Abstract
Bakgrunn
Den globale forskjellen i kreftforekomst er fortsatt et stort folkehelseproblem. Vi har fokusert på prostatakreft siden mikroskopisk sykdom hos menn er vanlig, men forekomsten av klinisk sykdom varierer mer enn 100 ganger over hele verden. Ca
2 + signalering er en sentral regulator av celledeling, men har fått liten oppmerksomhet i kreftforebygging. Vi og andre har rapportert en sterk reduksjon doseavhengig i forekomsten av prostatakreft og lungekreft blant grupper som er utsatt for bor (B) i drikkevann og mat; og i svulsten og celleproliferasjon i dyre- og cellekultur modeller.
Metoder /hovedfunnene
Vi undersøkte effekten av B på Ca
2 + butikker ved hjelp av kreft og ikke-kreft menneske prostata cellelinjer, Ca
2 + indikatorer Rhod-2 AM og Indo-1 AM og konfokal mikroskopi. I DU-145-celler, inhibering av Ca
2+ frigivelse var tydelig etter behandling med Ringers inneholdende RyR-agonister cADPR, 4CmC eller koffein og de respektive nivåer av BA (50 uM), (1, 10 pM) eller (10, 20 , 50 150 mm). Mindre aggressive kreftceller LNCaP nødvendige 20 uM BA og den ikke-tumorcellelinje PWR1E kreves 150 uM BA å inhibere koffein stimulert Ca
2+ frigivelse. BA (10 uM) og RyR antagonist dantroline (10 uM) var likeverdige i sin evne til å inhibere ER Ca
2+ tap. Flowcytometri og konfokalmikroskopi analyse viste eksponering av DU-145 celler til 50 M BA for en time redusert lagret [Ca
2+] med 32%.
Konklusjon /Betydning
showet B forårsaker en doseavhengig reduksjon av Ca
2 + løslatelse fra ryanodine reseptor sensitive butikker. Dette skjedde på BA konsentrasjoner som finnes i blodet av geografisk atskilte populasjoner. Våre resultater tyder på høyere BA blodet lavere risiko for prostatakreft ved å redusere intracellulær Ca
2 + signaler og lagring
Citation. Henderson K, Stella SL Jr, Kobylewski S, Eckhert CD (2009) Receptor aktivert Ca
2 + utløsing er blokkert av borsyre i prostata kreft celler. PLoS ONE 4 (6): e6009. doi: 10,1371 /journal.pone.0006009
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 17 november 2008; Godkjent: 20 mai 2009; Publisert: 23 juni 2009
Copyright: © 2009 Henderson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet for denne bevilgningen ble finansiert av personlige midler (CE) og dels ved University of California ToxicSubstances forskning og opplæring Program (TSR TP) for delvis støtte av KH og SK. CE er doktorgrads mentor for KH og SK. TSR TP finansieringen var for studentstipend begrenset til student støtte og hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen. konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
en av måtene celler som reagerer på miljømessige stimuli er ved å åpne kanaler mellom områder av lagret kalsium, slik som det endoplasmatiske retikulum (eR), Golgi, og mitokondrier ( MT), som inneholder høye frie Ca
2 + konsentrasjon (500 uM), og cytoplasma, som inneholder lite fri Ca
2 + konsentrasjoner (100 nM) [1]. En rask økning i cytoplasma Ca
2+ kan oppnås ved capacitative kalsium oppføring (CCE) som innebærer frigjøring av lagret Ca
2+ av ryanodine reseptor (RyR) og IP
3 reseptor (IP
3R) i cytoplasma etterfulgt av en strøm av ekstracellulært Ca
2+. CCE aktiverer Ca
2+ bindende proteiner som regulerer en rekke cellefunksjoner, inkludert gentranskripsjon, celleproliferasjon, vesikkel sekresjon, og apoptose [2], [3]. Cytoplasmatiske Ca
2 + konsentrasjoner blir returnert til det normale som Ca
2+, fjernes ved transportører som for eksempel Na
2 + – Ca
2+ veksleren i plasmamembranen, sarkoplasmatisk endoplasmatiske ATPase ( SERCA) i ER-membranen, Ca
2+ uniporter i mitokondriene, og ved binding til høyaffinitets-bindingsproteiner [4], [5]. I denne rapporten presenterer vi bevis for at fysiologiske nivåer av borsyre (BA) hemmer lagret Ca
2 + løslatelse fra RyR agonist sensitive områder.
