Abstract
Bakgrunn
Foreløpig er det godt fastslått at kreft oppstår i kronisk betent vev. En rekke av NOD-lignende reseptorer (NLRs) danner inflammasomes, intracellulære multiprotein komplekser kritiske for å generere modne pro-inflammatoriske cytokiner (IL-1 p og IL-18). Som kronisk betennelse av gastrisk mucosa er en konsekvens av
Helicobacter pylori-infeksjon
, undersøkte vi rollen til genetisk polymorfisme og ekspresjon av gener som er involvert i den NLR signalveien i
H. pylori
infeksjon og relaterte magekreft (GC).
Materialer og metoder
Femti-en genetisk polymorfisme ble genotypet i 310 etniske kinesere (87 non-Cardia GC saker og 223 kontroller med funksjonell dyspepsi). I tillegg ble genekspresjon av 84 molekyler som er involvert i signalveien NLR vurderes i THP-1-celler utfordret med to
H. pylori s
tog, GC026 (GC) og 26695 (gastritt).
Resultater
CARD8
-rs11672725,
NLRP3
-rs10754558,
NLRP3
-rs4612666,
NLRP12
-rs199475867 og
NLRX1
-rs10790286 viste signifikant sammenheng med GC. På multivariat analyse,
CARD8
-rs11672725 forble en risikofaktor (OR: 4,80, 95% KI: 1,39 til 16,58). Videre
NLRP12-
rs2866112 økt risiko for
H. pylori
infeksjon (OR: 2,13, 95% KI: 1,22 til 3,71). Statistiske analyser vurdere felles effekten av
H. pylori
infeksjon og de valgte polymorfismer avdekket sterke assosiasjoner med GC (
CARD8
,
NLRP3
,
CASP1 Hotell og
NLRP12
polymorfismer). I genekspresjon analyser, ble fem gener som koder NLRs betydelig regulert i
H. pylori
-challenged celler (
NLRC4
,
NLRC5
,
NLRP9
,
NLRP12 Hotell og
NLRX1
). Interessant, vedvarende oppregulering av
NFKB1
med samtidig nedregulering av
NLRP12 Hotell og
NLRX1
ble observert i
H. pylori
GC026-utfordret celler. Videre, NF-kB målgener som koder for pro-inflammatoriske cytokiner, kjemokiner og molekyler som er involvert i kreftutvikling var markert oppregulert i
H. pylori
GC026-utfordret celler.
Konklusjoner
Nye assosiasjoner mellom polymorfismer i NLR signalveien (
CARD8
,
NLRP3
,
NLRP12
,
NLRX1
, og
CASP1
) og GC ble identifisert i kinesiske individer. Våre genetisk polymorfisme og genekspresjon resultater markere relevansen av NLR signalveien i magekreftutvikling og dens nære samspill med NF-kB
Citation. Castaño-Rodríguez N, Kaakoush NO, Goh KL, Fock KM, Mitchell HM (2014) The NOD-like receptor Signale Pathway i
Helicobacter pylori
Infeksjon og relaterte Gastric Cancer: En case-control studie og genuttrykk Analyser. PLoS ONE 9 (6): e98899. doi: 10,1371 /journal.pone.0098899
Editor: David M. Ojcius, University of California Merced, USA
mottatt: 02.03.2014; Godkjent: 08.05.2014; Publisert: 05.06.2014
Copyright: © 2014 Castaño-Rodríguez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av The Cancer Council of New South Wales, Australia (Grant no.66 /04). NEI. Kaakoush er støttet av en Early Career fellesskap fra National Health and Medical Research Council, Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den samlede forekomsten av magekreft (GC) varierer mye mellom land. Ifølge globale kreft statistikk, er totalt 952,000 nye GC saker og 723,000 GC relaterte dødsfall anslått å ha skjedd i 2012, sto for 6,8% av de totale krefttilfeller og 8,8% av totalt antall kreftrelaterte dødsfall [1]. Over 70% av nye tilfeller og dødsfall forekommer i utviklingsland, med de høyeste forekomst rapporteres i Øst-Asia, Øst-Europa, og Sentral- og Sør-Amerika [2].
