Abstract
Bakgrunn
Å forutsi prognose av prostatakreft sykdom gjennom analyse av genuttrykk mottar økende interesse. I mange tilfeller er slike analyser basert på formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) kjerne nål biopsi materiale som Gleason gradering for diagnosen er gjennomført. Siden hver pasient har vanligvis flere biopsiprøver, og siden Gleason gradering er en operatøravhengig prosedyre som er kjent for å være vanskelig, ble virkningen av operatørens valg av biopsi evaluert.
Metoder
Flere biopsiprøver fra 43 pasienter ble evaluert ved hjelp av en tidligere rapportert gen signatur av IGFBP3, F3 og VGLL3 med potensial prognostisk verdi i å estimere total overlevelse ved diagnostisering av prostatakreft. En fire multiplex ett-trinns QRT-PCR test kit, designet og optimalisert for å måle signaturen i FFPE- kjerne nål biopsiprøver ble brukt. Samstemmighet av genuttrykk nivåer mellom primære og sekundære Gleason svulst mønstre, samt prøver godartet vev, ble analysert.
Resultater
genuttrykk nivåer av IGFBP3 og F3 i prostatakreft epitel celle- inneholder vev som representerer den primære og sekundære Gleason mønstrene var høy og konsistent, mens den lave uttrykt VGLL3 viste mer variasjon i sine uttrykk nivåer.
Konklusjon
vurderingen av IGFBP3 og F3 genuttrykk nivåer i prostata kreft vev er uavhengig av Gleason mønstre, noe som betyr at effekten av operatørens valg av biopsi er lav
Citation. Peng Z, Andersson K, Lindholm J, Bodin jeg, Pramana S, Pawitan Y, et al. (2014) Operatør Dependent Valg av prostatakreft Biopsi har begrenset innvirkning på en Gene signaturanalyse for den svært uttrykte gener IGFBP3 og F3 i Prostate Cancer Epitelceller. PLoS ONE 9 (10): e109610. doi: 10,1371 /journal.pone.0109610
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 04.06.2014; Godkjent: 01.09.2014; Publisert: 08.10.2014
Copyright: © 2014 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Uppsala Bio (https://www.uppsalabio.com/), den svenske Cancer Society (http: //www.cancerfonden.se/sv/Information-in-English/), Kongen Gustaf V Jubilee Foundation (https://www.rahfo.se/Metamenyn/In-English/) og Stockholm fylkestinget (http: //www.sll.se/om-landstinget/Information-in-English1/). De bevilgende myndighet gitt støtte i form av lønn for Zhuochun Peng, Karolinska Institutet, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerer interesser: Dr. Chunde Li er en av grunnleggerne, aksjonær og nestleder av styret i Chundsell Medicals AB, et nystartet selskap som tar sikte på å utvikle en Prostatype ® QRT-PCR kit basert på tidligere rapportert signatur studie nevnt i referanser. Han er også en av oppfinnerne av svenske patent (SE 536352), som eies av Chundsell Medicals AB. Zhuochun Peng fungerer som en vitenskapelig konsulent og produktsjef for Chundsell Medicals AB, i tillegg til å være en aksjonær. Hun er også en av oppfinnerne av en svensk patent (SE 536352), som eies av Chundsell Medicals AB. Karl Andersson arbeider som statistikk konsulent for Chundsell Medicals AB. Han er tilknyttet Ridgeview Instruments AB, som er en kontraktsutvikler for Chundsell Medicals AB. Listen avslørt konkurrerende interesse endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Å forutsi prognose av kreft sykdom ved hjelp av genuttrykk analyse er en tilnærming rapporterte i et økende antall studier [1]. For mange kreftdiagnoser, er en praktisk og tilgjengelig prøvetype formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) materiale fra enten biopsimateriale eller kirurgisk fjernet svulstvev. For prostatakreft (PCA), FFPE- biopsier er lett tilgjengelig i de kliniske rutine patologi laboratorier og egnet for slike analyser. Men i mange tilfeller flere biopsier er tilgjengelige for hver enkelt pasient, og genekspresjon analyse utføres vanligvis på bare én prøve pr pasient. Dette betyr at patologen har å velge hvilke biopsi for å analysere.
