverkreft [25], og det tjener potensielt som en klinisk signifikant biomarkør for å forutsi utfall hos disse pasientene. Men lite er kjent om detaljene knyttet til uttrykk for galectin-9 i tykktarm kreft vev. Våre resultater viser at selv om de fleste av tykktarmskreft-celler uttrykker galectin-9, både positive hastighet og nivået av ekspresjon er lavere i disse vevene enn i normalt vev kolon. I tumorer er høyere galectin-9 uttrykk forbundet med tidlig TNM stadium, ingen lymfeknutemetastase, god histologisk differensiering, og lengre total overlevelse ganger. Viktigere, disse resultatene tyder på at dette protein kan være et lovende biomarkør for overlevelsen hos pasienter med colontumorer.
Virkningene av galectin-9 i svulster er komplekset som er innblandet i flere aspekter, inkludert tumor celleadhesjon [15] , apoptose og cellesyklus [16], migrasjon [26], og angiogenese [27]. Videre har det blitt rapportert at galectin-9 utøves immun roller i svulstens mikromiljø. Resultatene viste at galectin-9 indusert makrofager til å differensiere i plasmacytoid dendrittiske cellen lignende makrofager [14, 28], som økte Tim-3
+ dendrittiske celler og CD8
+ T-celler [29].