Den bakterielle patogen
Helicobacter pylori
er en viktig etiologisk faktor for GC (IARC, 1994), men tidligere studier tyder på at i tillegg til
H. pylori
infeksjon og kostholdsfaktorer, vert genetikk bidra til GC [3]. Genetisk polymorfisme har dukket opp de siste årene som determinanter for sykdom mottakelighet og alvorlighetsgrad, noe som er særlig i gastrointestinal kreft [4]. Derfor kan polymorfismer i gener involvert i medfødt og adaptiv immunitet spiller en viktig rolle i patogenesen av
H. pylori
infeksjon og utvikling av
H. pylori
-relaterte komplikasjoner inkludert GC.
Germ linjer kodet reseptorer kjent som mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS) er en del av det medfødte immunsystemet og er avgjørende for påvisning av invariante mikrobielle motiver kjent som patogen -associated molekylære mønstre (PAMPs). PRRS har blitt delt inn i fem forskjellige genetiske og funksjonelle clades: nukleotid-bindende oligomeriseringsprosessen domene (NOD) -lignende reseptorer (NLRs), Toll-lignende reseptorer, C-type lectin reseptorer, retinsyre-induserbar genet (RIG) -I-lignende reseptorer og fraværende i melanom 2 (AIM2) -lignende reseptorer [5] [6].
NLR familien ikke bare gjenkjenne PAMPs men også skade-forbundet molekylære mønstre (demper) i cytoplasma, som er endogene ligander produsert etter vev skade eller celledød [7]. Den NLRs karakteristiske strukturen inneholder en sentral nukleotid-binding og oligomerisering (NACHT) domene som er til stede i alle NLR familiemedlemmer, en C-terminal leucine-rich gjentar (Lrrs) og en N-terminal caspase rekruttering (KORT) eller pyrin (PYD ) domene. Basert på fylogenetisk analyse av Nacht domener, ble det fastslått at NLR familien består av tre underfamilier: 1) NOD familie som inkluderer NOD1-2, NOD 3 /NLRC3, NOD4 /NLRC5, NOD5 /NLRX1 og CIITA, 2) de NLRPs inkludert NLRP1-14 (også kjent som NALPs), og 3) den IPAF underfamilien som består av IPAF (NLRC4) og NAIP [7]. NLRP3 inflammasome, den mest fullstendig karakterisert inflammasome, består av NLRP3 scaffoldprotein, apoptose forbundet flekk-lignende protein (ASC) og caspase-1. NLRP3 samhandler og rekrutterer adapteren ASC via PYD-PYD interaksjon [8]. Denne interaksjonen fører til rekruttering av caspase-1, en intracellulær aspartat bestemt cystein protease, som senere skulle føre til modning og frigjøring av proinflammatoriske cytokiner som IL-1β og IL-18.
I
H. pylori
infeksjon, de første fire fysisk-kjemiske barrierer er slimlaget, mage epitelceller, de TLRs og NLRs. Et begrenset antall studier har vurdert samspillet mellom NLR signalveien og
H. pylori
. For eksempel, en innledende studie av Basak et al. [9] viser at ikke bare
H. pylori
lipopolysakkarid (LPS) aktiverer caspase-1, men at dette caspase-1-aktivering er involvert i LPS-indusert IL-1β modning. Senere Hitzler et al. [10] viste at
H. pylori-infeksjon
aktiverer caspase-1, som fører til IL-1β /IL-18-behandling og sekresjon, både i dyrkede dendrittiske celler (DCS) og
in vivo
. Konsekvent, to nyere studier, med humane mage cellelinjer, bekreftet økt uttrykk av caspase-1, IL-1β og IL-18 i
H. pylori
-infected celler [11], [12]. Videre en fersk undersøkelse utført av Kim et al. [13] har vist at sekresjon av IL-1β ved DC infisert med
H. pylori
krever TLR2, NOD2 og NLRP3 inflammasome.