Gleason Score (GS) karaktersystemet er den dominerende histopatologiske gradering metode for prostatakarsinom rundt om i verden, både i forskning og i klinisk rutine. Gleason score er summen av Gleason graderinger av de vanligste og den nest vanligste kreft mønstre. GS er en av de viktigste kliniske parametre for å indikere prognose for overlevelse for prostata kreftpasienter. Det er imidlertid en stor gråsone i GS 7 når det gjelder overlevelse forskjeller: for eksempel pasienter med GS 3 + 4 har en mye bedre prognose enn pasienter med GS 4 + 3 [2]. Det er en vanlig merke at Gleason gradering, selv når evaluert av dyktige patologer, er en avhengig av operatøren metode. Dette fører til risiko for rapportering av ikke-samstemmige resultater på samme tumor materiale, særlig når diskriminerende 3 + 4 fra 4 + 3 [3]. Denne typen avhengighet Operatøren kan ha en innvirkning på analyse av genuttrykk.
En fersk rapport fra vårt laboratorium viste at genekspresjon underskrift av IGFBP3, F3 og VGLL3 kunne anslå prostatakreftpasienter «total overlevelse ved diagnose [4]. De tre gener ble valgt på en trinnvis måte fra en utgangs sett av 641 stamcelle gen prediktorene. Derfor denne signaturen potensielt fanger stamcelle tilbøyelighet eller «stemness «av kreftceller uavhengig av histopatologiske subtype [4]. Det ble evaluert på en svensk kohort av 189 PCA pasienter diagnostisert mellom 1986 og 2001 med nesten fullført oppfølgings samlet overlevelses-data. I dette kullet ble 78% av pasientene primært behandles med hormonbehandling bare. Genuttrykket signaturen ble vist tilstrekkelig til å kategorisere pasienter i høy-risiko, middels risiko og lav risiko subtyper.
IGFBP3, F3 og VGLL3 genet signaturen ble identifisert ved hjelp av tynn nål aspirasjon (FNA) cytologiprøvene . Den nåværende klinisk praksis for prostatakreft diagnose er å bruke FFPE- kjerne nål biopsiprøver. En fordel med FFPE- prøvene er at de lett kan arkiveres og at mange årskull har lang tid oppfølgings kliniske data, som i stor grad forenkler kliniske studier. Selv om den utpakkede RNA fra FFPE-prøver kan være av relativt lav kvalitet, har flere nyere studier vist lovende resultater når utnytte degradert RNA hentet fra arkiv FFPE-prøver for å kvantifisere genuttrykk nivåer av optimaliserte QRT-PCR-metoder [5] – [7]. Et eksempel er Prostatype QRT-PCR kit, som er utviklet og optimalisert for å måle genuttrykk nivåer av et gen signatur av IGFBP3, F3 og VGLL3 spesielt i FFPE-prøver.
I analysen av RNA uttrykk nivåer i FFPE- biopsiprøver, er det en rekke faktorer som har innvirkning på resultatene. Hver biopsi har en annen fraksjon av tumormateriale og lagringsforholdene kan ha påvirket RNA kvalitet på forskjellige måter. Til at det er en rekke faktorer i den analytiske prosedyre som vil forårsake variasjon, slik at RNA-ekstraksjon effektivitet, pipetteringsutstyr feil, reagens stabilitet over tid, urenheter, forurensing og så videre.
