Abstract
Bemerkelsesverdig begrenset informasjon er tilgjengelig om biologiske mekanismer som bestemmer sykdom enhet av metastatisk kolorektal kreft i leveren (CRCLM) med ingen gode kliniske parametre å estimere prognose. For de siste årene, forstå forholdet mellom tumor egenskaper og lokale immunrespons har fått økende oppmerksomhet. Gitt det mangefasetterte rollene til B-celle-drevet svar, rettet vi å belyse den immunologiske avtrykk av B-lymfocytter ved metastatisk stedet, sammenhengen med makrofager, og deres prognostiske relevans. Her presenterer vi ny algoritme tillater å vurdere en kobling mellom det lokale pasientspesifikke immunologiske kapasitet og klinisk utfall. Den mikroskopi-basert bildebehandling plattformen ble brukt til automatisk skanning av store vevssnitt og påfølgende kvalitative og kvantitative analyser av immuncelle subtyper bruker avstamning markører og encellede anerkjennelse strategi. Resultatene tyder på massiv infiltrasjon av CD45-positive leukocytter begrenset til metastatisk grensen. Vi rapporterer for første gang akkumuleringen av CD20-positive B-lymfocytter ved tumor – leveren grensesnitt som omfatter hovedpopulasjonen innenfor de store CD45-positive aggregater. Påfallende, funksjonelt aktiv, aktivisering-indusert cytidindeaminase (AID) -positive ektopiske lymfoide strukturer ble funnet å være samlet innenfor metastatisk margin. Videre CD20-baserte datasett viste en sterk prognostisk strøm: pasienter med høyt CD20-innhold og /eller ektopiske follikler hadde signifikant lavere risiko for tilbakefall av sykdommen som avsløres ved univariat analyse (p 0,001 for begge), og i modeller justert for clinicopathological variabler (p 0,001 og p = 0,01, henholdsvis), og viste forlenget total overlevelse. I kontrast, gjorde CD68 flekker-avledet datasett ikke vist noen assosiasjon med klinisk utfall. Tatt sammen, innstille vi størrelsen av B-lymfocytter, inkludert de som er organisert i ektopiske follikler, som ny prognostisk markør som er overlegen i forhold til clinicopathological parametere. Funn heve anti-tumor rollen som B-celle-drevet mekanisme (r), og dermed indikere en ny måte å tenke på mulige behandlingsstrategier for CRCLM pasienter
Citation. Meshcheryakova A, Tamandl D, Bajna E, Stift J , Mittlboeck M, Svoboda M, et al. (2014) B-celler og Ektopiske Follikulære Strukturer: Novel Spillere i anti-tumor Programmering med Prognostic Strøm for pasienter med metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE 9 (6): e99008. doi: 10,1371 /journal.pone.0099008
Redaktør: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Frankrike
mottatt: 29 januar 2014; Godkjent: 09.05.2014; Publisert: 06.06.2014
Copyright: © 2014 Meshcheryakova et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Den østerrikske Science Fund (FWF; https://www.fwf.ac.at/) prosjekter P22441-B13 og P23228-B19 til DM. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastatisk kolorektalcancer er fortsatt en terapeutisk utfordring til tross for de siste forbedringene i systemisk behandling inkludert utviklingen i cytotoksiske og målrettede midler [1], [2] og tverrfaglig ledelse. Bemerkelsesverdig begrenset informasjon er tilgjengelig om biologiske mekanismer som bestemmer prognosen for denne sykdommen, og kan anses som startpunkter for nye terapeutiske intervensjoner. Videre er det ingen kliniske parametere som er tilgjengelige for å estimere overlevelse prognosen for pasienter etter leverreseksjon. Men det er bevis for å vurdere kolorektal kreft levermetastaser (CRCLM) som en immunogen krefttype siden økt tetthet av T-lymfocytter i den metastaserende margin med anti-tumoral T-celle-effektorer-drivmekanismene ble vist å være prognostisk viktig [3].
