Abstract
Til tross monolagkulturer blir mye brukt for kreft narkotika utvikling og testing, 2D kulturer har en tendens til å være overfølsomme overfor kjemoterapi og er relativt dårlige prediktorer for hvorvidt et legemiddel vil gi klinisk nytte. Mens det generelt er mer komplisert, tre-dimensjonal (3D) kultursystemer ofte bedre rekapitulere sann kreft arkitektur og tilveiebringe en mer nøyaktig medikamentrespons. Som et ledd i å lage 3D kreft kulturer mer tilgjengelig, har vi utviklet en mikro plattform og overflatemodifisering protokollen for å muliggjøre høy gjennomstrømming produksjon av 3D-kreft aggregater. Heri bruker vi denne romanen system for å karakter prostatakreft celle microaggregates, inkludert vekstkinetikk og narkotika følsomhet. Våre resultater tyder på at prostatakreftceller er levedyktig i dette systemet, men noen ikke-kreft prostatacellelinjer er det ikke. Dette systemet tillater oss å konsekvent styre for tilstedeværelse eller fravær av en apoptotisk kjerne i 3D kreft microaggregates. I likhet med tumorvev, 3D microaggregates vise dårlig polaritet. Kritisk responsen av 3D microaggregates til kjemoterapeutiske stoffet, docetaxel, er mer i samsvar med
in vivo
resultater enn tilsvarende 2D-kontroller. Kumulativt, våre resultater viser at disse prostatakreft microaggregates bedre rekapitulere morfologi av prostatakreft sammenlignet med 2D og kan brukes for high-throughput narkotika testing
Citation. Chambers KF, Mosaad EMO, Russell PJ, Clements JA , Doran MR (2014) 3D kulturer av prostata kreft celler dyrket i en roman høy gjennomstrømming Kultur Platform er mer motstandsdyktig mot Kjemoterapeutika Sammenlignet med celler dyrket i ett lag. PLoS ONE 9 (11): e111029. doi: 10,1371 /journal.pone.0111029
Redaktør: Wendy J. Huss, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 5 juni 2014; Godkjent: 26 september 2014; Publisert: 07.11.2014
Copyright: © 2014 Chambers et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. MRD er finansiert av en Movember New Concept Grant (NCG 3212) tildelt gjennom Prostate Cancer Foundation av Australias Research Program (http: //www. prostate.org.au). JAC er støttet av en National Health and Medical Research Council of Australia Principal Stipendiat (https://www.nhmrc.gov.au). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tre-dimensjonale (3D) cellekultur er motivert av behovet for å utføre eksperimenter som bedre rekapitulere den fysiologiske mikromiljøet. Konvensjonelle to-dimensjonale (2D) cellekulturer ofte mislykkes i å etterligne den cellulære funksjoner og signalveier som er tilstede i vev. Følgelig 2D cellekulturer kan føre til skjeve og begrensede data [1], [2]. Microarray profilering av 2D-3D-versus kulturer har vist at 50% av gener endring i ekspresjon ved 3D-kultur [3]. Noen av disse forskjellene kan skyldes forskjeller i den mekaniske spenningen i matrisen. For eksempel kan celler dyrket i 2D på vevskultur plast erfaring forhøyet strekkspenning, en million ganger større enn for bløtt vev [4], og dette er kjent for å endre cellefysiologi [5]. Kunstig høy strekkspenninger kan dypt påvirke celle morfologi, cytoskjelettet arrangement, celle-celle adhesjon og migrasjon. 3D-kulturer bedre etterligner naturlig vev mekaniske påkjenninger, og dermed gi en mer representativ patofysiologisk tilstand enn ved bruk av konvensjonelle vevskulturplater [6], [7]. Denne relative effekten er tydelig under
in vitro
kjemoterapi testing, hvor 2D kulturer er vanligvis overfølsom mot narkotika mens 3D kultur narkotika følsomhet oftere paralleller tilsvarende
in vivo
scenario [8], [9 ].
til tross for at 3D-kulturer fungere som mer robuste
in vitro
kreft narkotika testing modeller, de fleste laboratorier fortsatt stole på 2D kulturer som sitt primære verktøyet. Dette er delvis på grunn av økt arbeidskraft og kostnader forbundet med etablering av 3D-modeller, og fordi det ikke er enighet om en enkelt standard modell som kunne brukes på tvers av feltet. Flere typer 3D-kultur-systemer, med ulike fordeler og fallgruver, er for tiden ansatt. Naturlige ekstracellulære matriks (ECM) geler som type-I-kollagen og laminin-rik Matrigel kan gi de mekaniske og kjemiske signaler for vev morfogenese, men de inneholder en rekke udefinerte vekstfaktorer og ECM-proteiner som er forskjellige batcher endrer mekaniske egenskapene til gelen. Syntetiske geler bestående av peptid-funksjonaliserte syntetiske polymerer er skreddersydd for å etterligne spesifikke ECM-egenskaper, og derfor tilbyr et alternativ [10]. Imidlertid kan stillaset og gel baserte systemer være dyrt å skalere opp til store high-throughput studier og vanskelig å analysere. Teknikker slik som væske-agar overlag og poly-HEMA gi et billigere alternativ, men størrelsen og ensartetheten av aggregatene kan ikke være strengt regulert, og dette ville oversette til forskjellige medikament borsynk [11], [12]. Vi har tilpasset en høy gjennomstrømning mikrosystem til kultur prostataceller som microaggregates av en kontrollert størrelse. Dette systemet har en fordel fremfor andre 3D kultursystemer ved at dimensjonene av microaggregates kan være strengt regulert, og aggregater av en definert størrelse er produsert av en justerbar natur for high-throughput medikamenttesting. Heri vi vise at prostatakreftceller selv montere inn aggregater som reagerer på behandling i en måte som er forenlig med forventet
in vivo
følsomhet.