Boron (B) er det 9
th mest rikelig element i sjøvann (425 mikrometer B) og inntil nylig avvist som biologisk irrelevant [6]. B er bundet til oksygen i naturen og i fysiologiske væsker 98,4% foreligger i form av B (OH)
3-borsyre og 1,6% som B (OH)
4
– borat. Biologi har brukt dette element i strukturen av flere molekyler inkludert: antibiotika i sopp [7]; quorum sensing auto-indus 2 i bakterier [8]; og den rhamnogalakturonan-II-dimer i anlegg [9]. I planter, er B nødvendig for celle forlengelse, blomstring og frøset formasjon og er en integrert del av matplanter. Non-ladet BA krysser plasma membran av rot epidermal cellene inn i cytosol ved passiv diffusjon og dette er tilrettelagt av NIP5; 1 transportører [10]. BA er delvis omdannet til borat i cytosol (pKa 9,6), og transporteres inn Margen ved hjelp av eksport transportøren BOR1 [11], [12]. En human homolog av BOR1 navngitte NaBC1has blitt rapportert å være tilstede i pattedyrcellelinjer, og for å forbedre celle-proliferasjon ved lave konsentrasjoner BA [13], men dette er ennå ikke bekreftet av et annet laboratorium. Virkningen av BA på vekst og celleproliferasjon i ørret, sebrafisk og pattedyr HEK og HeLa-celler som følger en omvendt U-form med høyere konsentrasjoner forårsaker hemming av cellevekst [13] – [15]. Konsentrasjoner på 60 til 100 um BA inhibere celleproliferasjon i prostatakreftceller, mens høye konsentrasjoner på 500 til 1000 um BA er nødvendig for å inhibere proliferasjon av ikke-tumor prostata epitelceller i løpet av den samme tidsperiode [16].
menneske~~POS=TRUNC blod nivåer av BA reflektere den lokale geologien, vannkvalitet, og planter i kosten med et verdens bredt utvalg, fra 2 til 120 mikrometer (21-1232 ng /g våt blod) i fri levende friske menn og kvinner [17 ], [18]. Flere studier på mennesker har observert en reduksjon i risikoen for prostata og lunge cancer, og unormal cervical cytopatologi i forhold til mengden av B inntatt fra mat og vann [19] – [22]. En studie observerte ikke en beskyttende effekt, men skilte seg fra andre studier i å bruke en annen B mat database og estimert B innholdet i enkelte matvarer [23], [24].
biologisk plausibilitet for chemopreventative effekten av BA er støttet av flere linjer med etterforskning. I immunsupprimerte mus, BA tilskudd redusert vekst av transplanterte menneskelig prostatakreft, redusert IGF-1 vevskonsentrasjonen, og senket serum prostata spesifikt antigen nivåer [25]. I cellekultur, BA redusert proliferasjonen av humane kreft prostata cellelinjer på en doseavhengig måte og hemmet cellemigrering og invasjon [16], [26], [27]. Vi har oppdaget at forholdet mellom BA evne til å hemme prostatacancer celleproliferasjon og kalsiumsignalisering etter massespektrometri undersøkelser viste affiniteten av BA for NAD
+ ble redusert ved fosforylering og derfor potensielt utsatt for biologisk regulering [28], [29]. BA ble også vist å være en ikke-konkurrerende inhibitor av ADP-ribosyl cyclase [30]. Dette førte oss til å studere dens innvirkning på NAD
+ /cADPR Ca
2 + utgivelsen veien. Vi viste at farmakologiske nivåer av BA (250 og 1000 uM), men ikke methylboronic syre, redusert NAD
+ stimulert frigjøring av Ca
2+ uten å påvirke frigivelse av kalsium når de påføres på en egen [27]. Det var ikke klart fra disse studiene hvis BA var hemme Ca
2 + utgivelsen ved å forstyrre NAD
+ konvertering til cADPR, blokkerer utgivelsen av Ca
2 + butikker, eller forstyrrer CCE. Det er også hevet muligheten for at BA konsentrasjoner i normale blodområdet kan være i stand til å hemme Ca
2 + løslatelse fra ryanodine reseptor (RyR) sensitive butikker. Her viser vi at fysiologiske nivåer av BA hemme Ca
2 + løslatelse fra RyR responsive butikker i menneskelige prostata epitelceller og lavere luminal Ca
2 + nivåer.