det er generelt akseptert at solide tumorer representerer et eksempel på vev der immunceller, enten bosatt eller infiltrere, kan bli abnormt aktivert og dermed påvirke den kliniske sykdomsforløp [4], [5]. Imidlertid kan solide svulster av ulik opprinnelse varierer betydelig i leukocytter komposisjon. Gitt bidrag fra begge typer immunceller – cytotoksiske T-lymfocytter (CTL), T helper (Th) celler, regulatoriske T (treg) celler, NK-celler, dansk sokkel, monocytter /makro avstamning celler og B-celle undergrupper – den vevs- spesifikke mekanismer for hver respektive tumortype bindings pasient-spesifikke immunologiske kapasitet og det kliniske resultatet kunne bli vurdert. For å beskrive beste av krefttype-tilskrives og pasient-orientert heterogenitet i størrelse og /eller type av infiltrerende immunceller og deres fordelingsmønstre inne i svulsten, så vel som den påfølgende trinnvis hendelser for å generere tumor medfølgende immunrespons, en ny terminologi var integrert slik som
immun landskapet
,
immun contexture, den Immunoscore, den immunome
, og
kreft-immunitet syklus product: [4], [6] – [8 ]. På den ene side er solide tumorer generelt kjennetegnet som immunosuppressive basert på flere nettverks mekanismer, inkludert aktivering av immundempende trasé og signaler, induksjon av toleranse overfor tumorantigener og rekruttering av immunosuppressive celler slik som treg celler, myeloidceller-avledede suppressor celler og tumor- tilhørende makrofager (TAM) [9] – [11]. På den annen side, studier som fokuserer på T-celler foreslått en sterk anti-tumor potensialet av CD8-positive CTL hos pasienter med forskjellige typer kreft [12]. Verdt å merke seg, er det sterk positiv sammenheng mellom tetthet av infiltrater med cytotoksiske og minne T-celle fenotyper og langvarig pasient overlevelse med primær og metastatisk kolorektalcancer [3], [13] -. [16]
Mindre er kjent om den funksjonelle rolle av tumor /stroma infiltrerende B-celler vedrørende mekanismene bak pro- versus anti-tumor programmering av neoplastiske vev. Variasjonen av B-celle-medierte handlinger omfatter antigen-avhengig T-celle-priming, maskineriet for generering av immunoglobuliner, sekresjon av cytokiner og kjemokiner som medierer (fremmer eller inhiberer) celledifferensiering og inflammasjon [17] og dermed bidra til sykdoms patogenesen via antistoffavhengig og-Uavhengig mekanismer [18] – [22]
Ekstra relativt nytt aspekt bindings B-cellebiologi og inflammasjon er basert på oppdagelsen av germinalsenter (GC) -lignende strukturer utenfor sekundær. lymfoide organer. Faktisk har mange undersøkelser vist at det eksisterer ektopiske follikulære strukturer (også kalt tertiære lymfoide strukturer) på steder av kronisk betennelse i forskjellige vev, noe som antyder klasse svitsjing av immunglobuliner og somatiske hypermutation arrangementer for å finne sted lokalt under kontroll av aktiverings-indusert cytidindeaminase (AID) ([23] – [26], anmeldt i [13], [27], [28]). Viktigere, bortsett fra godartede vev med kroniske inflammatoriske prosesser, ektopiske follikulære strukturer har blitt rapportert i noen typer solide tumorer. Tilstedeværelsen av tertiære lymfoide strukturer ble undersøkt i ikke-små-celle lungekreftpasienter og funnet å være assosiert med gunstig klinisk resultat; enten tetthet av modne DC [29] eller, i tillegg, densitet på follikulære B-celler [30] ble brukt til å vurdere den prognostiske virkning av tertiære lymfoide strukturer. Ektopiske follikulære strukturer ble også påvist i pasienter med infiltrerende ductal karsinom i bryst, noe som tyder på en
in situ
antigen-drevne B-celle respons på en rekke tumor- og bryst-assosierte antigener [31]. Når det gjelder primær kolorektal kreft (CRC), i en pilotstudie, ble ektopiske follikulære strukturer spådd av immun genet rekke profilering og bekreftet av farging [32].