Derfor tidligere studier viser tydelig at i respons til
H. pylori
, inflammasome avhengig caspase-1 aktivering er avgjørende for å generere modne proinflammatoriske cytokiner som er avgjørende for Th1 responser assosiert med mage immunpatologi. Gitt at lite er kjent om rollen inflammasomes og andre molekyler som er involvert i NLR signalveien som svar på
H. pylori
infeksjon, og at funksjonelt relevante polymorfismer i gener av denne arm av immunsystemet har potensial til å påvirke størrelsen og retningen av vertsresponsen mot infeksjon, undersøkte vi rolle NLR signalveien, inkludert inflammasome- relaterte molekyler, i
H. pylori
-relaterte GC utvikling ved å vurdere 51 genetisk polymorfisme i kinesiske enkeltpersoner, en kjent høy risiko befolkningen for GC, og adressering genuttrykket av 84 molekyler involvert i NLR signalveier i en monocyttisk cellelinje ved eksponering for
H . pylori
.
Materialer og metoder
Genotyping av Polymorfisme involvert i NOD-like receptor Signale Pathway
Etikk uttalelse.
Denne studien var godkjent av human Etisk komité (HREC) ved University of New South Wales (UNSW) (HREC 08115 og HREC 02144). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver enkelt rekruttert til studien.
forsøkspersonene.
Tema var etniske kinesiske personer som gjennomgikk øvre gastrointestinal endoskopi på Changi General Hospital (Singapore) og Universitetssykehuset Malaysia (Kuala Lumpur), mellom januar 2004 og april 2007. Pasienter som er kjent for å være infisert med humant immunsviktvirus eller som hadde blitt foreskrevet ikke-steroide antiinflammatoriske midler, anti-mikrobielle midler eller syredempende midler i to måneder før rekruttering ble ekskludert.
åtti-sju pasienter nylig diagnostisert med en primær ikke-Cardia GC (International Classification of Diseases, 9
th revisjon, kode 151) basert på histologisk bekreftelse ble invitert til å delta i studien. Kontrollgruppen omfattet 223 individer diagnostisert med funksjonell dyspepsi (FD), som ble definert som vedvarende eller tilbakevendende symptomer (smerte eller ubehag sentrert i den øvre abdomen) i fravær av organisk sykdom (inkludert ved øvre endoskopi), i samsvar med Roma II klassifiseringssystemet [14].
Helicobacter pylori
gjenkjenning.
H. pylori
IgG antistoffer i disse kinesiske personer ble bestemt med en in-house enzymbundet immunsorbent analyse [15] og immunoblot (MPD Helico Blot 2.1, MP Biomedicals, Australia).
Polymorfisme utvalg.
Elektroniske databaser (PUBMED, Scopus, Science Direct, Ovid, Biosis Previews, Scirus databaser, CINAHL, IMBIOMED, Scielo og syriner) ble søkt opp til februar 2013 for polymorfismer involvert i NLR signalveien som var assosiert med kreft, smittsom sykdom eller var funksjonelt relevant. Femti en polymorfismer i 6 gener, som ble rapportert å ha en mindre allel frekvens . 1% i National Center for Biotechnology Information (NCBI) dbSNP, ble valgt ut for analyse (tabell S1 i tabell S1)
genotyping teknikker.
for genotyping av de 51 utvalgte polymorfismer i NLR signalveien for hver enkelt inkludert i studien, genomisk DNA ble ekstrahert fra perifere fullblodsprøver ved hjelp av QIAamp Blood DNA Mini Kit som beskrevet av produsenten (Qiagen, Chadstone, Australia). DNA ble rehydrert i sterilt vann og normalisert til 10 ng /mL for tilpasset SNP genotyping gjennom anvendelse av matrise assistert laser desorpsjon ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri, den Sequenom MassARRAY iPLEX? Assay (San Diego, CA , USA) [16], [17] ved Australian Genome Research Facility Ltd, St Lucia, University of Queensland, Australia.
en polymorfisme som ikke kunne være med i Sequenom MassARRAY iPLEX analysen, kjent som
NLRP3-
42 bp-VNTR ble genotypet gjennom standard PCR. Primere ble utformet med Oligo Primer Analysis Software versjon 6.71 (Molecular Biology Insights, Inc, Colorado Springs, USA). Eksperimenter ble utført ved anvendelse av 2720 termosykler (Applied Biosystems, Foster City, USA). PCR produktene ble utsatt for 1.5% agarosegel elektroforese og visualisert under UV gjennomlysnings hjelp av Gel Doc 2000-system (Bio-Rad, Hercules, USA). Primersekvensene og termiske sykkelforholdene for genotyping av dette polymorfisme er beskrevet i tabell S2 i i tabell S1.
