Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Til tross for flere tiår med forskning, behandlingstilbud for lungekreftpasienter fortsatt utilstrekkelig, enten for å tilby en kur eller en betydelig overlevelse fordel på grunn av sin iboende motstand mot cellegift. Våre resultater foreslår effektiviteten av kapsaicin i å nedregulere VEGF-ekspresjon i ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC) celler i hypoksisk miljø. Capsaicin-behandling re-aktivert p53-SMAR1 positiv tilbakekoplingssløyfe i disse celler for å overtale p53-mediert HIF-1α nedbrytning og SMAR1-indusert undertrykkelse av COX-2 ekspresjon som behersket HIF-1α nukleær lokalisering. Slike signal modulasjoner dermed ned regulert VEGF uttrykk for å hindre endothelial cellemigrasjon og nettverksdannelse, forutsetninger for angiogenese i tumor mikro-miljø. Resultatene ovenfor argumentere kandidatur capsaicin i utelukkende rettet mot angiogenese ved å nedregulere VEGF i tumorceller for å oppnå mer effektiv og overbevisende behandling av resistent NSCLC
Citation. Chakraborty S, Adhikary A, Mazumdar M, Mukherjee S , Bhattacharjee P, Guha D, et al. (2014) Kapsaicininduserte Aktivering av p53-SMAR1 Auto-Regulatory Loop nedregulerer VEGF i ikke-småcellet lungekreft å begrense angiogenese. PLoS ONE 9 (6): e99743. doi: 10,1371 /journal.pone.0099743
Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: Per 31. desember 2013, Godkjent: 16 mai 2014; Publisert: 13 juni 2014
Copyright: © 2014 Chakraborty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. SC- Universitetet Grants innregulering UGC 2-8 /2002 (SA I) (SA-I) datert 06.11.2008. AA- Institutt for vitenskap og teknologi: DST R /3393/06 datert 16.10.2006. Mm- Institutt for bioteknologi-DBT-RA datert 05.06.2009. SM- Council of Scientific and Industrial Forskning- csir 09/015 (0386) /2010 EPJ-en datert 22.02.2010. PB Institutt for bioteknologi-DBT-RA datert 01.06.2010. DG- Universitetet Grants innregulering UGC 2-8 /2002 (SA I) datert 21.04.2011. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Meget motstandsdyktig ikke småcellet lungekreft (NSCLC) som utgjør hele 80% av alle lungekrefttilfellene er egentlig resistent mot kjemoterapi og /eller strålebehandling. Siden, er angiogenese essensielt for NSCLC vekst og metastase, og derfor styring av tumor-assosiert angiogenese kan være en lovende taktikk i begrensende NSCLC progresjon. Mange pro-angiogene faktorer så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er sterkt uttrykt i tumor-mikromiljøet og sterkt indusere tumor angiogenesishttp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3827603/- B3 [1] . Dette skiftet av tumoren mikromiljøet til en angiogen tilstand, eller «angiogene bryter» [1], [2], er en viktig hastighetsbegrensende faktor i tumorutvikling.