Gitt bevis som støtter den potensielle bidrag tumor infiltrerer B celler til sykdommen patogenesen, progresjon og /eller sykdom oppløsning, rettet vi å undersøke B-celle-drevet immun kontroll hos en pasient kohort med kolorektal kreft levermetastaser (CRCLM). Likevel, er et generelt svakt punkt for evaluering tilstedeværelse og prognostisk effekt av fastboende og /eller infiltrerende immunceller på tvers av de store pasientprøve med CRCLM (eller annen type kompleks ondartet vev) kravet for kvantifisering algoritmer. Faktisk, har behovet for automatisert, reproduserbar kvantifisering av immuncellepopulasjoner basert på histologiske evalueringer blitt understreket av det vitenskapelige samfunn innen translasjonell forskningsområdet og enkelte algoritmer har blitt beskrevet [33] – [35]. Den mest vellykkede eksempel på immun scoring Vurderingen er basert på forholdet mellom T-celle undergrupper (CD 3
+, CD8
+, CD45RO
+, og granzyme B
+) hos pasienter med primær kolorektal kreft. Immunoscore ble foreslått som en prognostisk markør for å bli brukt i rutinetesting [36], [37]; å fremme den globale bruken av Immunoscore Arbeidsgruppen ble startet blant 22 internasjonale ekspertsentre [38].
I denne studien har vi brukt en automatisert TissueFAXS basert mikros system og et nyetablert algoritme for deteksjon og kvantifisering av immuncellepopulasjoner over en storstilt eksemplar av CRCLM. Gitt det mangefasetterte rollene til B-celle-drevne responser spesielt på steder med kronisk betennelse, rettet vi å belyse pasientspesifikke avtrykk av B-lymfocytter ved metastatisk grensen med særlig fokus tilskrives fenomenet ektopisk hårsekken formasjon, samtrafikk mellom B-celler og infiltrere /bosatt makrofager, og vurdering av deres prognostisk effekt.
Materiale og metode
Etikk uttalelse
studien ble godkjent av etikkomiteen ved Medical University of Vienna (EK-Nr. 1277/2012). Den informert samtykke ble frafalt av Institutional Review Board grunn av retrospektiv karakter av studien.
Profilen til studiepasienter
Et panel av parafin-embedded prøver av pasienter med CRCLM ble hentet retrospektivt fra 65 pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Kirurgisk avdeling, Medical University of Vienna. Første gruppen består av 14 pasienter som hadde en leverreseksjon mellom 2001 og 2007, hadde metachronous presentasjon av metastatisk sykdom (ingen metastaser når den primære svulsten ble diagnostisert) og gjennomgikk reseksjon uten preoperativ kjemoterapi (panel I). Median oppfølgingstid for denne gruppen var 50,2 måneder (95% KI: 33.6-66.8 måneder). Denne kohorten av pasienter tillatt oss å vurdere immunologiske forlaget i behandlingsnaive prøver. Andre gruppen (panel II, n = 51) tatt med tilfeldig utvalgte pasienter som fikk kjemoterapi før leverreseksjon; inkludering dato var mellom 2006 og 2009; Median oppfølgingstid var 32,2 måneder (95% KI: 24.4-40.0 måneder). Som et resultat av tilfeldig utvalg, panel II inkluderte de pasienter som hadde fluorpyrimidin-baserte cytotoksisk kjemoterapi i kombinasjon med oxaliplatin (46 pasienter) eller med irinotecan (5 pasienter). I tillegg fikk alle pasienter bevacizumab som den foretrukne diett ved vår institusjon i løpet av denne tidsperioden. Pasientene fikk sin siste cellegiftbehandling 21 dager før operasjonen; den siste bevacizumab ble gitt opp til 5 uker før operasjonen. Innenfor panel II, ble 19 av 51 prøver undersøkt for CD45, mens alle 51 prøver ble evaluert for B-celle og makro linjene. For pasienter med mer enn en