Metoder
Cell kulturer
Eksperimenter brukes prostata kreft cellelinjer DU-145 og LNCaP og den ikke-tumorcellelinje PWR1E. Celler ble dyrket og opprettholdt i cellekulturplater ved 37 ° C i 95% luft og 5% CO
2 fuktet inkubator. For konfokale eksperimenter ble cellene dyrket på glass dekkglass i 24 timer før gjennomføring av analyser og studert ved en konfluens på mindre enn 80%. DU-145 og PWR1E celler ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia) og LNCaP var en gave fra Dr Allen Pantuck av Department of Urology, Geffen School of Medicine ved University of California, Los Angeles. RPMI cellekulturmedier ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og L-glutamin (200 mM). PWR1E ikke-tumorceller ble opprettholdt i keratinocytt-medium inneholdende streptomycin (100 ug /ml), L-glutamin (200 mM), 2,5 ug rekombinant human EGF, og 25 mg bovint hypofyseekstrakt (Gibco, Carlsbad, CA). Bor-fattig medium ble fremstilt ved bruk av bor-spesifikke ionisk ionebytterharpiks, Amberlite IRE-743 (Sigma) som tidligere beskrevet [16] og modifisert som følger. Ni g autoklavert IRA-743 ionebytterharpiks ble tilsatt til 500 ml medium og blandet på en bane rotator ved 75 til 100 rpm i 15 til 20 timer ved 9 ° C.
Måling av Ca
2 + transienter
Lagring Ca
2+ endringer ble overvåket ved hjelp av kalsiumfølsomme fargestoffet Rhod-2, AM ester (Biotium, Hayward, CA) som akkumuleres i organeller. Rhod-2, har AM ester en Kd på 1 mM, og har vist seg å fordeler, særlig i mitokondriene, men som vi viser, i andre organeller i tillegg (fig. 1). Vi har også brukt ER Tracker grønn og Mito Tracker grønn (Molecular Probes, Carlsbad, California) i forbindelse med Rhod-2, Am ester. De er svært spesifikke fluorescerende markører for det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier, respektivt. Vi analyserte Ca
2 + endringer i respons til BA og ulike agonister ved å velge områder av interesse i celler som overlappet den røde Rhod-2 Ca
2 + etikett med grønne ER tracker (Fig. 1A) [31] – [33]. Rhod-2, AM ester ble fremstilt som en 1 mM stamløsning i DMSO og fortynnet i enten komplett RPMI-medium eller komplette keratinocytt media til 3 uM. Celler ble inkubert med Rhod-2 AM ester (5 uM) og ER eller Mt Tracker (0,5 uM, 250 nM henholdsvis) i RPMI eller keratinocytt media i 30 minutter ved 37 ° C. Ca
2 + utgivelsen ble stimulert ved hjelp av agonister i kombinasjon med ulike konsentrasjoner av BA i Ringers løsning. Bilder ble samlet inn med en Zeiss 510 LSM 5 Pascal montert på en oppreist mikroskop (Zeiss Axioplan 2) er utstyrt med en Axoplan X63 (NA 0,95) nedsenking i vann objektiv. En HeNe laser ble brukt til å opphisse Rhod-2 ved 543 nm. 488 nm fra en laserdiode ble brukt til å opphisse ER eller Mt Tracker. Utslippet ble oppsamlet på et fotomultiplikatorrør gjennom en 560 nm LP-filteret for Rhod-2 og en 505 LP-filteret for ER og Mito bane. Ytterligere forstørrelse tidsserier, og bakgrunnen subtraksjon ble kontrollert ved hjelp av Zeiss LSM oppkjøpet programvare. Alle bildene ble anskaffet som 12 bit.