Fire polymorfismer (
CARD8
-rs2043211,
CARD8
-rs6509368
CARD8
-rs12984929 og
NLRP3
-rs10754558) genotypet ved MALDI-TOF massespektrometri ble tilfeldig valgt for bekreftelse av resultatene ved hjelp av real-time PCR. Primersekvensene og termiske sykkelforholdene er skissert i tabell S2 i tabellene S1. Som en validering av metoden implementert for genotyping av
NLRP3-
42 bp-VNTR, ble sekvense analyser utført i 10% av tilfeldig utvalgte studieprøver, ved Ramaciotti Centre, UNSW, Australia.
Statistisk analyse.
uparede Student
t
-test ble brukt til å analysere de kliniske kjennetegn. Den direkte telling metoden ble brukt for å estimere genotype og allelfrekvensene. Avvik fra Hardy-Weinberg likevekt (HWE) ble testet ved hjelp av chi-kvadrat godhet-of-fit test (χ
2). Bestemmelse av koblingsulikevekt (LD) var basert på en sannsynlighetsforhold test hvor betydningen av den observerte sannsynligheten forholdet blir funnet ved å beregne null fordelingen av dette forhold i henhold til hypotesen om binding likevekt, ved hjelp av en permutasjon prosedyre [18]. Haplotype slutning ble utført ved hjelp av den forventning-Maksimering (EM) algoritme for multi-locus genotypiske data [19]. De odds ratio (OR) og 95% konfidensintervall (KI) ble beregnet ved hjelp av Fishers eksakte sannsynligheten test (to-tailed
p
-verdier). For å korrigere for konfunderende faktorer, en binær logistisk regresjon (LR) justert med
H. pylori
status og kjønn ble utført.
P
-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Kvalitet filtre for utelukkelse av polymorfismer fra den statistiske analysen inkluderte ringe priser under 95% og avvik fra HWE. Dataene ble analysert ved hjelp av programmer Arlequin versjon 3.1 [20], GraphPad Prism versjon 5.02 (GraphPad Software Inc, San Diego, USA) og SPSS versjon 19.0.0. (SPSS Inc, Chicago, USA)
Gene Expression av molekyler som er involvert i NOD-like receptor Signale Pathway
pattedyrcellekultur
den menneskelige monocytic leukemi cellelinje THP-1 (kode: TIB-202). (American Type Culture Collection, Manassas, USA), ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Mulgrave, Australia), 1 mM natriumpyruvat (Invitrogen), 2500 mg /l natriumbikarbonat (Invitrogen ) og 100 mikrogram /ml penicillin-streptomycin-løsning (Invitrogen). Celler ble opprettholdt i 25-cm
2 vevsdyrkingskolber (Greiner-Bio-On, Frickenhausen, Tyskland).. Ved 37 ° C med 5% CO
2
Bakteriell kultur
H pylori
belastning GC026 (
CagA
+,
Cage
+,
cagL
+,
cagT
+
Vaca
s1 m1 +,
Baba
+,
oipA
+,
dupa
+ og
Saba
+) ble isolert fra en GC pasient ved Universitetssykehuset i Malaysia, Kuala Lumpur [21], [22].
H. pylori
belastning 26695 (
CagA
+ og
Vaca
s1m1 +) ble isolert fra en pasient med gastritt [23] (ATCC kode 700392). Begge
H. pylori
stammer ble dyrket i to dager på hesteblod agarplater (Blood Agar Base No.2 supplert med 6% sterilt defibrinert hesteblod (Oxoid, Heidelberg West, Vic., Australia) ved 37 ° C i en anaerob krukke som inneholdt en gassdannende kit (Oxoid) for å gi en microaerobic atmosfære av 6% O
2, 10% CO
2 og 84% N
2.
Infeksjon analysen.