metastase, utvalg av de mest aktuelle metastase til farging var på offentliggjøring av patologen; typisk de samme vevsprøve som ble anvendt for diagnostisk prosedyre og terapi ingsovervåkning ble inkludert i studien. Clinicopathological kjennetegn ved pasientene er oppsummert i tabell 1: demografiske data, patologisk iscenesettelse av TNM klassifiseringssystemet, antall og størrelse på levermetastaser, vitalitet av levermetastaser (for panel II), sykdomsfritt intervall, og data om postoperativ kjemoterapi er gitt. Både dato for tilbakefall og enten dødsdato eller dato sist sett ble registrert. Total overlevelse (OS) ble definert som tidsintervallet mellom diagnose og kreft-relaterte dødsfall (med 22 dokumenterte tilfeller av kreft-relaterte dødsfall); gjentakelse overlevelse (RFS) som tiden mellom diagnostisering av metastaser og sykdomsutvikling som anslått av tilbakefall av metastaser eller noen form for svulst (med 46 dokumenterte tilfeller av tilbakefall av sykdommen). Sykdomsfrie intervall (DFI) ble definert som tiden mellom påvisning av primær kolorektal kreft og levermetastaser hos pasienter med metachronous utvikling av metastatisk sykdom. Vitality av levermetastaser ble vurdert som beskrevet [39].
farging på parafininnstøpte vevssnitt og farging evaluering
parafininnstøpte 4 mikrometer tykke seksjoner gikk rutine farging med hematoksylin og eosin. Deler av CRCLM prøver ble tatt for CD45, CD20, AID, IgM, CD138, og CD68. For å detektere CD45, et felles leukocytt antigen, kanin klonale antistoff, klon E19-G (DB Biotech, Kosice, SR) ble anvendt. CD20 (mus monoklonalt antistoff, klone L26, fra Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK eller kanin klonal antistoff, klon E17-P, fra DB Biotech, Kosice, SR) ble brukt som generell B-cellemarkør. For å oppdage AID, klone ZA001 mus IgG1-kappa (Invitrogen, Paisley, UK) ble brukt. Anti-AID antistoffer ble tidligere vist å være funksjonelle i farging av Raji, lymfoblastoide celler avledet fra en Burkitt lymfom, og AID-positive celler i parafininnstøpte vevssnitt inkludert mandlene og nesepolypper 24,40,41. For å detektere IgM, ble et kanin-polyklonalt antistoff anvendt (acris, Herford, Tyskland). For å oppdage CD68, monocytter /makrofager avstamning markør, mus monoklonalt antistoff, klone KP1 (Thermo Scientific, Cheshire WA7 1PR, UK) ble brukt. For immunhistokjemi metoden ble DAKO EnVision +, peroxydasesystemet (DAKO, Glostrup, Danmark) påføres etter den første antistoff. Seksjoner ble kontra med haematoxylin for atom visualisering. En fluoriserende farging med anti-mus og anti-kanin-Ig sekundære antistoffer konjugert til Alexa lateks, 488 og 568 (Invitrogen, Paisley, UK) ble anvendt for CD45-farging, så vel som for dobbelt farging (CD20 og CD68). Nuclear kontra i dette tilfellet ble utført med DAPI (Roche, Mannheim, Tyskland). TissueFAXS (TissueGnostics, Wien, Østerrike), et helautomatisk mikroskopi-basert vev analysesystem ble brukt til kjøp av syke prøve vev og kvantitativ analyse. Den TissueFAXS teknologi lov til å automatisk skanne store vevssnitt i fluorescens eller lyse felt modus, i stand til å visualisere tissuestrukturer fulgt av identifikasjon av de enkelte cellene i det komplekse innfødte vev miljø og kvantitativ analyse av positivt fargede celler [24], [42], [43]. Således, denne tilnærmingen gitt mikroskopiske bilder av hele metastatiske vev seksjoner. Hver prøve ble komponert fra 100 eller flere individuelle synsfelt. Som representativt eksempel, ble et område på 400 mm