I lys av variabilitet og avhengighet operatør av Gleason ballen rangering, undersøkte vi ekspresjonsnivået av IGFBP3, F3 og VGLL3 i flere biopsier fra samme pasient, og fokusert på variasjon relatert til meget valg av hvilken biopsi som skal analyseres. Dette gjorde det mulig å vurdere effekten av operatørens valg av prøven på målte genuttrykk nivå.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studien protokollen ble godkjent av Forskningsetisk komité Karolinska universitetssykehus (godkjenningsnummer: 00-164) og ble utført i samsvar med de etiske prinsippene beskrevet i 1964 Helsinkideklarasjonen
Informert skriftlig samtykke for generell bio-bank materiale samling. ble innhentet fra alle deltakerne i henhold til den svenske bio-bank lov, før deres inkludering i studien.
FFPE prostata kjerne nålbiopsier
FFPE prostata kjerne nål biopsi prøver ble samlet på tidspunktet PCa diagnose i henhold til rutinemessig prosedyre som brukes ved Aleris Diagnostik AB (Aleris Medilab) i Stockholm, Sverige. For hver pasient, ble 6-10 kjerne nålbiopsier tatt for Gleason gradering [2]. Biopsier fra 43 pasienter med diagnosen PCa mellom 2004-2007 hvor brukt i denne studien. Frem til slutten av 2013, 22 av disse pasientene hadde dødd av PCA 10 døde av andre sykdommer og 11 var fortsatt i live. Alle biopsier hadde blitt lagret i Aleris Medilab biobanken anlegget på rette for FFPE-prøver i minst 6 år før bruk i denne analysen.
Prøvepreparering og RNA ekstraksjon
prøveopparbeidelse prosessen før til RNA ekstraksjon er beskrevet trinn for trinn, som følger
trinn en:.. Seksjonering av FFPE-prøver
FFPE kjerne nålbiopsier ble kuttet i ulike seksjoner og ble festet på frostet glassplater i hovedsak i henhold til rutine histopatologiske protokoller [8], bortsett fra at DNase /RNase fritt vann ble anvendt, og det trinn som smeltet parafin etter tørkeseksjoner ble utelatt. Den første delen av kvalifiserte 5 mikrometer tykkelse ble H E farget delen, ble samlet på glassplater uten DNase /RNase forurensning og brukes for RNA ekstraksjon
Trinn b: Merking og kvantifisere kreft område
En digital patologi lysbilde scanner (iscan Coreo, Ventana Medical Systems, Inc.) ble benyttet for bildebasert dokumentasjon av den markerte kreft regionen skrapes og analysert. Først den opprinnelige H E farget glass lysbilde ved hjelp av et mikroskop, som fungerer som et «kart» som guidet kreftcellene skraping prosedyre
Trinn c: sikling. kreft område
Bruk av merket H . E farget glass lysbilde som et kart, de tilsvarende områder av ufargede 10 mikrometer tykke FFPE- seksjoner ble identifisert. For hvert Gleason mønster, et område på minst 10 mm
2 kreftcelle som inneholdt vev ble skrapet inn DNase /RNase-frie mikro-sentrifugerør ved hjelp av en ny engangs skalpell for hver prøve som skal ekstraheres. Flertallet av skrapet prøvene inneholdt mer enn 70% kreft epitelceller.
Eksempler på målinger
For hver prøve ble målinger, tumor materiale fra en type av patologisk mønster (Gleason svulst mønster eller godartet mønster) ble samlet, noen ganger fra ulike biopsier fra samme pasient, i en ampulle for videre analyse. Dette betyr at patologer oppsamlet kreft områder med den samme histopatologisk typen av celler fra en eller flere av biopsier for å høste tilstrekkelig vev for den analytiske fremgangsmåte. Prosentandelen av tumor materiale i hver kreftcelle inneholdende prøve ble vurdert og bekreftet ved patologer ved hjelp av digitalt skannet fra H 0,37; 2,61 /0,71, og for VGLL3, de var 5,12; 0,36; 5,91 /3,76. Basert på dette, til den typiske variant av delta Ct-verdier fra løp kjøres på grunn av den analysen som sådan ble anslått til å være to standardavvik, dvs. 0,84 for IGFBP3, 0,74 for F3 og 0,72 for VGLL3.