THP-1-celler ble sådd ut på en 6-brønners kulturplate i en konsentrasjon på 5 x 10
5-celler /ml og deretter differensiert til makrofager med forbol myrastate acetat (Sigma-Aldrich) i 72 timer [24]. forut for bakteriell infeksjon, ble pattedyrceller inkubert i antibiotika-fritt medium.
H. pylori
stammene GC026 og 26 695 ble deretter tilsatt til mediet ved en multiplisitet av infeksjon på 1, og inkubert i 6 timer ved 37 ° C og 5% CO
2. Den bakteriekonsentrasjon som ble tilsatt ble bestemt basert på en standardkurve og optisk tetthet (OD) avlesninger ved 595 nm ved anvendelse av en Bio-Rad mikroplateleser modell 550 (Bio-Rad). Den faktiske konsentrasjonen tilsatt ble bekreftet ved å telle kolonidannende enheter (CFU) dyrket på hest blodagarplatene etter serie fortynning av bakteriesuspensjonen.
RNA ekstraksjon, cDNA forberedelse og PCR arrays.
Etter infeksjon, ikke-utfordret og
H. pylori
-challenged THP-1-cellene ble anvendt for isolering av mRNA ved bruk av Qiagen RNeasy Mini Kit som beskrevet av produsenten (Qiagen). For analyse av genekspresjonen av 84 molekyler som er involvert i NLR signalveien, ble cDNA syntetisert fra 0,8 ug total-RNA ved hjelp av RT
2 First Strand cDNA-Kit (Qiagen), og videre analysert ved hjelp av Menneskelig Inflammasome RT
2 Profiler PCR array (PAH-097R) (Qiagen) som anbefalt av produsenten. Genuttrykk profiler ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter av
H. pylori
GC026-smittet,
H. pylori
26695-infisert og tilsvarende ikke-infiserte (kontroll) prøver. Forsøkene ble utført ansette Rotor-Gene Q cycler (Corbett biovitenskap, Doncaster, Australia).
For genuttrykk dataanalyse, ble implementert ΔΔ Ct-basert metode for relativ kvantifisering ved hjelp av Web-baserte RT
2 Profiler PCR Array data Analysis versjon 3.5 (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). Minst to-fold endringer (≥2, ≤0.5) og
P
-verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
SDS-PAGE og Western blotting
THP -1 celler ble sådd, differensiert og infisert ved en MOI på 1, som tidligere beskrevet. Proteiner ble ekstrahert ved bruk av RIPA-buffer, separert på 12% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese-geler og overført til metanol behandlede polyvinylidin difluoride membraner ved hjelp av Trans-blot-celle-overføringssystem (Bio-Rad). Membranene ble immunolabeled med kanin-anti-humane polyklonale antistoffer mot NLRX1 (1:200) eller mus anti-humane monoklonale antistoffer mot β-aktin (1:1000) (Santa Cruz). Geit-anti-kanin og anti-mus IgG-antistoffer koblet til HRP (1:2000; Bio-Rad) ble brukt som sekundære antistoffer, henholdsvis. Membraner ble undersøkt i samsvar med Pierce ECL Western blotting Substrat protokollen (Thermo Scientific, Scoresby, Australia).
Resultater
kliniske karakteristika
De kliniske kjennetegn ved forsøkspersonene inkludert kjønn,
H. pylori
smittestatus og median alder er vist i tabell S3 i tabell S1. Mann kjønn ble funnet å være mer dominerende i GC pasienter enn i FD-kontroller, og viser en positiv sammenheng med utviklingen av GC i denne etniske kinesiske befolkningen (OR: 2,15, 95% KI: 1,29 til 3,58,
P
-verdi: 0,0036).