2 av vevsprøve vanligvis ervervet for oppfølging analyser. For oppkjøpet 20x /0.5 objektiv ble brukt (EF Plan_NeoFluar, Zeiss). Filter sett var fra Chroma TechnologyCorp (DAPI 350/460 nm; FITC /Cy2 470/525 nm; TxRed /Cy5 620/700 nm). Kvantitativ analyse av infiltrere immunceller ble utført ved hjelp TissueQuest eller HistoQuest programvare (TissueGnostics, Wien, Østerrike) for immunfluorescens og for immunhistokjemisk farging, henholdsvis. Evalueringen av fargede immunceller ble utført uten kjennskap til de kliniske parametere for hver pasient. For å bestemme den prognostiske relevans, ble ektopiske follikler definert ved (i) karakteristisk kompakte, runde lymfoid aggregat morfologi med (ii) en minimal diameter på 20 celler, og (iii) tilstedeværelse av CD20-positive B-celler. Således ble alle lymfoide aggregater som oppfyller disse kriteriene, uavhengig av deres aktiveringsstatusen inkludert i prognostisk markør. Ektopiske follikulære strukturer ble beregnet på grunnlag av komparativ analyse av CD45 og CD20 fargemønstre for hver enkelt prøve ved tre uavhengige observatører med sterk ekspertise i mikroskopi. Alle individuelle flekker-avledede variabler på tvers av de spesifiserte områdene ble benyttet for korrelasjon med clinicophathological parametre. For noen flekker baserte variabler noen prøver ble ekskludert fra kvantifisering analyse basert på vev kvalitet og /eller bakgrunnsfarging; for de tilfeller det nøyaktige antall eksemplarer er angitt i figuren legender.
Statistisk analyse
Når det gjelder styrkeberegning, under forutsetning av en tosidig signifikansnivå en hasardratio på 3,0 kan oppdages med en effekt på 90% dersom 35 hendelser er observert i prøven. Kategoriske data ble beskrevet av absolutte og relative frekvenser. Gruppeforskjeller ble testet av chi-squared test eller chi-squared trend test for ordinale variabler. Ved sparsomme data eksakte tester ble anvendt. Kontinuerlige data ble beskrevet med median, minimum og maksimum. Gruppeforskjeller ble vurdert av Wilcoxon rang sum test eller ved t-test ved normalfordeling (normalfordeling ble oppnådd etter logaritmisk transformasjon). En analyse av variansen ble brukt til å sammenligne de tre regionene (kant, portal felt, fjern lever) i pasienter. En Tukey justering ble gjort for flere parvise sammenligninger. Korrelasjoner koeffisienter ble beregnet ved Spearman korrelasjon for ordinale variabler og Pearsons korrelasjon for log2 transformerte kontinuerlige variabler. OS og RFS ble vist av Kaplan-Meier grafer og gruppeforskjeller ble testet ved hjelp av log-rank test. For ordens variabler ble brukt en log-rank test med en trend effekt. I tillegg ble hazard ratio og tilsvarende 95% konfidensintervall estimert ved Cox regresjonsmodeller. Farging-avledet verdiene ble log2 forvandlet for Cox regresjonsmodeller for å oppnå tilnærmet normalfordeling. Interaksjoner mellom de to paneler og fargingsbaserte variabler ble beregnet. I tilfelle av ikke-signifikant interaksjon eller hvis begge effekter for de to panelene direkte i den samme retning, er en lagdelt Cox regresjonsmodell som brukes når panel I og II-data analyseres i kombinasjon. Multivariat Cox regresjonsmodeller ble brukt til å justere prognostiske effekten av fargebaserte variabler til klinisk parameter (er) funnet å være signifikant i univariate Cox regresjon. Statistiske analyser ble gjort ved hjelp av SPSS programvareversjon 20 (IBM Corporation, Armonk, New York, USA); alle p-verdiene gitt som tosidig og p≤0.05 ble betraktet som statistisk signifikant.