Ekspresjon av VEGF-genet er blitt vist å være oppregulert etter hypoksi [3] – [5] og omsetning av VEGF blir mediert av den hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) [2], [3]. Under normoksisk betingelser, blir HIF-1α nivåer sterkt regulert av oksygen spenning gjennom hydroksylering av prolyl-rester, mens hypoksiske betingelser hindre prolyl hydroksylering av HIF-1α [4] og proteinet er stabilisert, slik at det transactivate målgener som VEGF [3] . Et vell av rapporter tett knytte HIF-1α til p53 i en invers sammenheng der p53 hemmer HIF-1α transkripsjon [6] og induserer sin degradering under flere sub-cellulære forhold til stress [7] og dermed http: //www.jbc. org /søke author1 = Joanna + Zawacka-pankau ? sortspec = date submit = Submitresulting i sin potente undertrykkelse. Interessant er p53 stabilisert ved SMAR1, et stillas matriks-assosiert region-bindende protein, ved forskyvning av MDM2 fra p53 N-terminal lomme og dermed redde p53 fra MDM2-mediert nedbrytning proteasomal [8]. Moderne rapporter [9], [10] viser at på mild DNA-skader SMAR1 fremmer p53 deacetylering gjennom rekruttering av HDAC1 og spesielt undertrykker Bax og Puma uttrykk dermed hemme apoptose. Disse rapportene ikke bare attest kandidatur SMAR1 i å modulere aktiviteten av p53, men også øke muligheten for involvering av p53 i andre cellulære funksjoner i den milde DNA-ødeleggende mikromiljøet av cellen. Viktigere, har flere studier også identifisert komplekse kryss-forhandlingene mellom p5
3 Hotell og Cox-2, hvor Cox-2 undertrykker p53-nettverk i kreftceller [11], [12] og
vice versa
[12]. Alle disse opplysningene fristet oss å gjengi innsikt at det foreligger et interaktivt forhold mellom SMAR1, p53, COX-2 og HIF1-α, om noen, som bestemmer skjebnen til VEGF-ekspresjon i løpet av tumorangiogenese i NSCLC. Inhibering av tumorvekst ved hjelp av anti-angiogene midler er blitt oppnådd hvor lovende antitumorresponser er blitt rapportert for en rekke anti-VEGF-midler. Imidlertid giftigheten av de fleste av disse stoffene, så vel som utvikling av resistens mot de midler betegne nødvendigheten av å identifisere alternative ikke-toksiske midler for å oppnå den kontinuerlige inhibering av angiogenese for effektiv behandling av NSCLC.
Økende bevis indikerte anticancer virkningene av capsaicin (8-metyl-
N
-vanillyl-6-nonenamide), den aktive komponenten i chilipepper, mot ulike kreftformer [13] – [18]. Capsaicin har blitt rapportert å provosere apoptose og begrenser benzo (a) pyren indusert lunge tumorigenesis i sveitsiske albino mus [19] og lindrer ubalanse i xenobiotiske enzymer og tumormarkører [20]. Ifølge Anandakumar
et al.
[20] capsaicin modulerer lungeantioksidantforsvar i løpet av benzo (a) pyren-indusert lungekreft i sveitsiske albino mus [19]. Videre viser capsaicin anti-proliferativ aktivitet mot human småcellet lungekreft i cellekultur og nakne mus-modeller via E2F veien [21]. Fersk rapport fra vårt laboratorium har vist apoptogenic effekten av capsaicin på menneskelige NSCLC celler [22]. Imidlertid er det ingen rapport om rollen til denne fytokjemikalier med NSCLC-indusert angiogenese. I tillegg, selv capsacin har vist seg å undertrykke human fibrosarcoma-indusert angiogenese i kylling chorioallantoic membran-analyse [23] ved å inhibere VEGF-indusert proliferering, og kapillar-lignende rør dannelsen av primære dyrkede humane endotelceller, er effekten av denne fytokjemikalier på VEGF uttrykk i NSCLC celle har ennå ikke blitt utforsket i detalj.
Våre resultater bety at mens hinder av p53-SMAR1 sløyfe indusert VEGF uttrykk i NLCSC celler og dermed favoriserer endotelceller (EF) migrasjon og nettverksdannelse i tumor miljø , reframing av disse pro-angiogene signaler ved capsaicin blokkert VEGF produksjonen selv under hypoksisk tilstand, og dermed dempe NSCLC-indusert netto arbeid dannelse av endotelceller. En slik utvikling i forståelsen kan tilby panorama av utelukkende rettet mot pro-angiogene faktorer og veier til å oppnå effektiv og overbevisende lungekreft behandling.