H. pylori
infeksjon ble funnet å være til stede i 68,7% av individer i denne studien (73/87 GC pasienter og 140/223 FD kontroller). Sammenligning av utbredelsen av
H. pylori
infeksjon i GC pasienter og FD kontroller viste at
H. pylori
infeksjon var en risikofaktor for utvikling av GC (OR: 2,38, 95% KI: 1,41 til 3,99,
P
-verdi: 0,0001). Selv om pasientene i denne studien ble matchet i henhold til 5-års aldersgrupper, median alder av GC pasienter (65,3 år) var betydelig høyere enn for FD kontroller (54,3 år) (
P
-verdi: . 0,0001)
polymorfisme i gener som er involvert i NOD-like receptor signale~~POS=TRUNC pathway er forbundet med magekreft i etniske kinesere Personer
Femti-en polymorfismer i gener som er involvert i NLR signalveien var genotypet i 310 etniske kinesiske individer (87 GC tilfeller og 223 FD kontroller). Samtalen frekvensen av alle de valgte polymorfismer var 97-100% i denne studien. Alle polymorfismer i NLR signalveien ble funnet å være i HWE i kontrollgruppen som viser ikke-signifikant χ
2 verdier med unntak av
CARD8
-rs12984929 (χ
2: 35,98),
CARD8-
rs4802445 (χ
2: 5,87) og
CARD8-
rs6509368 (χ
2: 5,43). Tjue en polymorfismer i
NLRP3 product: (n = 5),
NLRP12 product: (n = 3),
NLRX1 product: (n = 3),
ASC
(n = 4) og
CASP1 product: (n = 6) ble funnet å være ikke-polymorfe i denne etniske kinesiske befolkningen (tabell S1 i i tabell S1).
allel og genotypefrekvensene som vel som ORS og 95% konfidensintervall for de resterende 27 polymorfismer er vist i tabell 1 og tabell S4 i tabellene S1.
CARD8
-rs11672725 TT genotype viste en sterk sammenheng med GC i bivariate statistisk analyse (OR: 4,80, 95% KI: 1,39 til 16,58). I tillegg til
CARD8
-rs11672725, ytterligere fire polymorfismer viste border resultater i bivariat analyse (
NLRP3
-rs10754558,
NLRP3
-rs4612666,
NLRP12
-rs199475867 og
NLRX1
-rs10790286) (tabell 1). Ytterligere multivariate statistiske analyser, justere for
H. pylori
infeksjon og mannlig kjønn, viste at
CARD8
-rs11672725 TT genotype forble en risikofaktor for GC i denne etniske kinesiske befolkningen (tabell 2).
haplotype-baserte analyser er en kraftig tilnærming å dissekere arkitektur av komplekse sykdommer. I denne studien, EM-algoritmen identifisert 25 haplotyper med en frekvens 0,01 i GC tilfeller (tabell S5 i tabell S1). Ved hjelp av den store haplotype i kontrollgruppen som referanse haplotype, to
CARD8-NLRP12 plakater (Hap1 og Hap8), en
NLRP3 plakater (Hap3) og tre
NLRX1-CASP1
(Hap21, 23 og 24) haplotyper ble funnet å øke risikoen for GC i denne etniske kinesiske befolkningen. Interessant, havner Hap1
CARD8
-rs11672725 T-allelet, og Hap21 og Hap23 havn
NLRX1
-rs10790286 C-allelet, som viser samsvar med resultatene oppnådd fra allel og genotype analyser.
Polymorfisme i gener som er involvert i NOD-like receptor Signale Pathway er forbundet med
Helicobacter pylori
Infeksjon i etniske kinesere personer
Gitt at
H. pylori
er kjent for å være en viktig risikofaktor forbundet med GC, ble ytterligere analyser utført for å vurdere sammenhengen mellom genetisk polymorfisme involvert i NLR signalveien og
H. pylori
infeksjon. Interessant, våre etniske kinesere case-control studie viste at
NLRX1
-rs10790286,
NLRP12
-rs2866112,
NLRP12
-rs4419163 og
ASC
-rs8056505 var assosiert med en signifikant større risiko for
H. pylori
infeksjon i disse individene (tabell S6 i tabell S1). Multivariat statistisk analyse bekreftet at
NLRP12
-rs2866112 var forbundet med en økt risiko for
H. pylori
i kinesiske individer (OR: 2,13, 95% KI: 1,22 til 3,71)
Joint Effekt av
Helicobacter Pylori
infeksjon og genetisk polymorfisme Markert øker risikoen for magekreft i. etniske kinesiske Individer
Ytterligere analyser ble utført for å vurdere ikke bare nærvær eller fravær av de valgte polymorfismer men også
H. pylori
status i forhold til risikoen for GC, i et forsøk på å bestemme eksistensen av biologisk interaksjon i form av synergi eller antagonisme. Påfallende, enkeltpersoner huser ti av de valgte polymorfismer (
CARD8
-rs10405717,
NLRP3
-rs12079994,
NLRP3
-rs3806265,
NLRP3
-rs4612666,
NLRP12
-rs2866112,
NLRP12
-rs4419163,
NLRX1
-rs10790286,
CASP1
-rs2282659,
CASP1
-rs530537 og
CASP1
-rs61751523) og infisert med
H. pylori
ble observert å være mest utsatt for GC, de fleste av disse ORS ligger i området 4,0-5,0 (tabell 3). I motsetning til dette, i fravær av
H. pylori
infeksjon,
CARD8
-rs2043211 betydelig redusert risiko for GC (OR: 0,19, 95% KI: 0,06 til 0,63).