A. To DU-145 celler merket med rød fluorescerende intracellulær kalsium fluorophore, Rhod-2, og grønn fluorescerende endoplasmatiske retikulum etikett, ER tracker. Gul indikerer overlapping av Ca
2 + og ER og sirkelen er den regionen av interesse (ROI) analysert i disse forsøkene. Pilene viser organ: Nucl (kjerne), NUC (nucleus), ER (endoplasmatiske retikulum) B. To DU-145 celler merket med rød fluorescerende intracellulær Ca
2 + fluorophore, Rhod-2, og grønn fluorescerende mitokondrie etiketten, Mito tracker. Gul viser overlappingen av kalsium og mitokondrier. Pilene viser organ:. Nucl (kjerne), NUC (nucleus), mt (mitokondrier)
Analyse av Ca
2 + utgivelsen hjelp konfokalmikroskopi
BA behandlinger ble brukt Ca
2 + gratis Ringer løsning utarbeidet etter ultrarent vann for å fjerne B [16], [34]. Ca
2+ frigjøring fra RyR ble aktivert ved tilsetning av enten 25 uM cADPR til 10 uM digitonin permeabiliserte celler, eller 20 mM kaffein eller 100 uM 4-klor-m-kresol (4cmc) i intakte celler [35] [36]. Inhibering av Ca
2+ frigivelse ble oppnådd ved anvendelse av 10 uM dantrolen eller varierende konsentrasjoner av BA i nærvær av en agonist [37]. SERCA ble inhibert ved anvendelse av 10 uM cyclopiazonic syre (CPA) [2]. Alle legemiddel søknadene var for en 30 sekunders varighet på kalsium gratis Ringer løsning (143 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl
2, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA-2H
2o, en mM EGTA) for å se Ca
2 + løslatelse fra butikkene uten tilførsel av ekstern Ca
2+. Drug søknad ble etterfulgt av en tre minutters vask i Ringer-oppløsning inneholdende kalsium (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 10 mM glukose, 10 mM HEPES). Løsninger ble levert til perfusjon kammeret med en hastighet på 1 ml /min ved hjelp av en enkelt-pass, gravitasjonsmating perfusjon system. Konfokale bilder ble tatt hver andre og begynte 2 minutter før den første behandlings anvendelse for å etablere en basislinje for fluorescensintensitet. Endringen i fluorescens-intensitet (f) forårsaket av legemidlet søknaden ble sammenlignet med et gjennomsnitt utgangsmålinger som besto av tre målinger før påføring av medikamentet (fo). Alle målinger ble normalisert til basislinjen på denne måte ved hjelp av forholdet mellom f-fo /fo. Vanligvis 6-10 celler ble analysert i en synsfelt og alle eksperimenter ble utført på et minimum av tre uavhengige preparater. Rekkefølgen av narkotika søknaden var basert på en innledende eksperiment med påfølgende agonist-only programmer. Hvis to
nd anvendelse av agonist forårsaket en lavere Ca
2 + utgivelsen enn en
st, celler ble behandlet med agonist pluss BA først. Dette unngås muligheten for at målt hemming av Ca
2 + utgivelsen på grunn av BA var delvis på grunn av ildfaste celler laget det ved tidligere behandling med agonist.
Analyse av lagrede kalsiumnivåer
DU-145 prostatakreftceller ble behandlet med BA i 1 til 72 timer i media strippet av bor ved bruk av Amberlite IRA-743 ionebytterharpiks (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som beskrevet tidligere. Like før analyse celler ble fjernet fra platen ved anvendelse av 1% trypsin fordøyelse, sentrifugert, og merket i 45 minutter i standard media med 3 uM Rhod-2 AM ester for lagring Ca
2+ analyse. For å kunne overvåke cytoplasmiske Ca
2 + nivåer, ble celler merket med 5 mM Indo-1 AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 45 minutter. Merkede celler ble deretter vasket og resuspendert i 1 ml normal media. Fluorescens ble analysert ved hjelp av en Beckton Dickinson BD-LSR I analytisk strømningscytometer. Rhod-2 eksitasjon ble oppnådd med en 514 nm laser argon og analysert i den (581 nm) FL-2-kanalen. Indo-en var begeistret med en UV laser (351 nm) og analysert på 400 nm (FL5) og 510 nm (FL4) band-pass filter. Resultater for Indo-1 merkede celler blir gitt som prosenter av fluorescens (FL5 /FL4). Forward og side scatter ble brukt for å separere ut mobilnettet fragmenter [38]. Raw flowcytometri data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (Treestar Software, San Carlos, CA, USA). Resultatene er presentert som% Ca
2 + nivåer sammenlignet med ubehandlede celler. Lagring Ca
2 + nivåer ble også analysert i BA behandlet og ikke-behandlede celler ved å sammenligne Ca
2+ lagring tømming i respons til 100 mikrometer thapsigargin hjelp konfokalmikroskopi [39].
Statistisk analyse av data
data er presentert som gjennomsnitt ± SD og ble analysert ved anvendelse av Students parede eller uparet t-test eller enveis ANOVA for multiple sammenligninger med Dunnetfs multiple sammenlignings post hoc-test ved anvendelse av Graphpad Prism 4,0. En p-verdi 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Ligningen for ikke-lineære ett sted binding (hyperbel) Y = Bmax * X /(K
d + X) ble brukt til å beregne K
d og bmax verdier ved hjelp Graphpad programvare.