Materialer og Metoder
Cell kultur
humane kreftcellelinjer, A549, MCF-7, HeLa, HCT-15, og normal lunge fibroblast WI-38, ble oppnådd fra National Center for Cell Science, India, og holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i DMEM-medium supplert med 10% FBS (Lonza, NH), L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (100 ug /ml), ikke-essensielle aminosyrer (100 uM), streptomycin (100 ug /ml), penicillin (50 U /ml; Invitogen, CA) [24]. Humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) ble oppnådd fra HIMEDIA Cell Culture (Mumbai, India), og holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i M199 (Gibco, Grand Island, NY) supplert med 20% FBS og EC vekst supplement (ECGS, BD Biosciences, Bedford, MA). Alle forsøkene ble utført med HUVECs mellom passasjer 2-5. Levedyktige celler ble bestemt ved trypanblått eksklusjon test [11].
For å etterligne hypoksi, ble A549 celler dyrket i nærvær av 100 mikromol /l CoCl
2 (Sigma, St. Louis). Celler ble behandlet med capsaicin (Sigma, St. Louis) som kreves i eksperiment. Når det er nødvendig, ble A549-celler behandlet med Brefeldin A (1 ug /ml, Calbiochem, NJ) og /eller MG-132 (10 uM, Sigma, St. Louis) og /eller rekombinant VEGF (0,8 ng /ml, for å holde tilsvarende mengde VEGF som var til stede i Hy-A549 brukt media som ble brukt ved 1:01 forhold med M199 på endotelceller; Peprotech, CA) og /eller VEGF-nøytraliserende antistoff (25 ng /ml, R Cellgro, USA) og puromycin (1 pg /ml; Cellgro, USA) i 14 dager, og cellene som overlever denne behandling ble klonet og vurdert for p53, SMAR1 og Cox-2 av immunoblotting. For endogen stanse av spesifikke gener, ble cellene transfektert med 300 pmol av HIF-1α- /Cox-2 -siRNA (Santa Cruz, California) og p53 shRNA (Santa Cruz, California) bruker lipofektamin-2000 for 12 timer. De mRNA og proteinnivåer ble bestemt ved RT-PCR og Western blotting.
Chromatin Immunpresipitasjon og PCR
chip Analysen ble utført som tidligere rapportert av vårt laboratorium [9]. Kort sagt ble agarosekuler blokkert med BSA og, etter vasking, kulene ble pre-inkubert med antistoff mot SMAR1 /BANP (BTG-3 tilknyttet kjerneprotein, Santa Cruz, CA). Cellelysatene ble ultralydbehandlet for å skjære DNA til lengder mellom 200 og 1000 basepar og deretter sentrifugert ved 13000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Supernatanter ble fortynnet 10 ganger i ChIP fortynningsbuffer og tilsatt til de pelleterte agarose perler som ble pre-inkubert med antistoffer. Etter inkubering over natten ved 4 ° C, ble kulene vasket med lavt saltinnhold, høy salt, LiCl og Tris /EDTA-buffer. Til slutt ble eluert kromatin ved inkubering av perler med 5 M NaCl ved 65 ° C og proteiner ble fjernet ved behandling med proteinase K. ChIP DNA ble deretter renset ved bruk av en passende rensesett og lagret ved -20 ° C. SMAR1 bundet ChIP DNA ble forsterket ved hjelp av PCR. Sekvensene av sannsynlige SMAR1 bindingsseter på Cox-2 promoter er som følger: site-1: 5′-TGA-CCAGCATCCCAAATGTA-3 «(fremover) og 5′-TGAGGGA-AAAACAGGGCATA-3′ (bakover); site-to 5»-CAAAAAGAAAATGA-TCCACGC-3 «(fremover) og 5′-TCATGAGACACGGATGCCTA-3′ (bakover); site-3 5»-CCGTGTCTCA-TGAGGAATCA-3 «(fremover) og 5′-ATCATGGGTAGTGCTCAGGG-3′ (bakover); site-fire 5»-TGCT-GTCATTTTCCTGAATGC-3 «(fremover) og 5′-GGGGATTTTGACAGTTGGAA-3′ (bakover); site-fem 5»-GCCCAGGCA-ACTGAAAAGTA-3 «(fremover) og 5′-CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3′ (bakover); site-6 5»-TTT-TGGACATTTAGCG-TCCC-3 «(fremover) og 5’TGTTCTCCGTACCTTCA -CCC-3′ (bakover); site-7 5»-TACCTTTCCC-GCCTCTCTTT-3 «(fremover) og 5′-TGGGGCGAGTA-AGGTTAAGA-3′ (bakover); site-8 5»-AAC-CTTACTCGCCCCAGTCT-3 «(fremover) og 5’CagA-AGGACACTTGG-CTTCC-3» (bakover).