Materialer og metoder
Fabrication og multi-lagdeling av mikrobrønnene
fabrikasjonen av polydimetylsiloksan (PDMS) mikro matriser ble utført som beskrevet tidligere [13]. I dette tilfellet brukte vi myklitografi for å danne matriser av 360 x 360 x 180 um mikrobrønner eller 800 x 800 x 800 um på PDMS plater, som deretter ble montert inn i brønnene til en 48-brønners vevkulturplate. I korthet ble en silikaplate som brukes til å danne en PDMS form, hvorfra en invers polystyren mugg ble opprettet. PDMS mikro overflate er laget i plater ved hjelp av sistnevnte formen og arket ble stanset ut til skiver (figur 1A). Slag av forskjellige størrelser kan brukes til å lage innsatser for hvilken som helst størrelse vevskultur plastbeholder. Ved hjelp av denne teknikken tusenvis av mikro kan produseres
en masse plakater (600 microaggregates /cm
2 eller 150 microaggregates /cm
2 for de mindre og større mikro, henholdsvis). PDMS overflate ble belagt med enten 5% Pluronic /fosfatbufret saltløsning (PBS) oppløsning eller flere lag med kitosan (CHI) og hyaluronsyre (HA), som begge forebygge celleadhesjon til PDMS overflaten. Som tidligere beskrevet [13] multi-lagene begynner med en elektropositiv poly-lysin lag for å hjelpe til ytterligere lag klebeevne og fem lag av CHI og HA er sekvensielt inkubert i 15 minutters intervaller. Vi har tidligere vist at den øvre HA lag blokker celleadhesjon på PDMS mikrobrønner, og at dette fremmer celle aggregering [14]. Etter belegning innsatsene ble sterilisert i 70% etanol og vasket over natten med PBS klar til bruk.
(A) En polystyren-form [13], ble brukt til å støpe PDMS ark med en mikro-mønstret overflate. Plater ble stanset ut av PDMS arket for å danne innsatser for multibrønnplater, og disse flatene ble belagt med enten 5% Pluronic eller flere lag med CHI og HA. LNCaP-celler (50.000) ble sådd ut på å enten (B) Pluronic belagte (3D Pluronic) eller (C) i flere lag (3D multi) mikrobrønner og den Alamar blue-analysen ble anvendt for å måle metabolismen i 3D-versus 2D-celler. Begge belegg produsert levedyktige aggregater som økte i stoffskiftet over 7 dager på en tilsvarende rate på celler dyrket i 2D kultur. Tre tekniske replikater ble gjennomført per time-punkt.
Cells og prostata microaggregate kultur
prostatakreftcellelinjer, RWPE-2 [15] og LNCaP [16], og ikke-kreft-celler linje RWPE-1 [15], ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler ble dyrket i RPMI 1640, 5% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) pluss 1% penicillin /streptomycin (P /S) (Gibco) i 5% CO
2 ved 37 ° C. For middels optimaliseringsstudier, keratinocytt-SFM, 2% bovint hypofyseekstrakt (BPE), pluss epidermal vekstfaktor (EGF) supplement (Gibco) ble også anvendt. Enten 50.000 eller 100.000 celler ble sådd per brønn i 1 ml kulturmedium. Microaggregates ble dannet gjennom tvungen aggregering; platene ble sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min for å lette pelletering av cellene i mikrobrønnene. I tvungen aggregering prosessen blir cellene suspendert i mediet jevnt pelletert i matrisen av mikrobrønner i bunnen av brønnen. Mediet ble utvekslet på dagene 3, 6, 8, 10, og 13. I løpet av mediet utveksling, ble forsiktig tatt ikke til å suge de microaggregates. Medium ble tilsatt, og subtrahert fra det samme punkt i brønnen i løpet av hver sentral. Platene ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. Fase kontrast ble tatt med et Nikon Eclipse-Ti invertert mikroskop og den sentrale diameter på hvert ble målt ved hjelp av Image-J-programvaren (https://rsbweb.nih.gov/ij/) microaggregate. Et minimum av 50 microaggregates ble målt per time-punkt.