Kjemi og utstyr
B ble fjernet fra vann og media benytter metoder tidligere beskrevet [13]. Koffein, 4-CMC, ATP, CPA, dantrolen, thapsigargin, cADPR, digitonin og borsyre ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) fortynnet i kalsium-fri Ringers løsning for å sikre at hvis DMSO var tilstede nivåer var ikke større enn 0.1 %. Alle oppløsninger ble fremstilt friskt før perfusjon. Superfusjons med 0,1% DMSO i kalsium gratis Ringer løsning ikke påvirke ER Ca
2 + nivåer eller bilde svar.
Resultater
Formålet med studien var å fastslå om fysiologiske konsentrasjoner av BA hemme frigjøring av Ca
2+ fra RyR sensitive butikker i menneskelig prostata kreft og ikke-kreft epitelceller. DU-145 celler ble lastet med Rhod-2 og ER tracker eller Mito tracker for å avgjøre om Rhod-2 oppdelt i ett eller begge kamre. Det var ikke mulig å avgrense Ca
2+ signalering fra ER versus mitokondriene i levende celler ved hjelp av konfokal mikroskopi. Rhod-2 merket Ca
2+ i mitokondriene, ER, kjerne, og andre områder i cellen (Fig. 1A-B). I våre forsøk, ble en kombinasjon av ER Tracker og Rhod-2 som brukes til å definere våre regioner av interesse på områder av lagret Ca
2 + (Fig. 1A). Dette området inkludert Ca
2 + butikker ligger i ER og mitokondriene (Fig. 1A-B). Bruk av BA fra 0,1-1000 mikrometer alene ikke demonstrere en umiddelbar målbar effekt på lagring Ca
2+ hjelp konfokalmikroskopi (data ikke vist).
Borsyre hemmer Ca
2+ utgivelse i respons på ryanodine reseptoragonister
for å finne ut om BA hemmet Ca
2+ utgivelse fra RyR, behandlet vi DU145 cellene med tre forskjellige RyR agonister i kombinasjon med BA. Konkurransedyktige ligandbindende analyse viste BA var et enkelt nettsted reversibel kompetitiv hemmer av cADPR, en endogen agonist av RyR (Fig. 2A-C). Likevekts-dissosiasjonskonstanten (K
D) for cADPR var 15,10, men i nærvær av BA øket til 49,39. Hemming av BA ble reversert ved å øke konsentrasjonen av cADPR og tilstedeværelsen av BA ikke endre maksimalt antall bindingssteder (bmax) (tab 1).
A. 50 M BA hemmet 25 mikrometer cADPR indusert Ca
2 + utgivelsen (n = 6; *** p 0,001). B. Konkurranse ligandbindende studie viste BA var en overkommelige konkurransedyktig antagonist av cADPR i et enkelt område modell. Konsentrasjoner av BA ble holdt på 50 mikrometer. Ved lave konsentrasjoner cADPR BA forskjøvet Ca
2+ frigivelse respons til høyre, men dette ble reversert ved høyere konsentrasjoner cADPR og den maksimale respons (Bmax) ble ikke endret. Hvert datapunkt er gjennomsnittet av n = 6. R
2 er 0,9155 og 0,8606 for cADPR uten og med BA, henholdsvis.
Vi deretter analysert effekten av BA på andre RyR agonister i intakte celler. Vi først brukt koffein [20 mM] en agonist som forsterker RyR følsomhet for sin opprinnelige ligand, Ca
2+. Som svar på to påfølgende anvendelser av koffein, den andre frigjørings var noe større enn den første (fig. 3A). Denne sekvens ble deretter gjentatt med BA tilsatt i kombinasjon med koffein i den andre applikasjonen. Resultatene av disse forsøk viser at BA redusert Ca
2+ frigjøring på en doseavhengig måte 10-150 uM BA (fig. 3B-F). Vi undersøkte deretter effekten av BA på 4CmC, en direkte agonist av RyR. Påfølgende anvendelser av 50 M 4CmC resultert i tilsvarende Ca
2+ meldingen (fig. 4A). Som observert med koffein, redusert BA 4CmC stimulert Ca
2+ frigjøring på en doseavhengig måte (fig. 4B-E). Begynte imidlertid inhibering ved 1 pM BA og nådde et maksimum ved 10 uM BA.