Helicobacter pylori
Påvirker uttrykk av flere molekyler som er involvert i NOD-like receptor Signale Pathway
for ytterligere å karakterisere effekten av
H. pylori
på molekyler som er involvert i den NLR signalveien, vurderte vi uttrykket av gener 84 som koder for NLRs, andre inflammasome komponenter, negative regulatorer, pro-inflammatoriske cytokiner, pro-inflammatoriske caspaser og molekyler som er involvert i nedstrøms signalering, i THP-1- avledede makrofager etter eksponering for to forskjellige
H. pylori
stammer (GC026 og 26695). I
H. pylori
GC026-utfordret THP1 celler, 49-genene ble uttrykt forskjellig sammenlignet med kontrollgruppen (tabell S7 i tabellene S1 og fig S1 i fig S1). Av disse, var statistisk signifikant oppregulering og nedregulering av minst to-ganger funnet i 17 og 28 gener, respektivt (tabell 4 og 5). Trettifem genene ble uttrykt forskjellig mellom kontrollgruppen og gruppen eksponert for
H. pylori
26695 (Tabell S7 i tabell S1 og Figur S2 i figur S1). Av disse var statistisk signifikant oppregulering og nedregulering av minst to ganger funnet i 5 og 23 gener, henholdsvis (tabell 4 og 5).
Helicobacter pylori
Stammer Associated med magekreft og gastritt fører til forskjellige uttrykk nivåer av cytokiner og kjemokiner
Gitt at betennelse er et kjennetegn på magekreftutvikling, vi videre analysert uttrykket av proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner ved eksponering til to
H. pylori
stammer. Uttrykket av ni gener som koder for pro-inflammatoriske cytokiner (
IFNB1
,
IL1B
,
IL12B
,
IL6
,
IL33
og
TNF
) og kjemokiner (
CXCL1
,
CXCL2, CCL5
) var signifikant oppregulert i THP-1 celler utfordret med både
H. pylori
GC026 og 26695 stammer (Tabell 4). Videre en intens immunrespons (
CXCL1
,
CXCL2
,
CCL5
,
IL6
,
IL12B
,
TNF Hotell og
IFNB1
) ble igangsatt mot
H. pylori
GC026 (figur 1A). Interessant, en rekke gener som koder for chemokiner (
CCL2 Hotell og
CCL7
) og cytokiner (
IL18
,
TNFSF11 Hotell og
CD40LG
) ble nedregulert i
H. pylori
-challenged THP-1 celler (tabell 5).
A) Gene uttrykk for cytokiner og chemokiner i
H. pylori
-challenged THP-1 celler, B) Gene uttrykk for NOD-lignende reseptorer i
H. pylori
-challenged THP-1 celler, C)
NFKB1
uttrykk i
H. pylori
-challenged THP-1 celler og D)
PTGS2 Hotell og
BIRC3
uttrykk i
H. pylori
-challenged THP-1 celler. Fold-endring (2∧ (-Delta Delta Ct)) er normalisert genuttrykk (2∧ (-Delta Ct)) i THP-1 celler utfordret med
H. pylori product: (GC026 og 26695) delt normalisert genuttrykk (2∧ (-Delta Ct)) i sine respektive kontrollgruppen. Fold-regulering representerer fold-endring resulterer i en biologisk meningsfull måte. Fold-change-verdier større enn en indikerer opp-regulering, og den fold-regulering er lik fold-endringen. Fold-change verdier som er mindre enn en indikere nedregulering, og fold-regulering er den negative inverse av fold-endring. Fold-forskjell sammenlignet med kontrollgruppen viser en *
P
-verdi 0,05 og **
P
-verdi 0,01.
