Abstract
Bakgrunn
Samler bevis antydet at epitel -mesenchymal overgang (EMT) og kreft stamcelle (CSC) egenskaper, som begge bidrar til tumorinvasjon og metastase, henger sammen med MIR-21. MiR-21 er en av de viktige microRNAs knyttet til tumorprogresjon og metastaser, men de molekylære mekanismene bak EMT og CSC fenotype under Mir-21 bidrar til migrasjon og invasjon av brystkreft celler gjenstår å bli belyst.
Methodology /hovedfunnene
i denne studien ble MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler etablert av transfekterte HSA-MIR-21 antagomir til brystkreft MDA-MB-231 celler. EMT ble evaluert ved endringer av mesenchymal cellemarkører (N-cadherin, vimentin, og alfa-SMA), epitelial cellemarkør (E-cadherin), så vel som kapasiteter på cellemigrering og invasjon; CSC fenotypen ble målt ved hjelp av de forandringer av CSC overflatemarkører (ALDH1 og CD44), og kapasiteten på sphereforming (mammospheres). Vi fant at antagonisme av MIR-21 reverseres EMT og CSC fenotype, akkompagnert med PTEN oppregulering og AKT /ERK1 /2 inaktivering. Interessant, nedregulering av PTEN av siPTEN trykt effektene av MIR-21 antagomir på EMT og CSC fenotype, som bekrefter at PTEN er et mål på MIR-21 i rygging EMT og CSC fenotype. De hemmere av PI3K-AKT og ERK1 /2 trasé, LY294002 og U0126, både undertrykte betydelig EMT og CSC fenotype, som indikerer at AKT og ERK1 /2 veier er nødvendig for MIR-21 medier EMT og CSC fenotype.
konklusjoner /Betydning
i konklusjonen, våre resultater viser at antagonisme av MIR-21 reverserer EMT og CSC fenotype gjennom målretting PTEN, via inaktivering av AKT og ERK1 /2 veier, og viste en ny mekanisme som kan avlaste ondartede biologiske atferd av brystkreft
Citation:. Han M, Liu M, Wang Y, Chen X, Xu J, Sun Y, et al. (2012) antagonisme av MIR-21 Reverserer Epitelial-Mesenchymale Overgang og Cancer Stem Cell Phenotype gjennom AKT /ERK1 /2 Inaktive av målretting PTEN. PLoS ONE 7 (6): e39520. doi: 10,1371 /journal.pone.0039520
Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Forskningssenter, Saudi-Arabia
mottatt: 26 september 2011; Godkjent: 26 mai 2012; Publisert: 25 juni 2012
Copyright: © 2012 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Natural Science Foundation of China (NSFC 81072147, NSFC 31171336), Natural Science Foundation of Chongqing Science Technology Commission, Kina. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er assosiert med økt aggressivitet og metastase i karsinomer, inkludert brystkreft, som gjør det mulig celler til å migrere og invadere omkringliggende problemene og flykte inn i blodet, på vei til å etablere metastaser. Når disse metastatiske celler nå sine mål, kan de gjennomgå mesenchymal- epitel overgang (MET) for å etablere sekundære svulster, noe som resulterer i kreft sprer seg og behandlingssvikt [1] – [3]. På molekylært nivå, celler som gjennomgår EMT i retning av en mer mesenchymale fenotype medfører tap eller senkes ekspresjonen av epitel-markører som E-cadherin, og økt ekspresjon av mesenchymale markører slik som N-cadherin, vimentin, og alfa-SMA [2] , [4], [5]. Det finnes studier antydet at EMT i brystkreft er tett knyttet til basal-lignende fenotype brystkreft undergruppe og kreft stamceller (cscs) [6] -. [8]
cscs er spådd til å være kritiske driverne av tumorprogresjon på grunn av CSC egenskaper inkludert selvfornyelse kapasitet, ubegrensede proliferativ potensial og metastase potensial, noe som tyder på at målretting CSC egenskaper ville sannsynligvis eliminere cscs som er de «frø» av tumor tilbakefall og metastasering. Selv om CSC hypotese antyder at tumorer kan oppstå fra stammen /stamceller, studier fra mange laboratorier har vist at EMT kan gi gave til celler som er i besittelse CSC egenskaper samt en mer motile invasive fenotype [7] – [10]. Tidligere studier har bekreftet at brystkreft inneholder en CSC-kupé [11] – [13], noe som kan bli beriket ved å rense aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1) -positive celler [13] eller CD44
+ /CD24
– /lav-celler [11] ved å sortere, og også ved rensing av sphereforming celler (mammospheres) fra parentale celler [12]. Det er studier viste at EMT fenotype er høyest i CD44
+ /CD24
– /lav brystkreft cscs (7), og cscs beriket fra brystsvulster og metastatisk brystkreft plevravæske uttrykke markører som ligner på celler som har gjennomgått en EMT [7], [14]. Tilsvarende er EMT og CSC markører også ofte forbundet med brystkreft som har en tilbøyelighet til å metastaser, som basal-lignende fenotype brystkreft gruppen [15] og metaplastiske [16] brystkreft.