Figur 1D , E, viser F histogrammer av Diff (delta Ct) for de tre signatur gener når en sammenligner primærtumor mønster med godartet vev. I denne sammenligningen, IGFBP3 konsekvent gitt verdier tilsvarende den Diff (delta-Ct) innenfor de primære og sekundære cancerprøver fra hver pasient (figur 1D). Faktisk er den primære mønsteret var nesten like lik den godartet mønster som til den sekundære mønster. For F3, den primære-benign likheten var mindre enn den primære videregående likheten (figur 1E). VGLL3 viste store Diff (delta-CT) avvik mellom primær Gleason svulst mønster og godartet prøven (figur 1F).
En alternativ måte å illustrere forskjellene i genuttrykk mellom primære og sekundære kreft mønstre er å gjøre scatterplots av delta Ct-verdier fra målinger av disse kreftprøver (figur 2). I denne visningen, er det klart at sammenlignbarhet er bra, spesielt for lav delta Ct verdier, med unntak av noen få slengere (røde sirkler). Den lavere grad av sammenlignbarhet for VGLL3 skyldes i hovedsak forskjeller på høy delta Ct-verdier betyr relativt lave nivåer (stiplet linje firkant).
For å måle hvor like de primære og sekundære kreftprøver var i form av genuttrykk nivåer, og videre for avvikende analyse, genererte vi scatterplots av genuttrykk nivåer av de to målingene. Uttrykket nivåer av de tre signatur genene er vist som delta Ct-verdiene som bruker samme ligningen som beskrevet i legenden om Figur 1. De primære og sekundære kreftprøve målinger viser til de to målingene som inneholder den første og andre mest vanlige Gleason mønstre. De to typer av cancerprøver fra 43 pasienter blir sammenlignet ved hjelp av scatterplots. Røde sirkler angir uteliggere, som ble ytterligere undersøkt om vev inngangsstørrelse og prosenter av kreft epitelceller. Stiplet linje firkant indikerer VGLL3 målinger som hadde høy delta Ct verdier og dårlig reproduserbarhet.
uteliggere i scatterplots av de tre genene i figur 2 (røde sirkler) ble videre undersøkt ved å sjekke vev input, prosentandelen av kreftceller av merkede områder eller de spesielle histopatologiske mønstre av utvalgte kreft områder. De fleste av uteliggere ble oppnådd fra prøver som hadde en av de følgende egenskaper: 0,1 mm
3 vev inndata, inneholdende 30% stromale celler eller representerer infiltrerende /invasiv kreft-type, i hvilket kreftceller vanligvis er innkapslet av stromale celler. Denne type vev ble funnet i fire av fem uteliggere for IGFBP3, for F3 3 av 5 og for VGLL3 4 av 6. En pasient produsert uteliggere i alle tre sammenligninger, og en annen pasient produsert uteliggere for både F3 og VGLL3. Gjenværende uteliggere kunne ikke forklares.
Diskusjoner
Dette arbeidet evaluerer operatørens innvirkning på valg av hvilke biopsi skal brukes til genekspresjonsanalyse. For å minimere den totale variasjon av testresultater i genekspresjon analyser, er det viktig å vurdere variasjonen indusert av subjektive avgjørelser og dermed muligheten til å redusere variasjonen gjennom forbedret praktiske prosedyrer. Faktisk er denne studie av et tre gener uttrykk signatur i prostata cancer, inkludert en stor andel (80%) av pasientene med odde Gleason ballen eksempel 3 + 4/4 + 3 (dvs. 7), eller 4 + 5/5 + 4 ( dvs. 9), hvor vi anser risikoen for operatørfeil å være størst.