kvantitativ real-time PCR
Kvantitativ real -time PCR ble utført for å kvantifisere de tidsavhengige uttrykk nivåer av VEGF og HIF-1α i kapsaicinbehandlede Hy-A549-celler (22). Kvantitativ real time PCR ble utført i Master cycler gradient (en Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System) med SYBR-grønn Rox mix (ABgene, Epsom, Storbritannia). Primere som brukes til VEGF er 5′-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3 «(fremover) og 5′-CAAAGCACAG-CAATGTCCTGAAG-3′ (bakover) og for HIF-1α 5»-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3 «(fremover) og 5»-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3 «(bakover).
Statistiske analyser
Verdier har vist seg som standardfeil (SEM) eller representant for typisk forsøk unntatt annet er angitt. Data ble analysert, og når det passer, signifikans av forskjellene mellom gjennomsnittsverdiene ble bestemt ved Students
t
test. Resultatene ble betraktet som signifikant på
p
0,05. Alle forsøkene ble utført uavhengig tre ganger
Resultater
Capsaicin hemmer NSCLC-indusert EC migrasjon og nettverksdannelse
Siden EC migrasjon er en sentral skritt for tumorindusert angiogenese.; Vi undersøkte migrasjon av HUVECs i nærvær av det brukte mediet fra kulturer av både normale celler og NSCLC. I hovedpunkt, HUVECs ble dyrket i fravær eller nærvær av det brukte mediet fra normal lunge fibroblast-celler (WI-38) og NSCLC-celler (A549) samt COCl
2-stimulerte A549-celler (Hy-A549). Resultater av sårheling analyse oppviste ikke-signifikant migrering av HUVECs i nærvær av brukte media av WI-38-celler, mens, ble det observert signifikant migrasjon i nærvær av A549 brukt media, en situasjon som etterligner den tumorbærende tilstand (figur 1A) . Prosent migrering av HUVECs ble enda mer i Hy-A549 brukte media (figur 1A) som indikerer at hypoksisk tilstand favoriserer angiogenese. Hy-A549-celler ble derfor anvendt for resten av forsøkene for å angi hypoksisk tilstand.
(A) Migrering av HUVECs i nærvær eller fravær av brukt medium fra NME, WI-38, A549 og A549 Hy- (CoCl
2-stimulert til å etterligne hypoksisk tilstand som kreves for tumorindusert angiogenese) ble utsatt for toveis sårheling analyse for 24 timer (
venstre panel
). Antallet celler som migrerte i sårområdet er representert grafisk (
høyre panel
). (B) Representative bilder av HUVEC migrasjon ved inkubasjon med capsaicin behandlede pasienter (0-50 mikrometer) Hy-A549 celle brukt medium (
venstre panel
). Prosent celle migrert i såret området har vært representert grafisk (
høyre panel
). (C) Hy-A549-celler ble behandlet med capsaicin på en doseavhengig måte i 24 timer og cellelevedyktigheten ble bedømt ved trypan blå farge-eksklusjon assay (
venstre panel
). Hy-A549-celler, behandlet med capsaicin (37,5 pM), ble underkastet Annexin V-FITC-/PI-binding og analysert strømnings cytometrically for bestemmelse av prosent tidlig apoptose (
høyre panel
). (D) Den cytotoksiske effekten av forskjellige doser av capsaisin på HUVEC-celler ble målt ved hjelp av trypanblått-farvestoff-eksklusjon analysen. (E) Grafisk fremstilling av HUVEC migrasjon ved inkubasjon med brukt media fra capsaicin behandlede pasienter (37,5 mm) HBL-100, HCT-15, HeLa og A549. (F) Representative bilder av kapillær-lignende spire dannelse ved HUVECs i nærvær av media alene eller brukt medie av WI-38 /A549 /Hy-A549 /kapsaicinbehandlede Hy-A549. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk i hvert tilfelle eller representant for typisk eksperiment.