microRNAs (miRNAs) er en familie av små ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer genekspresjonen ved baseparing til det 3′-UTR av mål-mRNA. Nylig har en rekke mirnas har vist seg å spille kritiske roller i progresjon og metastasering av human malignitet [17], [18], herunder brystkreft. MiR-21 er en av de første mirnas detektert i det humane genom, noe som også er en av mirnas kjent for å være oppregulert i alle typer humane maligniteter [19]. Nyere studier indikerer at flere kreftdempere inkludert fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti (PTEN) [20], tumorsuppressorgenet tropomyosin 1 (TPM1) [21], programmert celledød 4 (PDCD4) [22], maspin [23] og matriksmetalloproteinaser hemmere RECK og TIMP3 [24] var mål for MIR-21, noe som tyder på at MIR-21 er et viktig onkogene miRNA som er nært knyttet til tumorvekst og metastasering.
Det finnes studier vist at MIR -21 er en viktig del av den cellulære signal krets som regulerer EMT programmet [25] – [27], samt medarbeidere med CSC signaturer [26], [28], noe som tyder på at MIR-21 spiller en nøkkelrolle i prosessen med EMT og kjøp av CSC egenskaper, som i tråd med vår tidligere studie [29], men de underliggende mekanismene er fortsatt uklart.
Nyere studier har vist at Mir-21 øker tumor celleproliferasjon, migrasjon og invasjon gjennom målretting PTEN [20], en tumor suppressor gen som er en motstander av phosphatidylinotidol 3-kinase (PI3K) ved å fjerne 3′-UTR fosfat fra phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). Men rollen som PTEN i MIR-21 induserende EMT og CSC fenotype er ikke avklart. Det er vel kjent at PTEN regulerer negativt PI3K-proteinkinase B (AKT) pathway [30] og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) /ekstracellulære signal regulert kinase1 /2 (ERK1 /2) pathway [31], samt både AKT og ERK1 /2 veier ble vurdert å være relevante for vedlikehold av EMT og CSC egenskaper [32] – [36]
Disse resultatene tyder sterkt på at Mir-21 makt via AKT og ERK1 /2 veier. ved å målrette PTEN regulere EMT og CSC fenotype. I denne studien har vi avdekket at antagonisme av MIR-21reversed EMT forenlig med CSC fenotype via AKT og ERK1 /2 trasé ved å målrette PTEN, indikerer en molekylær vei som kan avlaste de ondartede biologiske atferd av brystkreft.
Resultater
Transfekterte HSA-MIR-21 Antagomir Redusert uttrykk av MIR-21 i MDA-MB-231 celler
for å undersøke om HSA-MIR-21 antagomir kan redusere uttrykket av MIR -21, hSA-MIR-21 antagomir eller dets negative kontroll ble transfektert inn i MDA-MB-231-celler i 48 timer, da den relative ekspresjon av MIR-21 ble målt ved hjelp av sanntids RT-PCR. Den relative uttrykk for MIR-21 var 0,10711 ± 0,01272 i MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler, som var signifikant nedregulert, som sammenlignet med 1,07862 ± 0,09722 i negative kontrollgruppene (p = 0,0015, Fig. 1A ). Resultatene antydet at HSA-MIR-21 antagomir kan redusere uttrykket av MIR-21 i MDA-MB-231 celler.