IGFBP3 og F3 gener viste begrensede forskjeller i uttrykk nivåer innenfor kreft epiteliale celleprøver, når man sammenligner delta Ct-verdier fra ulike biopsier stammer fra samme pasient. Innenfor kreft vev målinger som representerer forskjellige histopathologically bestemt Gleason mønstre, den typiske variasjonen var 1-2 delta Ct verdi enheter. Når man sammenligner en biopsi med godartede celler med at av de primære Gleason mønster, ble en lignende variant observert for IGFBP3 og litt større variasjon for F3. Siden den positive kontrollen variasjonen var 0,7-0,8 delta Ct verdi enheter, er valget av biopsi en feilkilde og variasjon av samme størrelsesorden som den analysen selv.
Sammenligningen av delta Ct-verdier fra vevsprøver som stammer fra den samme pasient kan bli utført på mange måter. Med tilgang til flere biopsier fra bare 43 pasienter, er det antall egnede metoder for å sammenlikne utgangsdessverre begrenset. Vi har valgt å bruke histogrammer å presentere forskjellene, fordi dette gir en klar illustrasjon av fordelingen av forskjeller. For eksempel, i figur 1A er det klart at flertallet av delta Ct forskjellene når sammenligne primær og sekundær kreft prøven er mellom 0 og 2 delta Ct enheter, ledsaget av et par slengere. Ethvert forsøk på å anslå konkordans ved hjelp av statistiske metoder ville være tungt partisk av uteliggere, derav valget av histogrammet fremstilling av resultatene, ledsaget av scatterplots.
Målinger av VGLL3 uttrykk nivåer viste større variasjon mellom biopsier, som i hovedsak var forårsaket av et lavt ekspresjonsnivå i prostatakreftceller i forhold til de andre to signatur gener. Den gjennomsnittlige delta Ct av VGLL3 i positive kontrollanalysene viste sonden og primere for VGLL3 er tilfredsstillende funksjonelle, noe som betyr at ekspresjonsnivået av VGLL3 virkelig er lav i prostatavev. Nøyaktig kvantifisering av slike lave nivåer kan sannsynligvis bli forbedret ved å øke tilførsel av kreftvevet materiale for derved å forbedre signal. Andre faktorer som kan påvirke variabiliteten i VGLL3 målinger er variasjoner i stromal celleinnholdet i de ulike biopsiprøver eller ikke-uniform mRNA degradering, noe som betyr at VGLL3 kanskje lider av mer omfattende nedbrytning enn de andre testede genene eller kan bli ulikt fordelt mellom epitel og diverse stromale celler.
Målinger av genet signatur i godartet vev viste at IGFBP3 konsekvent gitt tilsvarende verdier for de i tumorvevet fra den samme pasient, forble F3 lignende, men med større variasjon, og VGLL3 var svært variabel. Siden kreft vev som brukes for å måle inneholdt varierende grad av stromale celler, er denne typen analyser viktig å lære å lede operatøren i biopsi utvalget. I genuttrykk målinger av både IGFBP3 og F3, de primære og sekundære tumor Mønstrene som følger resultater som var i overensstemmelse, og i disse tilfellene ble det kjent at bare en mindre fraksjon av tumorprøver faktisk inneholdt stromale celler. Siden F3 mistet deler av ekspresjonsnivået sammenlignbar mot godartet vev bare, er det viktig å ha en stor fraksjon av tumorceller i biopsiprøve anvendt for genekspresjon analyse. Vår nåværende beste anslag er at ca 2/3 av vevet materiale skal inneholde kreft epitelceller for F3 for å gi sammenlignbare resultater. For VGLL3, er sammenlignbar dårlig, men det er ikke kjent om dette er relatert til dette genet blir forskjellig uttrykt i tumor contra godartet vev, i epiteliale kreftceller versus stromale celler eller om dette er ganske enkelt en effekt av de tekniske vanskeligheter ved å måle lav ekspresjon nivåer.