Resultater
Algoritme for karakterisering og kvantitativ analyse av fastboende og infiltrere immun celle populasjoner innen CRCLM vevsprøver
for å analysere og kvantifisere tilstedeværelsen av fastboende og infiltrerende immunceller i CRCLM vev vi etablert en algoritme bruker TissueFAXS system. For prøven sin sammenligning vi brukt uniform strategi ved å gjøre sub-regioner på svulsten – lever grensen (ca. 0,5 x 0,5 mm på hver side av grensen med en gjennomsnittlig størrelse på ca 30 mm
2) og i leveren vev rundt portal vene områder (fem representative områder dimensjonert til 0,25 mm
2) og områder i leveren vev fjernt til portalen årer navngitt som fjernt lever i oppfølgingen beskrivelser (tre representative områder dimensjonert til 0,25 mm
2) ( et representativt bilde er vist på figur 1, A). Studiedesign er oppsummert av flytskjemaet i figur 1, ble B. parafininnstøpte delene først farget med anti-CD45 antistoff til å oppdage alle klasser av fastboende og /eller infiltrerende immunceller på tvers av pasientprøve. Neste, angi immun celle populasjoner vi diskriminert mellom B-celle avstamning og monocytt /makrofag avstamning (figur 1, B). Kvantitativ analyse ved hjelp av TissueQuest /HistoQuest programvare ble anvendt for å bestemme mengden av CD45-positive, CD20-positive, og CD68-positive celler innenfor den ovenfor angitte steder av interesse. Kalkuleringsalgoritmen er beskrevet i figur S1. For å bestemme den kliniske relevansen av pasient-spesifikk immunrespons på stedet av metastaser, ble flekker-avledet datasett som brukes til justering med clinicopathological parametre.
(A) Definisjon av regioner av interesse innenfor CRCLM vevsprøver for å forene kvantifisering strategi mellom prøvene. Ved kjøp av en storstilt prøven ved hjelp av mikroskopi-basert TissueFAXS system ble regioner av interesse definert ved tumor – lever grensen (angitt med en
rød
linje), innenfor levervev rundt portvenen områder (angitt med stiplede torgene i
grønn
) og områder i leveren vev fjernt til portalen årer (angitt med stiplede firkanter i
blå
). Av notatet, her definert strategi for bruk av 0,5 × 0,5 mm område for analyse av svulsten – lever grensen ble etablert empirisk basert på den mikroskopiske evaluering av CD45-farget seksjoner som viser lymfocytter opphopning innenfor dette området; dette ble spesifisert uavhengig til, men samsvarer med kvantifisering området definert av Halama et al [3]. Skala: 1 mm. (B) Studie design. Studiedesign er oppsummert av flytskjemaet inkludert farging med etablerte markører, immunceller organisasjon mønster, kvantifisering og vurdering av klinisk relevans ved justering med clinicopathological parametere.
Pasientspesifikke omfang og distribusjon mønster av CD45 -positive celler på stedet av CRCLM
Gross undersøkelser viste massiv infiltrasjon av CD45-positive celler begrenset til svulsten – lever grensen av metastaser. Representative bilder er vist i figur 2, A. Forskjellige mønstre av immuncelleansamlinger ble observert blant pasientene og kan sameksistere i samme prøve ved svulst – lever kant: enkeltceller, som spredes celleaggregatene, og ektopiske follikler strukturer (figur 2 B ). Mengden av CD45-positve cellene ved tre regioner av interesse oppviste større inter-pasient variabilitet som bestemt ved kvantitativ analyse: ved grensen i området fra 8% til 46% (median 19%), inne i levervev på stedet av portal årer som strekker seg fra 9% til 56% (median 29%) og i det fjerne levervevet i området fra 4% til 16% (median 9%); analysen ble utført for panel I og panel II sammen. Viktigere, viste CD45-avledet datasett ingen signifikante forskjeller mellom panel I og panel II (figur S2)