MDA-MB-231 celler ble transfektert med HSA-MIR-21 antagomir eller hsa- MIR-21 antagomir kontroll til en endelig konsentrasjon på 50 nmol i 48 timer. (A) MDA-MB-231-celler ble behandlet med HSA-MIR-21 antagomir redusert ekspresjon av MIR-21, sammenlignet med kontrollgrupper (n1 = n2 = 3; p = 0,0015), ved sanntids RT-PCR analyse. (BE) mRNA nivåer av mesenchymale biomarkører (N-cadherin, vimentin og alfa-SMA) og epitel biomarkør (E-cadherin) i MDA-MB-231 /anti-Mir-21 celler og MDA-MB-231 /kontrollceller , målt ved sanntids RT-PCR-analyse. Den sanntids RT-PCR-reaksjoner ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum i tre eksemplarer, samtidig. (F, G) De relative protein nivåer av EMT markører i indikerte cellene ble vist ved Western blot analyse, og bandene var semi-kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. Beta-aktin ble brukt som lasting kontroll. (H, I) De trekkende og invasive egenskapene indikert celler ble testet i migrasjon og invasjon analysen i Transwell inserts. Penetreres celler ble talt og analysert i histogrammet. Data representerer minst tre forsøk utført in triplo. (* Indikerer p 0,05;
★ tyder p 0,001).
antagonisme av MIR-21 Reversed EMT, samt redusert migrasjon og invasjon i MDA-MB-231 celler
for å undersøke effektene av tvang antagonisme av MIR-21 på EMT prosessen med MDA-MB-231 celler, den relative mRNA og protein uttrykk for mesenchymale fenotype celle biomarkører (N-cadherin, vimentin, og alfa-SMA) og epitelial celle fenotype biomarkør (E-cadherin) i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler og tilsvarende kontrollceller ble målt. Antagonisme av MIR-21 reduseres de relative mRNA-nivåer av N-cadherin, vimentin, og alfa-SMA (p = 0,0038 p = 0,0018, og p = 0,0023, henholdsvis Fig. 1 B, C, D), mens økte den relative mRNA nivået av E-cadherin (p = 0,0017, fig. 1E) i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler, sammenlignet med tilsvarende kontroll-celler, av sanntids-RT-PCR-analyse. Resultatene antydet at antagonisme av MIR-21 kunne redusere mRNA-ekspresjon av mesenchymale fenotype celle biomarkører, mens øker mRNA-ekspresjon av epitelial celle fenotype biomarkør. Resultatene av Western blot-analyse viste at de relative protein nivåer av N-cadherin, vimentin, og alfa-SMA ble nedregulert signifikant (p = 0,0003 p = 0,0026, og p = 0,04, henholdsvis Fig. 1 F, G) , mens det av E-cadherin ble oppregulert signifikant (p = 0,0053; fig. 1 F, G) i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler, sammenlignet med kontrollceller. Resultatene antydet at antagonisme av MIR-21 kan redusere protein uttrykk for mesenchymale fenotype celle biomarkører, mens øke det av epitelial fenotype celle biomarkør. Resultatene viste tydelig at antagonisme av MIR-21 kan reversere EMT, avhengig sperre EMT fenotypiske biomarkører. Funksjonelt er den relative migrerte og invaderte celletall av MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler var signifikant dårligere enn negativ kontroll (p 0,0001, s 0,0001 henholdsvis Fig. 1 H, I), foreslo at antagonisme av MIR-21 kan redusere celle migrasjon og invasjon i MDA-MB-231 celler, noe som ytterligere understreket funksjon av MIR-21 i invasjonen og metastasering av brystkreft celler.