Interessant, tilbrakte-media av capsaicin behandlet Hy-A549 betydelig hemmet tumorindusert HUVEC migrasjon i en capsaicin dose -avhengig måte, den optimale effekt være på 37,5 pM av kapsaicin i 24 timer utover som ikke lenger signifikant endring kan oppnås (figur 1B). Effekten av capsaicin på levedyktigheten av Hy-A549-celler ble undersøkt ved hjelp av trypanblått-farvestoff-eksklusjon analysen. Figur 1C (
venstre panel)
avbildet doseavhengig effekt av capsaicin på levedyktigheten til Hy-A549 celler samt HUVEC (figur 1D). Resultatene indikerte at ved å utsettes for 24 timer, ble kapsaicin ikke fremkalle noen betydelig død i hver av cellene inntil konsentrasjoner på 37,5 uM. Disse resultatene for derved å utelukke muligheten for retardasjon av EC migrasjon på grunn av Hy-A549 celledød ved denne konsentrasjonen av kapsaicin. Imidlertid konsentrasjoner utover 37,5 uM ble funnet å være giftige for både Hy-A549 celler og HUVEC (figur 1C,
venstre panel
og 1D). Ytterligere eksperimenter ble derfor begrenset til 37,5 uM. For å vurdere om reduksjon i celletallet er på grunn av tidlig apoptose, ble antallet av Annexin V-positive celler som bestemt ved strømningscytometri. Resultater av figur 1C (
høyre panel
) viste 37,5 mikrometer dose av capsaicin som sub-apoptotiske dose for Hy-A549 celler. Disse resultatene sammen sikres fravær av «innblanding» av apoptotiske celler ved 37,5 pM dose av kapsaicin som brukes i de etterfølgende eksperimenter. At effekten av kapsaicin ikke er begrenset til en bestemt type, ble validert ved hjelp av et batteri av cellelinjer, det vil si, HBL-100, HCT-15, HeLa og, MCF-7 (figur 1E). Men for detalj mekanistiske studier eksperimenter ble utført med Hy-A549 celler.
Deretter spiren dannelsen analysen av egenkapitalbevis ble utført på Matrigel, et veletablert angiogenese analysen. HUVECs dannet tube-lignende nettverk innen 8 timer (figur 1F). Angiogen spire dannelsen av HUVECs var høyest i nærvær av brukte media av Hy-A549 celler etterfulgt av at av A549 celler og WI-38 celler (figur 1F). Imidlertid capsaicin forbehandling av Hy-A549 effektivt hindret spire dannelsen av HUVECs (figur 1F) hvor slangelignende strukturer ble redusert både i bredde og lengde og viste ufullstendig samt brutt nettverksstrukturer (figur 1F).