P
-verdier ble oppnådd med en t-test.
Helicobacter Pylori
infeksjon resulterer i oppregulering av
NFKB1
med samtidig Merket nedregulering av
NLRP12 Hotell og
NLRX1
Tretten gener som koder NLRs ble vurdert i denne studien, inkludert medlemmer av IPAF underfamilien (NAIP, NLRC4), NLRPs ( NLRP1, NLRP3-6, NLRP9, NLRP12) og nikker (NOD2, NLRC5, NLRX1 og CIITA) (Figur 1b). Ekspresjonen av fem gener som koder NLRs var signifikant regulert i H. pylori-utfordret celler (NLRC4, NLRC5, NLRP9, NLRP12 og NLRX1) (tabell 5). Av disse NLRP12 (fold regulering: 0,03, p-verdi: 0,016298) og NLRX1 (fold regulering: 0,02, p-verdi: 0,01762) ble markert nedregulert i H. pylori GC026-utfordret celler. Som en validerings teknikk, ytterligere Western blot analyser undersøker NLRX1 uttrykk, ble gjennomført. Konsekvent, redusert NLRX1 nivåene ble funnet i THP-1 celler utfordret med både H. pylori GC026 og 26695 (Hjelpemiddel Informasjon Figur S3).
Gitt at NF-kB er negativt regulert av NLRP12 og NLRX1, vi videre sammen uttrykk for
NFKB1 Hotell og
RELA
mellom
H. pylori
GC026- og 26695-utfordret celler. Bemerkelsesverdig, selv om
RELA
viste reduserte nivåer i THP-1 celler eksponert for både
H. pylori
stammer (fold regulering: 0,49,
p
-verdi: 0,044673 og brett regulering: 0,26,
p
-verdi. 0,131017 for
H pylori
GC026 og 26 695, henholdsvis), statistisk signifikant oppregulering av
NFKB1
ble bare observert i
H. pylori
GC026-utfordret celler (fold regulering: 2,50,
p
-verdi: 0,006825). (figur 1C)
Helicobacter Pylori
Øker Expression of
PTGS2 Hotell og
BIRC3
uttrykk av andre molekyler som er involvert ikke bare i NLR signalveien, men også i kreftutvikling ble også analysert ved å sammenligne THP-1 celler svar på begge
H. pylori
stammer. Interessant,
PTGS2
var signifikant oppregulert i THP-1 celler ved eksponering til både
H. pylori
stammer,
H. pylori
GC026-utfordret celler (fold regulering: 54.03,
p
-verdi: 0,0247) viser signifikant høyere uttrykk nivåer sammenlignet med
H. pylori
26695-utfordret celler (fold regulering: 19,56,
p
-verdi: 0,016089) (figur 1d). Videre en andre gen som er involvert i kreftutvikling,
BIRC3
, var utelukkende oppregulert i
H. pylori
GC026-utfordret celler (fold regulering: 12,28,
p
-verdi: 0,001638). (figur 1D)
Diskusjoner
GC er nå ansett som en multifaktoriell prosess, hvor bakteriell, miljømessige og verts genetikk faktorer er involvert ved forskjellige stadier i kreft patofysiologi. Foreløpig er det vel etablert at kreft oppstår i kronisk betent vev, og dette er spesielt merkbar i mage- og tarmkanalen [4]. Som kronisk betennelse av gastrisk mucosa er en konsekvens av
H. pylori
infeksjon og denne bakterien er i utgangspunktet rettet av PRRS, undersøkte vi rollen av molekyler involvert i NLR signalveien i
H. pylori
infeksjon og relaterte GC.
Så vidt vi vet, er dette det første rapporterte bevis for at polymorfismer involvert i NLR signalveien er forbundet med en økt risiko for GC i en befolkning. pylori
infeksjon. Tabell S1. Tabell S2. Tabell S3. Tabell S4. Tabell S5.