antagonisme av MIR-21 Reversed CSC Phenotype i MDA-MB-231 celler
for å undersøke effekten av antagonisme av MIR-21 på CSC fenotype i MDA-MB-231 celler, andelen av celler med ALDH1
+ (ALDH
lyse ) og CD44
+ /CD24
– /lav i MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler og negative kontrollceller ble målt. Prosentandelen av celler med ALDH1
+ i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler var 0,85
±
0,092, betydelig mindre enn 2,323 ± 0,315 i negative kontrollgrupper (p = 0,0051, fig . 2A, B), ved ALDEFLUOR analysen; prosentandelen av celler med CD44
+ /CD24
– /lav i MDA-MB-231 /anti-MIR-21cells var 0,543 ± 0,129, også betydelig lavere enn 4,807 ± 1,062 i kontrollgrupper (p = 0,0094; fig. 2C, D), ved FACS-analyse. Disse resultatene antydet at antagonisme av MIR-21 kan redusere brystkreft CSC andelen som uttrykker CSC overflate biomarkører ALDH1
+ og CD44
+ /CD24
– /lav. Videre er den relative mRNA og protein ekspresjon av ALDH1 og CD44 i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler og kontrollceller ble også målt. De relative mRNA-nivåer av ALDH1 og CD44 i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler ble signifikant redusert sammenlignet med kontrollgrupper (p = 0,0039 p = 0,0034, henholdsvis Fig. 2E, F), som bestemt ved real time RT-PCR-analyse, som antydet at antagonisme av MIR-21 kan redusere mRNA uttrykk for ALDH1 og CD44. Proteinet ekspresjon av ALDH1 og CD44 ble også redusert tilsvarende (p = 0,0002 p = 0,0005, respektivt, Fig. 2G, H), av Western blot-analyse, antydet at antagonisme av MIR-21 kunne redusere protein ekspresjon av ALDH1 og CD44 . Disse resultatene indikerte at antagonisme av MIR-21 kunne reversere CSC fenotype i MDA-MB-231-celler, som videre foreslått at MIR-21 kan omfatte i reguleringen av CSC egenskaper. Mer interessant, det mammosphere nummer i MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler var betydelig dårligere til å kontrollere grupper (p = 0,0017, Fig. 2I, J), indikerte at antagonisme av MIR-21 kan redusere dannelsen av mammospheres, som videre foreslått at Mir-21 kunne regulere CSC egenskaper, inkludert kapasiteten til selvfornyelse og clonogenicity.
(A, B) ALDH1 enzymatisk aktivitet (ALDH
lys) i etablert brystkreft MDA-MB -231 /anti-MIR-21 celler og MDA-MB-231 /kontrollceller (n1 = n2 = 3) ble påvist ved hjelp av ALDEFLUOR analysen. (C, D) CD44
+ /CD24
– /lav fenotype i indikerte cellene (n1 = n2 = 3) ble oppdaget av FACS analyse. (E, F) De relative mRNA-nivåer av ALDH1 og CD44 ble påvist ved sanntids RT-PCR-analyse. (G, H) De relative proteinnivåer av ALDH1 og CD44 ble påvist ved Western blot-analyse. Beta-aktin ble brukt som lasting kontroll. (I, J) Antallet mammospheres fra 1000 MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler eller MDA-MB-231 /kontrollceller ble tellet under mikroskop. Alle data som representerer minst tre forsøk utført in triplo. (* Indikerer p 0,05;
★ indikerer p 0,001).
antagonisme av MIR-21 Induced Over-uttrykk for PTEN
Nyere studier har vist at speil 21 økt celleproliferasjon, migrasjon og invasjon gjennom moduler tumorsuppressorgenet PTEN [20], men rollen PTEN i MIR-21 regulerer svulst EMT og CSC fenotype er ikke avklart. For å undersøke om antagonisme av MIR-21 regulerer PTEN uttrykk, ble mRNA og proteinnivåer PTEN målt ved real time RT-PCR-analyse og Western blot analyse, henholdsvis. Som forventet, både mRNA og protein ekspresjon av PTEN i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler ble sterkt oppregulert, sammenlignet med kontrollgrupper (p = 0,003, p = 0,0437, respektivt, Fig. 3A, B, D). Resultatene viste at antagonisme av MIR-21 kan opp-regulerer uttrykket av PTEN.
(A) ektopisk uttrykk av PTEN mRNA i MDA-MB-231 /anti-Mir-21 celler og MDA-MB- 231 /kontrollceller ble verifisert ved sanntids RT-PCR-analyse (p = 0,003). (B, C, D) Protein nivåer av PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK1 /2, og ERK1 /2 i angitte celler ble påvist ved Western blot-analyse, og båndene ble semi-kvantifisert ved anvendelse av ImageJ programvare. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (* Indikerer p 0,05)
antagonisme av MIR-21 inaktivert AKT og ERK1 /2
AKT og ERK1 /2 er to viktige signalveier i å regulere cellevekst, migrasjon. og overlevelse, og begge ble også regulert av PTEN, men rollene til AKT og ERK1 /2 baner i MIR-21 regulerer svulst EMT og CSC fenotype er ikke avklart. For å bestemme signalmolekyler som involverer i antagonisme av MIR-21 reverserende EMT og CSC fenotype, protein nivåene av fosforylert AKT (p-AKT) og AKT, fosforylert ERK1 /2 (p-ERK1 /2) og ERK1 /2 var målt ved Western blot-analyse. Protein nivåer av p-AKT og p-ERK1 /2 i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler ble sterkt redusert sammenlignet med kontrollgrupper (p = 0,0173 p = 0,0126, respektivt, fig 3C, D. ), bekreftet at antagonisme av MIR-21 kunne undertrykke AKT og ERK1 /2 aktivering i ferd med å snu EMT og CSC fenotype.