Kapsaicin hemmer VEGF til å retardere kreftcelle-indusert EC migrering
Alle reaksjonene så langt definert oppsto uavhengig av direkte kontakt av HUVEC-celler med tumorceller eller til og med nærhet, for derved å øke muligheten for nærvær av tumor -shed løselige pro-trekkende faktorer i de brukte media. Støtte dette, brukte mediet for Brefeldin-A-behandlet Hy-A549 klarte å indusere betydelig EC migrasjon (figur 2A) og capsaicin kan ikke innføre noen ytterligere effekt (figur 2A). For å re-bekrefte vår hypotese, effekten av capsaicin i å regulere pro-angiogene faktorer som VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, ble overvåket i Brefeldin-A pre-behandlet Hy-A549 celler. Selv om capsaicin mislyktes i å forandre bFGF, EGF og TGF-β nivåene det vesentlig nedregulert VEGF-ekspresjon (figur 2B). Videre studier viste at de brukte media av Hy-A549 celler (10
6 celler /ml media) inneholdt et gjennomsnitt på 1,6 ng VEGF som sunket betraktelig etter at capsaicin behandling (figur 2C,
venstre panel
) . For å adjudge effekten av capsaicin i regulering VEGF i Hy-A549 celler, vedtok vi noen tilnærminger. I den første fremgangsmåten, ble da Brefeldin A-forbehandlet Hy-A549-celler ble behandlet med kapsaicin i 24 timer, intracellulær VEGF ble opphevet både på mRNA og proteinnivåer (figur 2C,
midtpanelet
). Disse observasjonene ble videre støttet av vår kvantitative sanntid PCR data som viser en nedgang i forhold VEGF mRNA uttrykk i Hy-A549 celler etter capsaicin behandling (figur 2C,
høyre panel
) og re-bekreftet av konfokalmikroskopi (Figur 2D). I den andre fremgangsmåten, kontroll media supplert med rekombinant VEGF (0,8 ng /ml) økte endotelial cellemigrering og spire dannelse (figur 2E 2F). Disse resultatene sammen validert hypotesen om at Hy-A549 celle-skur VEGF spiller en avgjørende rolle i kreft-indusert EC migrasjon og spire formasjon. Foran møblerte observasjoner fristet oss å avgrense hele mekanismen bak reguleringen av tumor angiogenese av capsaicin.
(A) Representant fasekontrast photomicrographs demonstrerer HUVEC migrasjon ved inkubasjon med brukt media for Brefeldin-A-forbehandlet, capsaicin ( 37,5 mm) -behandlet Hy-A549 celler (
venstre panel
). Prosent celle migrert i såret området har vært representert grafisk (
høyre panel
). (B) immunoblot som viser uttrykk profiler av pro-angiogene faktorer VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, i nærvær eller fravær av kapsaicin. (C) Utskilt VEGF fra celle-fri supernatant av Hy-A549 ble kvantifisert ved ELISA assay (
venstre panel
). Tidsavhengige uttrykk profiler av VEGF-mRNA /-protein i kapsaicinbehandlede Hy-A549 celler ble bestemt ved Western blot og RT-PCR henholdsvis (
midtre panelet
). Kapsaicinbehandlede Hy-A549 celler ble undersøkt for tidsavhengig variasjon i uttrykket profiler av VEGF av kvantitativ real time PCR-analyse og representert grafisk (
høyre panel
). (D) Immuno-fluorescerende bilder (60x forstørrelse) viser tidsavhengig mønster av VEGF protein (TRITC-fluorescerende) i kapsaicinbehandlede Hy-A549 celler ble representert sammen med nukleær farging (DAPI: blå). (E) Representative bilder av HUVEC migrasjon ved inkubasjon med (i) rekombinante VEGF-supplert kontroll media, eller VEGF-supplert brukt media for kapsaicinbehandlede Hy-A549 celler, eller med (ii) anti-VEGF-behandlet Hy-A549 brukt media (
venstre panel
). Prosent celle migrert i såret området er representert grafisk (
høyre panel
). (F) Representative bilder av kapillær-lignende spire formasjon ved HUVECs ved inkubasjon med rekombinante VEGF-supplert brukt media for kapsaicinbehandlede Hy-A549 celler eller med anti-VEGF-behandlet Hy-A549 brukt media. GAPDH /α-aktin ble benyttet som intern kontroll lasting. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk i hvert tilfelle eller representant for typisk eksperiment.