A. Ca
2+ frigivelse i DU-145-celler i respons til etterfølgende anvendelse av 20 mM kaffein (n = 6, * p = 0,0168). B. 10 mm BA betydelig hemmet Ca
2 + utgivelsen (n = 6, ** p 0,01). C. 20 mikrometer M BA betydelig hemmet Ca
2 + utgivelsen (n = 6, * p = 0,0163). D. 50 mikrometer BA betydelig hemmet Ca
2 + utgivelsen (n = 6, ** p = 0,0042). E. 150 mikrometer BA betydelig hemmet Ca
2 + utgivelsen, n = 6, *** p = 0,0001. F. kombinert dataanalyse som viser hemmende dose respons effekt av BA på koffein stimulerte Ca
2 + utgivelsen, (n = 6 per konsentrasjon, ** p 0,01). Figurene 2-9 representerer hver bar middelresponsen av 6 eksperimenter (n = 6) replikert 3 ganger. Linje skanner på høyre side av hver søylediagram er representative svar fra en enkelt eksperiment.
A. Påfølgende anvendelser av 4-CMC endret ikke kalsium-frigjøring respons (n = 6, NS). B. 0,1 mikrometer BA hemmet ikke Ca
2+ utgivelse. C. 1,0 mikrometer BA hemmet Ca
2 + utgivelsen (n = 6, * p 0,05). D. 10 mm BA hemmet Ca
2 + utgivelsen (n = 6, *** p = 0,0005). E. Kombinert dataanalyse som viser en doseavhengig Ca
2 + utgivelsen svar (n = 6 per konsentrasjon (** p. 0,01)
Tidligere studier har vist at den hemmende effekten av BA på celle-proliferasjon på IC
50 for DU-145-celler var omtrent 10% mindre effektiv på mindre aggressiv LNCaP prostatakreft-cellelinje. i tillegg BA var ikke i stand til å oppnå en 50% reduksjon i proliferasjon i ikke-tumor PWR1E prostata epitelceller i eksperimenter med opptil 4 ganger IC
50 for DU145 [16]. Vi undersøkte disse cellelinjene for å fastslå om BA var også mindre effektive i å hemme koffein sensitive Ca
2 + utgivelsen. Hemming av Ca
2+ frigivelse som reaksjon på koffein i LNCaP prostatatumorceller forekommet i løpet av 20 uM-150 uM BA (fig. 5A-D). Således, LNCaP-celler var mindre følsomme overfor BA i forhold til DU-145. LNCaP-celler ble ikke reagerer på 4CmC behandling (ikke vist). Den PWR1E ikke-svulst, hyperplasic prostata cellelinje som kreves for 150 uM BA å inhibere koffein stimulert Ca
2+ frigivelse (fig. 6A-D). PWR1E celler var ikke-responsive til 4CmC behandling (ikke vist).
A. 20 mikrometer BA hemming av kalsium meldingen (n = 6, * p = 0,0226). B. 50 M BA hemming av Ca
2 + utgivelsen (n = 6, ** p = 0,0019). C. 150 mikrometer BA hemming av koffein indusert Ca
2 + utgivelsen (n = 6, *** p 0,0001). D. Kombinert data som viser konsentrasjonsavhengig hemming av koffein stimulert frigjøring (n = 6, ** p 0,01)
A.. Sammenhengende koffein applikasjoner i PWR1E prostata celle. (N = 6, NS). B. 50 mikrometer BA og koffein indusert Ca
2 + utgivelsen viser ingen hemming (n = 6, NS). C. 150 mikrometer BA hemmet koffein indusert Ca
2 + utgivelsen (n = 6, ** p = 0,0029). D. kombinerte data viser ingen doserespons og hemming bare 150 mikrometer (n = 6, * p 0,05).
Borsyre hemmer cyclopiazonic syre indusert Ca
2+ utgivelse fra ER
frigjøring av ER Ca
2 + butikker i enkelte ikke-eksiterbare celler kan stimuleres ved hjelp av cyclopiazonic syre (CPA) som inhiberer SERCA på en måte som ligner på thapsigargin, men kan vaskes ut [40] . BA (0,1 til 1000 pM) i seg selv ikke endret lagring kalsiumnivå i løpet av tiden løpet av eksperimentet (ikke vist). Svar på rad anvendelser av CPA [10 mm] ikke forfalle (Fig. 7A). Samtidig anvendelse av CPA og 1 pM BA forårsaket en signifikant reduksjon i utslipp og 10 uM BA forårsaket nær fullstendig hemning (fig. 7B-D). Vi testet deretter effekten av dantrolen, en kjent inhibitor av RyR på Ca
2+ frigivelse av CPA. Vi fant at 10 mm dantrolen hemmet CPA stimulert Ca
2 + utgivelsen på et nivå som tilsvarer 10 mm BA (Fig. 8A-B).