Re-uttrykk for MIR-21 Induced EMT og CSC phenotype, Akkompagnert med Down-uttrykk av PTEN, samt Aktivering av AKT og ERK1 /2
for å bekrefte rollen MIR-21 i regulering svulst EMT og CSC fenotype, ytterligere HSA-MIR-21 etterligner eller etterligner negativ kontroll ble transfektert inn i etablert MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler. Ekspresjonen av MIR-21 økte til mer enn 22 ganger etter HSA-MIR-21 etterligner behandlede, sammenlignet med den negative kontroll (p = 0,0037, Fig. 4A), indikerte at HSA-MIR-21 etterligner transfeksjon kunne øke relative ekspresjon av MIR-21.
Etablerte MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler ble transfektert med hSA-MIR-21 etterligner i en konsentrasjon på 40 nmol i 72 timer. (A) MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler ble behandlet med HSA-MIR-21 etterligner forhøyet ekspresjon av MIR-21, sammenlignet med kontrollgrupper (n1 = n2 = 3; p = 0,00373), etter sanntids RT-PCR-analyse. (BF) Protein nivåer av mesenchymale markører (N-cadherin, vimentin og alpha-SMA) (B), epithelial markør (E-cadherin) (B), CSC markører (ALDH1 og CD44) (C), PTEN (D), p-AKT og AKT (E), så vel som p-ERK1 /2 og ERK1 /2 (E) i angitte celler ble målt ved hjelp av Western blot-analyse, og båndene ble semi-kvantifisert ved anvendelse av ImageJ programvare (F). Beta-aktin eller GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (* Indikerer p 0,05;
★ tyder p 0,001).
For å undersøke om tvungen ny uttrykk for MIR-21 kan indusere EMT og CSC fenotype, ned-regulere uttrykk for PTEN samt aktivere AKT og ERK1 /2 trasé, protein ekspresjon av EMT biomarkører (N-cadherin, vimentin, a-SMA, og E-cadherin), CSC markører (ALDH1 og CD44), PTEN, p-AKT, AKT , p-ERK1 /2, og ERK1 /2 ble målt ved Western blot-analyse. I forhold til de negative kontrollgruppene, tvunget re-uttrykk for MIR-21 økte protein uttrykk for N-cadherin, vimentin, alfa-SMA, ALDH1 og CD44 (p = 0,0136, p = 0,0397, p = 0,0067, p = 0,0002 og p = 0,0006, respektivt, fig. 4B, C, F), mens redusert ekspresjon av E-cadherin (p = 0,0014, fig. 4B F), foreslått at re-ekspresjon av MIR-21 kan indusere EMT og CSC fenotype i etablerte MDA-MB-231 /anti-MIR-21 celler. I mellomtiden, re-ekspresjon av MIR-21 redusert ekspresjon av PTEN (p = 0,0081, Fig. 4 D, F), viste at re-ekspresjon av MIR-21 kan påvirke ekspresjonen av MIR-21 direkte mål på cellene. Videre re-ekspresjon av MIR-21 økte også ekspresjon av p-AKT og p-ERK1 /2 i cellene (p = 0,0008 p = 0,0022, henholdsvis Fig. 4E, F), indikerte at re-ekspresjon av MIR-21 kunne aktivere AKT og ERK1 /2 veier. Disse resultatene støttes at Mir-21 kunne regulere EMT og CSC fenotype, og følge med endringer av PTEN og AKT /ERK1 /2 veier.