(A) Massive infiltrasjon av CD45-positive celler begrenset til svulsten -. Lever grensen av metastaser. Representative deler av metastatiske områder for to CRCLM pasienter er vist (rød kanal for CD45, blå kanal for kjerner /DAPI). T: svulst; L: leveren. Skala: 200 mikrometer. (B) Ulike mønstre av CD45-positive celle ansamlinger ved metastatisk grensen. Representative bilder av ulike typer immunceller infiltrater vises: (
en
) enkeltceller; (
b
) store immuncelleaggregater; (
c
) fremtredende ektopisk hårsekken. I tillegg til de fusjonerte bilder (
a-c
, røde kanalen for CD45 og blå kanal for DAPI), bilder av enkeltkanaler er inkludert (
d-f
for DAPI;
g-i
for CD45); de enkelte kanaler vises i svart /hvitt, mens flettede Bildene vises i farger. T: svulst; L: leveren. Skala: 50 mikrometer. (C) (
en Anmeldelser –
c
) Kaplan-Meier-estimater for pasienter lagdeling basert på CD45-avledede verdier ved grensen. Kaplan-Meier kurver for RFS basert på CD45 verdier for panel jeg, panel II, og deres kombinasjon vises gir pasientenes lagdeling i lave og høye risikogruppene (høyere enn medianen indikerer lav risiko); p-verdi av log-rank test indikeres. Panel I: median er lik 20,95, under median n = 6, ovenfor median n = 7; panel II: median er lik 17,66, under median n = 10, ovenfor median n = 9; panel I + II: median er lik 19,13, under median n = 16, over median n = 16. (
d
) boksplott av CD45 datasett for pasienter uten tilbakefall (No) versus pasienter med tilbakefall (Ja ) på tidspunktet av 17 måneder. Den cut off ble satt i henhold til den siste hendelse (16,3 måneder) hvor ingen sensur har oppstått, og dermed, som gir klart skille fra de sensurerte fag (≥32.2 måneder) som visualiseres på (
b
). Median CD45 verdi, som ble anvendt for pasient lagdelingen i lave og høye risikogruppene på Kaplan-Meier-plott (
b
) er angitt med stiplet linje; p-verdi vises (t-test)
CD45-positive bosatt og /eller infiltrerende lymfocytter innenfor CRCLM vev:. prognostiske effekt
For å bestemme den kliniske relevansen av pasient-spesifikke immunologiske avtrykk, CD45-avledet datasett ble korrelert med tilbakefall overlevelse (RFS) og total overlevelse (OS). Som estimeres ved Cox regresjonsanalyse (tabell S1), tilstedeværelse av CD45-positive celler i tumoren – leveren grense ble funnet å vise en sterk positiv prognostisk effekt på RFS i begge pasient paneler (panel I: HR = 0,004, 95% CI : 0,001 til 0,627, p = 0,033, panel II: HR = 0,156, 95% KI: 0,045 til 0,546, p = 0,004) og for panel i og panel II sammen (HR = 0,093, 95% KI: 0,028 til 0,305 , p 0,001); var kombinasjonen av datasett som er mulig basert på ytterligere testing for interaksjon mellom de to paneler og fargingsbaserte variabler (Tabell S2). Videre ble en høyere CD45 innhold på metastatisk grensen funnet å korrelere med bedre OS, men med svakere prognostisk effekt (tabell S1). Med hensyn til RFS, pasienter som var oppdelt i grupper med en høyere prosentandel av CD45-positive celler (over median) og med en lavere prosentandel av CD45-positve celler (lavere eller lik medianen). Figur 2 viser C de tilsvarende Kaplan-Meier grafer. Separate analyser av panel I og panel II samt deres kombinasjon viste statistisk signifikante forskjeller mellom høy og lav risikogruppene (log-rank test: p 0,001, p = 0,009 og p 0,001, henholdsvis). Ettersom ingen aktiviteter er tilstede i lav risikogruppen for panel I (n = 7), den tilsvarende HR av Cox regresjonsanalyse tendens til uendelig. I tillegg til panel II data, distribusjon av CD45-baserte verdier kan vises for pasienter med og uten tilbakefall av sykdommen i 17 måneder, når ingen sensur har skjedd ennå (figur 2, C,
d
). Pasienter uten tilbakefall av sykdommen viste signifikant høyere CD45-innhold i forhold til de med en gjentakelse (p = 0,019). I motsetning til grensen, gjorde justering av utvunnet fra lever datasett (portvenen områder og fjern leveren) ikke avsløre statistisk prognostisk effekt på RFS eller OS (tabell S1).