Celler ble testet med CPA + BA etterfulgt av CPA. A. Fortløpende anvendelser av CPA endret ikke Ca
2 + utgivelsen (n = 6, NS). B. 0,1 mikrometer M BA hemmet ikke CPA stimulert Ca
2 + utgivelsen (n = 6, NS). C. 1,0 mikrometer BA hemmet CPA stimulert Ca
2 + utgivelsen (n = 6, ** p = 0,0037). D. 10 mm BA hemmet CPA stimulert Ca
2 + utgivelsen (n = 6, *** p 0,0001)
A.. Celler ble testet med CPA (10 mm) + dantrolen (10 mm), etterfulgt av CPA (n = 6, *** p 0,0001 B. BA hemmet CPA stimulert Ca
2+ utgivelse i en konsentrasjonsavhengig måte The.. hemmende effekt av dantroline og BA var tilsvarende på 10 mm, CPA (n = 6, ** p 0,01).
Borsyre behandling senker lagring [Ca
2 +] uten effekt på cytoplasma [Ca
2 +]
Våre resultater viser BA hemmet Ca
2 + utgivelsen føre oss til å analysere relative [Ca
2 +]
st nivåer ved hjelp av Rhod-2 fargede celler og relative [Ca
2 +]
CYT nivåer ved hjelp Indo-1 fargede celler og flowcytometri. eksponering av DU-145 celler til BA [10-50 mikrometer] i 24 timer påvirket ikke [Ca
2 +]
cyt (fig. 9A). Men reduksjoner [Ca
2 +]
st (22%) skjedde med 10 mm BA resulterte i en 32% reduksjon i [Ca
2 +]
m ved 50 uM BA i en time (fig. 9B). heller ikke høyere BA konsentrasjonen, eller behandling med 10 uM BA opp til 72 timer resulterte i ytterligere reduksjon i [Ca
2 +]
st (fig. 9BC). Vi gjennomførte confocal målinger av thapsigargin stimulert Ca
2+ meldingen etter dU-145 celler ble forbehandlet med BA (50 mm) i 24 timer og observert en 35% reduksjon i Ca
2+ frigjøring (fig. 9D).
A. Relativ [Ca
2 +]
cyt etter eksponering for 0, 10 og 50 mikrometer BA i 24 timer (n = 5, NS). B. [Ca
2 +]
p som prosent av 0 behandling i DU-145 celler behandlet med 0-250 mikrometer BA i 24 timer. Borsyre [10-50 mikrometer] redusert ER kalsiumnivå med mer enn 22% -32% sammenlignet med ubehandlede celler (n = 5, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). C. Reduksjon av [Ca
2 +]
st i DU145 celler behandlet med 50 mikrometer BA fra 1-72 timer (n = 5, ** p 0,01). D. Confocal måling viste forbehandling av celler med BA i 24 timer senket thapsigargin stimulert Ca
2+ utgivelse sammenlignet med ubehandlede celler (n = 6, *** p 0,0001)
Diskusjon.
Denne studien rapporterer det uventede funn at lagret Ca
2 + utgivelsen og luminal nivåer kan moduleres ved fysiologisk relevante nivåer av BA i dU-145 prostatakreft epitelceller. Dette er relevant for vår forståelse av kreftrisiko ettersom blod nivåer av BA bestemmes av forbruket av B i drikkevann og plante avledet matvarer [17]. Det er sannsynlig å være den første cellulær respons overfor B eksponering og således et utgangspunkt for å forstå hvordan risikoen for prostatakreft og lungekreft reduseres med B på en doseavhengig måte, [16], [21], [22]. BA utstilt attributtene for en klassisk antagonist i at det ikke har en umiddelbar effekt på Ca
2 + utgivelsen når den brukes av seg selv og dens effekter var agonist avhengig. BA avhengig av dose hemmet Ca
2+ utgivelse som svar på cADPR, en endogen agonist av RyR, og agonister koffein og 4-CMC (Fig. 2-5). I vår konkurrerende ligand-bindende analyse, viste BA karakteristisk for en enkeltsete-antagonist i at det var reversibel ved høyere konsentrasjoner av cADPR (fig. 2B). BA økt K
d, 15,1 til 49,4, men ikke påvirke bmax (tabell 1). BA er blitt vist å binde seg til cADPR ved høye konsentrasjoner, men BA evne til å inhibere cADPR, koffein og 4CmC indusert Ca
2+ frigivelse indikerer at ved fysiologiske konsentrasjoner BA kan bindes til cADPR bindingssetet på RyR stabilisering av Ca
2+ kanal i sin inaktive tilstand [30].