MiR-21 Målrettet PTEN i Rever EMT og CSC Phenotype
for å finne ut om uttømming av PTEN kan blokkere MIR-21 antagomir rygging EMT og CSC fenotype, siPTEN eller kontroll SsiPTEN ble transfektert inn i MDA-MB-231 celler. Etter 24 timer ble cellene transfektert med MIR-21 antagomir eller negativ kontroll, og deretter EMT og CSC fenotype ble undersøkt som beskrevet ovenfor. Vi fant at siPTEN signifikant nedregulert ekspresjon av PTEN (p = 0,002, Fig. 5A, E), sammenlignet med SsiPTEN grupper. I samsvar med effekten av MIR-21 antagomir på EMT og CSC fenotype i MDA-MB-231 celler (figur 1 og figur 2..), Antagonisme av MIR-21 også reverseres EMT (N-cadherin, p = 0,0025; vimentin, p = 0,0025; alfa-SMA, p = 0,0003; E-cadherin, p = 0,0308, fig. 5B, E) og CSC fenotype (ALDH1, p = 0,0014; CD44, p = 0,002, fig. 5C, E) i MDA -MB-231 /SsiPTEN celler (
SsiPTEN + miRNA antagomir negative kontrollgrupper kontra SsiPTEN + MIR-21 antagomir grupper
); uttømming av PTEN av siPTEN blokkert MIR-21-antagomir-rygging EMT (N-cadherin, p = 0,0172; vimentin, p = 0,0113, alpha-SMA, p = 0,0015, E-cadherin, p = 0,016, Fig. 5B, E ) og CSC fenotype (ALDH1, p = 0,0042, CD44, p = 0,0004, fig. 5C, E) (
SsiPTEN + MIR-21 antagomir grupper vs siPTEN + MIR-21 antagomir grupper
). Disse resultatene antydet at uttømming av PTEN kan blokkere MIR-21-antagomir -reversing EMT og CSC fenotype, som videre foreslått at antagonisme av MIR-21 kunne målrette PTEN å reversere EMT og CSC fenotype. Videre uttømming av PTEN aktivert MIR-21-antagomir-blokkering AKT og ERK1 /2 trasé (p-AKT, p 0,0001; p-ERK1 /2, p = 0,0037, Fig. 5D, E) (
SsiPTEN + MIR-21 antagomir grupper vs siPTEN + MIR-21 antagomir grupper
), indikerte at AKT og ERK1 /2 trasé er nedstrøms veier av PTEN i å regulere EMT og CSC fenotype.
. MDA-MB-231-celler ble transfektert med siPTEN eller kryptert kontroll SsiPTEN ved en endelig konsentrasjon på 50 nmol i 24 timer. Deretter ble cellene transfektert med HSA-MIR-21 antagomir eller negativ kontroll til en endelig konsentrasjon på 50 nmol i 72 timer. Cellene ble trypsinert, og de relative proteinnivåene av PTEN (A), EMT markører (B), CSC overflatemarkører (C), p-AKT og AKT (D), så vel som p-ERK og ERK (D) ble målt og semi-kvantifisert (E) som nevnt før. De representative plugger fra behandlinger av SsiPTEN pluss MIR-21 antagomir kontroll, SsiPTEN pluss MIR-21 antagomir, og siPTEN pluss MIR-21 antagomir ble vist på bildet. Beta-aktin eller GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (* Indikerer p 0,05;
★ tyder p 0,001).
MiR-21 Regulert EMT og CSC Phenotype, samt Cell Proliferation gjennom AKT og ERK1 /2 Pathways
for ytterligere å undersøke rollene til AKT og ERK1 /2 trasé i MIR-21 regulerer EMT og CSC fenotype, ble MDA-MB-231 /anti-Mir-21 celler transfektert med MIR-21 ligner med en konsentrasjon på 40 nmol i 72 timer, og deretter ble cellene behandlet med LY294002 (en inhibitor av PI3K-AKT) ved 20 umol /l eller U0126 (inhibitor av ERK1 /2) ved 10 pmol /l i 24 timer. Vi bekreftet at LY294002 behandling blokkert re-uttrykk for MIR-21 induserende AKT aktivering (p 0,0001, Fig. 6A, E), mens U0126 behandling avskaffet re-uttrykk for MIR-21 induserende ERK1 /2-aktivering (p 0,0001, figur . 6A, E). Mer interessant, ble gjen uttrykk for MIR-21 induserende EMT og CSC fenotype hemmet av LY294002 (N-cadherin, p = 0,0005; vimentin, p = 0,0005, alpha-SMA, p = 0,0008, E-cadherin, p = 0,0002; ALDH1, p 0,0001, CD44, p 0,0001, fig. 6B, C, E) eller U0126 (N-cadherin, p 0,0001, vimentin, p = 0,0005, alpha-SMA, p = 0,0004, E-cadherin, p = 0,0003; ALDH1, s 0,0001, CD44, p = 0,0005, fig. 6B, C, E) i cellene, indikerte at både AKT og ERK1 /2 veier er behov for for MIR-21 ved indusering EMT og CSC fenotype, noe videre foreslått at AKT og ERK1 /2 veier er to parallelle nedstrøms veier av MIR-21 for regulering EMT og CSC fenotype. Videre har både LY294002 og U0126 har ingen dokumentert effekt på PTEN (p = 0,1208, p = 0,4361, henholdsvis Fig. 6D, E)., Som også støttet at AKT og ERK1 /2 trasé er nedstrøms veier av PTEN