Capsaicin hemmer VEGF transkripsjon ved å målrette HIF-1α
Som capsaicin reduserer VEGF både på transkripsjons samt translasjonsforskning nivåer vi en hypotese om at dette phytochemical kan ha en regulerende effekt på HIF-1α, hovedtranskripsjonsfaktor VEGF under hypoksi [4]. Interessant, capsaicin redusert HIF-1α på proteinnivået, men ikke på mRNA-nivå i Hy-A549-celler (figur 3A,
venstre panel
), som ble ytterligere bekreftet ved vår kvantitativt sanntid PCR-data (figur 3A,
høyre panel
). Videre HIF-1α-siRNA-transfekterte Hy-A549 celler innredet nedgang i VEGF uttrykk (figur 3B) og brukt media for disse transfektanter viste signifikant mindre EC migrasjon (Figur 3C). Disse resultatene indikerte at capsaicin inhiberte VEGF med ned-modulering av styringstranskripsjonsfaktoren HIF-1α (figur 3C). Men siden capsaicin behandling av disse transfektanter påvises ytterligere reduksjon i VEGF, involvering av HIF-1α-uavhengig reaksjonsvei (er) av VEGF inhibering av capsaicin ikke kan bli eliminert.
(A) tidsavhengige uttrykk profiler av HIF -1α mRNA og -protein ble bestemt ved Western blot og RT-PCR, henholdsvis i kapsaicinbehandlede Hy-A549-celler (
venstre panel
). Kapsaicinbehandlede Hy-A549 celler ble undersøkt for tidsavhengig variasjon i uttrykket profiler av HIF-1α av kvantitativ real time PCR-analyse og representert grafisk (
høyre panel
). (B) Hy-A549-celler transient transfektert med et ikke-målsøkende kontroll-siRNA eller HIF-1α-siRNA, ble inkubert med /uten capsaicin i 24 timer; cellene ble deretter analysert for å bestemme VEGF-ekspresjon på protein og mRNA-nivåer (
venstre panel
). Immunoblot som viser transfeksjonseffektivitet av HIF-1α (
høyre panel
) (C) Kontroll-siRNA /HIF-1α-siRNA-transfekterte Hy-A549-celle-supernatantene ble brukt for å vurdere HUVEC migrering av sårheling assay etter capsaicin -rensing (37,5 uM; 24 h) og gjengis grafisk. (D) Tidsavhengig uttrykk profilen til p53-mRNA og -protein ble bestemt ved Western blotting og RT-PCR i kapsaicinbehandlede Hy-A549 celler (
venstre panel
). p53 fosforylering på Serine-15 posisjon ble også evaluert (
høyre panel
). (E) Hy-A549 celler, transfektert med kontroll-shRNA /p53-shRNA ble inkubert med capsaicin i 24 timer og HIF-1α VEGF-mRNA og -protein ble bestemt ved Western blot og RT-PCR (
venstre panel
). Transfeksjon effektivitet ble kontrollert ved å analysere p53 uttrykk nivå (
høyre panel
). (F) HIF-1α ble immunopresipitert fra kapsaicinbehandlede Hy-A549 cellelysater og immunoblottet med anti-Ub-antistoff for å bestemme HIF-1α ubiquitinering. Stigen band representert ubiquitinmolekyler HIF-1α. I parallellforsøk ble immunopresipitater analysert for HIF-1 a nivåer ved hjelp av Western blot. Sammenlignbar protein-inngang ble bekreftet ved direkte Western blotting med anti-α-aktin anvendelse av 20% av cellelysatene som ble brukt for immunpresipitering. (G) for kontroll og MG-132 legemiddel forbehandlet Hy-A549-celler ble underkastet kapsaicin-behandling i 24 timer og deretter ble kontrollert for ekspresjon av HIF-1α /VEGF ved Western blotting. α-Actin /GAPDH ble benyttet som intern kontroll lasting. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk i hvert tilfelle eller representant for typisk eksperiment.
Capsaicin er rettet mot HIF-1α i en p53-avhengig måte
Siden p53 rettet HIF- direkte 1α for proteosomal degradering [9], vurderte vi rollen til p53, om noen, i capsaicin-indusert regulering av HIF-1α og VEGF. Capsaicin behandling førte til en tidsavhengig økning av p53 i Hy-A549-celler (figur 3D) selv om dette forstørrelse i p53 nivået var mye lavere enn det indusert av apoptotiske dose (~ 50 pM) av kapsaicin [27], [28] .