spredning av LNCaP-celler er blitt rapportert å være omkring 10% mindre følsomme og PWR1E ikke-tumorceller er mer enn fire ganger mindre følsom overfor BA enn DU-145 celler [16]. Vi har også observert dette mønsteret av følsomhet i BA evne til å hemme koffein stimulert Ca
2+ utgivelse. Den laveste effektive konsentrasjon for DU-145 var 10 mm BA, LNCaP var 20 mikrometer BA, og PWR1E var 150 mikrometer BA (Fig 3F, 5D . 6D). I tillegg til nedsatt respons til BA, både LNCaP og PWR1E var ikke-responsive til 4CmC behandling. RyR-isoformer 1 og 2, men ikke 3 er kjent for å bli aktivert av 4CmC i noen cellelinjer [41]. Det er mulig at cellelinje Forskjellene var på grunn av forskjeller i RyR-isoformer eller deres ekspresjon. LNCaP-cellelinjene er blitt vist å uttrykke RyR 1 og 2, men ikke 3 [42]. Vi klarte ikke å finne studier i litteraturen som identifiserte RyR isoformer i DU-145 eller PWR1E celler i noen prostata cellelinje.
nyre funksjonstester har vist BA reabsorberes via nyrene i ikke-gravide og gravide [43]. Oppdagelsen av en electrogenic, spenningsregulert bikarbonat natrium-coupled borat co-transporter (NaBC1) i rottenyre tubuli kan forklare denne observasjonen, men det har ennå ikke blitt bekreftet av et annet laboratorium. NaBC1 ekspresjon indusert proliferasjon i HEK og HeLa-celler ved aktivering av MAPK-reaksjonsveien 16 timer etter behandling [13]. Det er ikke kjent på dette tidspunkt hvorvidt NaBC1 er uttrykt i prostata tumor og ikke-tumorcellelinjer, men forskjeller i dens ekspresjon er løftet opp som en mulig forklaring for variasjonen i celle følsomhet overfor BA mellom prostata tumor og ikke-tumorceller [10 ].
for ytterligere å utforske BA evne til å hemme lagret Ca
2 + utgivelsen vi testet dens virkninger i nærvær av CPA (fig. 7-8). CPA hemmer SERCA kanal som fører til tømming av Ca
2 + lagrer [44]. Vår studie viste at BA dose avhengig blokkert CPA mediert Ca
2+ utgivelse i DU-145 celler. Vi har også observert en reduksjon av lagrings Ca
2 + nivåer med 22% til 32% i 10 til 50 mikrometer BA behandlet DU-145 celler sammenlignet med ubehandlede celler. STIM proteiner er involvert i å utløse Ca
2+ innstrømning i ER [45] – [48]. Hvis BA reduserer Ca
2 + lekkasje gjennom RyR kanaler store tap ved lekkasje kan oppstå gjennom presenilins og andre ikke-kanal proteiner som ikke stimulerer STIM proteiner. Dette vil resultere i redusert lagret Ca
2 + nivåer som er i stand til å signalisere påfylling.
Betydningen av Ca
2 + i cellesyklus kontroll og spredning er et veletablert område på kreftforskning, men det har ikke blitt studert som et virknings i kreftforebygging [49] – [51]. BA evne til å modulere celleproliferasjon har vært knyttet til endringer i ekspresjonen av cykliner og MAPK-reaksjonsveien i DU-145, HEK293 og HeLa-celler [13], [16], [26]. Det er imidlertid mulig at disse effektene forekommer som respons på reduksjoner i Ca
2+ frigivelse eller lagring. I prostata kreft LNCaP-cellelinje, Humez observert at IGF (5 ng /ml), noe som øker cellevekst, økt ER [Ca
2 +]
ER, mens TNF-alfa (1 ng /ml), hvilken reduserer celleproliferasjon, redusert [Ca
2 +]
eR [52].
Som konklusjon, BA er tidligere blitt rapportert å redusere risikoen for prostatakreft hos mennesker og redusere tumorvekst og prostata kreftcelle proliferasjon, migrering og invasjon. Våre resultater viser at fysiologiske nivåer av BA sperre agonist stimulert frigjøring av lagret Ca
2+ på en doseavhengig måte og lavere lagret Ca
2 + lagernivå.