Etablerte MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler ble transfektert med hSA-MIR-21 etterligner i en konsentrasjon på 40 nmol i 72 timer. Deretter ble cellene trypsinert, og behandlet med LY294002 (20 umol /l) eller U0126 (10 umol /l) i 24 timer. (AE) De relative protein nivåene av p-AKT og AKT (A), p-ERK og ERK (A), EMT markører (B), CSC overflatemarkører (C), samt PTEN (D) fra blindprøve, LY294002, og U0126 behandlingsgruppene ble vist, og semi-kvantifisert (E) som nevnt før. Beta-aktin eller GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (* Indikerer p 0,05;
★ tyder p 0,001;
▴ tyder p 0,05). . (F) Virkningene av antagonisme av MIR-21, re-uttrykk for MIR-21, LY294002, og U0126 på celleproliferasjon av celletall (A
vs
B, p = 0,0077; B + C
vs
B + D, p = 0,0091;. B + D
vs
B + D + E, p = 0,0109;.. B + D
vs
B + D + F, p = 0,0031).
i tillegg, for å verifisere rollene til AKT og ERK1 /2 baner i MIR-21 regulerer celleproliferasjon i cellene som er nevnt ovenfor, cellevekst tall i cellene ble beregnet ved 0, 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer etter behandling med celletallet. Vi fant ut at tvang antagonisme av MIR-21 redusert celleproliferasjon i MDA-MB-231 celler (p = 0,0077, Fig. 6F), mens re-uttrykk for MIR-21 forhøyet celleproliferasjon i MDA-MB-231 /anti-MIR -21 celler, i løpet av 0-72 timer (p = 0,0091, fig. 6F). Resultatene antydet at MIR-21 kunne regulere cellen forplantning til en viss grad i MDA-MB-231-celler. I mellomtiden ble begge AKT og ERK1 /2 hemninger nedsatt celleformering (p = 0,0109 p = 0,0031, henholdsvis Fig. 6F)., Noe som antydet at reguleringen av AKT eller ERK1 /2 knyttet til endringer i celle-proliferasjon
Diskusjoner
mirnas er noncoding små RNA som kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [37], [38]. Økende bevis viste at Mir-21 over-uttrykk er påvist i ulike typer kreft hos mennesker, inkludert brystkreft, og er assosiert med EMT [25] – [27] og CSC egenskaper [26], [28]. Men de direkte roller og sentrale molekylære mekanismer av MIR-21 i regulere brystkreft EMT og CSC fenotype er ikke avklart. I denne studien fant vi at antagonisme av MIR-21 i MDA-MB-231 celler reverseres EMT og CSC fenotype, oppregulert uttrykk for PTEN, samt inaktivert AKT og ERK1 /2 veier. Resultatene viste at antagonisme av mir-21 er tilstrekkelig til å reversere EMT og CSC-fenotype ved å modulere ekspresjon av PTEN og AKT /ERK1 /2 trasé, gir noen direkte bevis og molekylære mekanismer som MIR-21 er i stand til å regulere EMT og CSC fenotype .
for å undersøke hvilken rolle MIR-21 i regulering EMT og CSC fenotype av brystkreftceller, antagomir av MIR-21, som spesifikt kan binde til og hemme endogene MIR-21 molekyler, eller sin negative kontroll oligomer , ble transfektert inn i MDA-MB-231-celler. Den antagomir redusert 90% av endogen MIR-21 ekspresjon i cellene (Fig. 1A). Interessant, ble den relative EMT og CSC fenotype reverseres ved antagonisme av MIR-21 (fig 1B-G;. Fig. 2A-J), som i tråd med MIR-21 innebærer å fremme EMT og (eller) CSC fenotype i kreft i bukspyttkjertelen celler [26], [28], thyroid karsinom celler [27], og vår tidligere studier i MCF-7-celler [29]. Sammen med resultatene, antagonisme av MIR-21 betydelig økt ekspresjon av PTEN (Fig. 3A, B, D), så vel som redusert AKT og ERK1 /2-aktivering (fig. 3C, D). Disse resultatene viste at MIR-21 spiller en viktig rolle i mediering EMT og CSC fenotype, ledsage ved å regulere ekspresjon av PTEN, så vel som AKT og ERK1 /2-aktivering.