en viktig observasjon er at virkningen av operatørens valg av hvilken biopsi er den viktigste når det gjelder svulst mønster (Gleason mønster) er ikke en dominerende feilkilde for de to gener som var sterkt uttrykt, dvs. IGFBP3 og F3. Dette betyr at en genekspresjon analyse ved hjelp av IGFBP3 og F3 vil være ufølsom overfor moderate forskjeller i Gleason gradering. Videre, for IGFBP3 og F3 fremgangsmåten er ufølsom for den fraksjon av stromaceller, så lenge som ca. 2/3 av vevet materiale som er kreftceller. Disse to aspektene er viktige faktorer som bidrar til en virkelig objektiv genuttrykk vurdering av pasienten, som i kombinasjon med tradisjonelle kliniske parametre som Gleason score kan bidra til mer nøyaktige prognostiske uttalelser. Et annet viktig observasjon er at siden uttrykket analyse av prøvene som representerer de primære og sekundære mønster er lik for IGFBP3 og F3, er det ikke nødvendig å holde dem adskilt, men alle tumormateriale fra en enkelt biopsi kan mest sannsynlig bli samlet inn i en ampulle for analyse av genuttrykk. For VGLL3, de observerte store forskjeller skjedde på lave nivåer. Først etter den analytiske prosedyren har blitt endret for å håndtere slike lave mengder, kan ytelsen profil for VGLL3 tvers av en rekke kreft mønstre bli undersøkt.
Ofte når en prognostisk eller diagnostisk genuttrykk panel har blitt utviklet på store og fersk (eller ferskt frosset) vevet materiale fra kirurgiske prøver utfordringen vil lå i å overføre prøven til å håndtere prøver, som er tilgjengelig i klinisk rutinemessig, særlig ved bruk av biopsiprøver som inneholder små områder kreft. FFPE- vevssnitt er vanlig i rutinekreftdiagnostikk, men inneholder lavere kvalitet DNA /RNA på grunn av de harde vev forberedelse trinn og langtidslagring. Denne rapporten illustrerer at for de to høyt uttrykte gener, har liten valget av hvilken vevsprøve for å analysere (hvis noen) innvirkning på analyseresultatet, som er oppmuntrende for det generelle tilfellet av overføring av genekspresjon analyser fra friske vevet materiale for å FFPE materialet .
for å kunne bruke IGFBP3, F3, VGLL3 genuttrykk profil for å gi utfyllende informasjon om prognosen for enkelte pasients prostatakreft sykdom, gyldig analyse av data er nødvendig. Rapporten konkluderer med at operatøren avhengigheten ikke vil være en dominerende feilkilde for IGFBP3 og F3 i dette genekspresjon profil, som er av avgjørende betydning for den praktiske gjennomføringen av genuttrykk analysen i rutinemessig bruk. Genuttrykket profilen er for tiden evaluert på prostatakreft pasientens materiale for sin evne til å hjelpe til med å lage prognostiske beslutninger, og resultatene av denne studien vil bli rapportert på et senere tidspunkt.
Dersom funn rapportert i denne rapporten bevise generelt vil støtte bevis for den underliggende «stemness» hypotese i initiering og progresjon av (prostata) kreft styrkes. Som genuttrykk nivåer av IGFBP3 og F3 var uavhengig av histopatologiske gradering i prostata cancer område, det samme som i benign område kan genet signaturen reflektere underliggende patogenetiske mekanismer for prostatakreft. Basert på denne observasjonen, ville analyse overføringer har en høy suksess-rate i klinisk praksis.
I sammendraget, rapporterer vi at operatørens valg av hvilke biopsi for å gjennomføre genekspresjonsanalyse på ikke har noen dominerende innvirkning på resultatene av IGFBP3 og F3 genuttrykk målinger i kreft epitelceller. Analysen av VGLL3 genuttrykk nivåer ville ha nytte av optimalisering grunn av generelt lave nivåer.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