I sammendraget, våre funn understreker en sterk virkningen av pasient-spesifikke lokale immunrespons foregår på stedet av metastaser på det kliniske utfallet av CRCLM pasienter. Det gir oss motivasjon til å avgrense virkningen av de enkelte immunceller undergrupper som omfatter CD45-positive cellepopulasjon ved hjelp av en større kohort av pasienter. Følgelig, i de etterfølgende opp eksperimentene med angivelse av B-celle- og makrofag- linjer et forstørret kohort av pasienter innen panel II ble undersøkt (n = 51).
pasientspesifikk omfang og organisering mønster av CD20-positive B-lymfocytter på stedet av CRCLM
Neste, for å karakterisere B-celle avstamning på CRCLM stedet ble vevsprøver analysert for CD20-positive celler. Påfallende, ble hovedfraksjonen av celler i de store CD45-positiv celleaggregatene, og særlig i løpet av de ektopiske follikler funnet å være CD20-positive B-celler; interessant, bare spor av CD20-positive B-celler ble oppdaget i løpet av de uorganiserte CD45-positive lymfocyttpopulasjoner (Figur 3, A). Forskjellige organisering mønstre av CD20-positive celler ble observert i løpet av de tre regioner av interesse. Representative bilder er gitt i figur 3, B. På grensen, enkeltceller (figur 3, B,
en
) og /eller celleaggregater (figur 3, B,
b
), og /eller ektopiske follikler (figur 3, B,
c
) ble oppdaget. Av notatet, ble CD20-positive B-celler funnet å samle seg rundt svulsten øyene (figur 3, B,
b
, innsats). Store B-celle aggregater ble også oppdaget rundt portalen årer i umiddelbar nærhet til grenseområdet, mens ved fjernere portal årer enkelt CD20-positive celler ble observert (figur 3, B,
d
,
e
, henholdsvis). Spesielt innenfor fjernt levervev, over hele prøven bare tynt fordelt, enkelthendelser ble funnet (figur 3, B,
f
). I linje, kvantitative vurderinger av tre regioner viste nærværet av B-celler i tumoren – lever kant som strekker seg fra 0,3% til 13% med en medianverdi på 2%, og inne i levervevet rundt portal årer som strekker seg fra 0,1% til 36% med en medianverdi på 4%; enkelt CD20-positive celler ble detektert innenfor fjern levervev (median på 0,1%); Analysen ble utført i panel I og II i kombinasjon. I tillegg, sammenligner de to kjemoterapi gruppene i panel II vi observert noen vesentlig forskjell i fordelingen av farge-avledede verdier og har ingen indikasjon for gruppeforskjeller mellom kjemoterapier (Tabell S3). Viktigere, sammenligning av CD20 variabler for panel I og panel II viste ingen signifikante forskjeller i tre regioner av interesse (Figur S3).
(A) undergruppe av CD20-positive B-celler ved metastatisk grensen. Representative eksempler på CD45-positive (
en
) ektopisk hårsekken, (
c
) stor celle tilslag og (
e
) ikke-organisert cellepopulasjon og tilsvarende områder farget for CD20 er vist (
b
,
d
,
henholdsvis f
,). Kvantitativ analyse ble gjort ved hjelp TissueQuest og HistoQuest programvare; prosentandelen av positive celler er indikert. Skala: 100 mikrometer. (B) Ulike organisasjonsmønstre CD20-positive celler i tre regioner av interesse. Representative bilder (i) på grensen: (
en
) enkeltceller, (
b
) celle summerer; sette inn: høyere effekt riss av CD20-positive celler som er i kontakt med colon tumor epitelceller, (
c
) ektopiske follikel-strukturer; (Ii) rundt portalen årer (
d
) plassen til grensen og (
e
) fjernt til grensen samt (iii) i leveren vev (
f
) er vist. T: svulst; L: leveren. Skala: 50 mikrometer.