Deretter vi utforsket de underliggende mekanismene og relative signalmolekyler i antagonisme av MIR-21 rygging EMT og CSC fenotype. I overensstemmelse med det MIR-21 undertrykker funksjonen av tumor suppressor PTEN-ekspresjon ved å binde dets 3′-UTR [20], viste vi at antagonisme av MIR-21 oppregulert PTEN ekspresjon (Fig. 3A, B, D). Som forventet, PTEN ned utfoldelse særlig blokkert MIR-21-rygging EMT og CSC fenotype (Fig. 5B, C, E), bekreftet at antagonisme av MIR-21 utstillinger sin rolle dels ved å fremme PTEN uttrykk, og utvinning av PTEN uttrykk ville redusere dets funksjon av tumor-suppressor.
Videre har vi også funnet at re-ekspresjon av MIR-21 ved MIR-21 etterligner førte til aktivering av AKT og ERK1 /2 trasé (fig. 4E, F) . Mer interessant, behandles cellene med PI3K-AKT eller ERK1 /2-hemmer (LY294002 eller U0126), forbudt MIR-21 ligner gjenvinne EMT og CSC fenotype (Fig. 6B, C, E). Resultatene antydet at effekten av AKT og (eller) ERK1 /2 på MIR-21 regulerende EMT og CSC fenotype, i samsvar med nevnte AKT og (eller) ERK1 /2 veier er nødvendige for å fremme EMT og (eller) CSC fenotype i brystkreft MCF-7-celler [32], bryst epitelceller [33], [34], tykktarmskreftceller [35], livmorhalskreft-celler [32], og ovariekarsinomer celler [36].
Oppsummert våre resultater viste at antagonisme av MIR-21 reverserer EMT og CSC fenotype gjennom AKT og ERK1 /2 trasé inaktivering ved å fremkalle PTEN uttrykk i MDA-MB-231 celler (fig. 7). Denne studien viste en direkte rolle og ny mekanisme av MIR-21 i inversing EMT og CSC fenotype, og informasjonen kan være nyttig å utvikle en ny terapi for behandling av brystkreft i fremtiden.
antagonisme av speil 21 kunne inaktivere AKT og ERK1 /2 trasé antagelig gjennom PTEN oppregulering, og til slutt reversere EMT og CSC fenotype i MDA-MB-231 celler.
Materialer og metoder
reagenser og Antistoffer
Menneske har-MIR-21 (MIMAT0000076) antagomir og negativ kontroll, etterligner og negativ kontroll ble kjøpt fra Ribobio (Guangzhou, Kina). PCR-primere ble syntetisert ved Sangon Biotech (Shanghai, Kina). Sanntid RT-PCR analysesett ble kjøpt fra Takara (Dalian, Kina). Spesifikk siPTEN tomannsboliger og rykke kontroll siRNA sekvens (SsiPTEN) ble kjøpt fra Ribobio. LY294002 og U0126 ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). Lipofectamine ™ 2000 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ALDEFLUOR® Kit ble kjøpt fra Aldagen (Durham, NC, USA). Fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket anti-CD44-antistoff og fykoerytrin (PE) -merket anti-CD24-antistoff ble innkjøpt fra BioLegend (San Diego, CA, USA). Primære antistoffer inkludert kanin antihuman E-cadherin antistoff (No: BS1098, Bioworlde, St. Louis, MO, USA), N-cadherin antistoff (No: BS2224, Bioworlde), vimentin antistoff (No: BS1776, Bioworlde), alfa-SMA antistoff (No: ab5694; Abcam, Cambridge, UK), ALDH1 antistoff (No: ab51028; Abcam), CD44 antistoff (No: BA0321; BOOSTER, Wuhan, Kina), PTEN antistoff (No: BS1304, Bioworlde), AKT antistoff (