Seksjonering, immunfluorescens og confocal bildebehandling
Microaggregates ble fiksert med 4% paraformaldehyde (PFA) i 30 minutter og enten innebygd i Tissue-Tek optimal skjæring temperatur (OCT) forbindelse (VWR International) for seksjonering eller immunostained direkte. Prøvene ble permeabilisert med 0,5% Triton-X-100 i 20 minutter og inkubert med primære antistoffer for E-cadherin (Invitrogen, AB_86564), β-catenin (i Santa Cruz-, AB_626807) (fortynnet 1:200), α6-integrin (Millipore , AB_10834933), laminin-5 (Abcam, AB_2133782), kløyvde caspase-3 (Cell Signal Technology, AB_331440) (utvannet 1:100) og Ki67 (Abcam, AB_443209) (1:400) over natten ved 4 ° C. De respektive sekundært antistoff konjugert med Alexa-488 (Invitrogen) ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur; 4 «, ble 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Sigma-Aldrich) brukes til å farge kjernene og rhodamin Phalloidin (Invitrogen) ble anvendt for å farge for F-aktin. De microaggregates ble montert ved hjelp Forleng gull (Invitrogen) og avbildes med en Leica TCS SP5 konfokal mikroskop eller et Nikon Eclipse-Ti invertert mikroskop.
Live /døde flekker
Celler ble inkubert med to mikrogram /ml fluorescein-diacetat (FDA) (Sigma-Aldrich) i 15 minutter og 20 ug /ml propidiumjodid (PI) (Sigma-Aldrich) i 2 minutter ved 37 ° C for å farge levende og døde celler hhv. FDA er en celle-gjennomtrengelig esterase substrat som måler både enzymatisk aktivitet og celle-membranintegritet. Propidiumjodid binder seg til DNA, men er bare i stand til å trenge inn i de kompromitterte membraner av døde eller døende celler. Celler ble fotografert ved hjelp av en Leica TCS SP5 konfokalmikroskop og andelen område av døde celler per microaggregate ble kvantifisert ved hjelp av Image-J-programvaren (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Et minimum av 10 microaggregates ble analysert per time-punkt.
Alamar blå og WST-1 celle levedyktighet analyser
Å etablere celle metabolisme over 14 dager microaggregate vekst, Alamar blå (Invitrogen) analysen ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. På dag 1, 3, 7 og 14 en 3% volum av Alamar blue ble tilsatt per brønn. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 1 time og 100 ul medium overført til en 96-brønns sort plate. Fluorescens (eksitasjon 544 nm, emisjon 590 nm) ble oppdaget ved hjelp av en plateleser (BMG Omega, BMG LABTECH). WST-1 (Roche) ble anvendt for å kvantifisere levedyktigheten til RWPE-1 og RWPE-2-celler dyrket i forskjellige mellom typer. Celler ble dyrket i 3 dager etterfulgt av tilsetning av 10% WST-en i 1 time før lesing absorbans ved 450 nm på en Bio-Rad Referanse Plus plateleser.
PicoGreen assay.
den PicoGreen assay (Invitrogen) anvendt som et mål på levedyktige celler ved å påvise total dobbelt-trådet DNA, ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble DNA ble ekstrahert med 0,5 mg /ml proteinase K (Roche) fosfat-bufret EDTA (PBE). Prøvene ble fortynnet (1:10) i RNaseA løsning (Invitrogen) og inkuberes med PicoGreen assayreagens før de blir lest på en fluorescens plateleser (BMG Omega, BMG LABTECH; eksitasjon 485 nm emisjon 520 nm).
Drug behandlinger
LNCaP-celler ble sådd ut i 48-brønns plater med eller uten PDMS innsatser og dyrket i to dager før behandling med fortynninger av 0,01-1000 nM docetaxel (Sigma-Aldrich) i 72 timer, som ble sammenlignet en DMSO kjøretøy kontroll. Protokollen for Alamar blue ble tilpasset for å lese i platen gjennom den klare PDMS setter inn ved anvendelse av 10% Alamar blue og inkubering i 2 timer. En seriell fortynning av celler viste at fluorescensen var i forhold til celletallet (R-kvadrert verdi på 0,99; data ikke vist). IC50 ble beregnet ved hjelp Calcusyn Statistikk pakke (Biosoft, UK) som rapportert tidligere [17].
3D kultur RWPE-1 celler i Matrigel basalmembran matrix
RWPE-1 celler ble dyrket i Matrigel (BD Biosciences) i 7 dager for å vurdere polaritet. Denne fremgangsmåten har blitt brukt tidligere [18], [19]; Kort sagt ble RWPE-1-celler sådd ut i enten 1% eller 8% Matrigel i nærvær av keratinocytt-SFM-medium supplert med 2% BPE (Gibco). Polariteten av celler dyrket i Matrigel pluss eller minus mikroinnsats ble sammenlignet.
Diskusjon
Den PDMS mikrosystemet produserer prostatakreft microaggregates av ensartet og kontrollert størrelse
Resultater og Hensikten med dette arbeidet var å produsere en høy gjennomstrømming PDMS microaggregate system for testing av medisiner for prostata kreft. I utgangspunktet søkte vi å karakterisere veksten av prostata kreft celler i mikrosystemet og sammenligne morfologi, og vekstraten til normale celle kolleger. PDMS er en inert polymer som brukes stadig oftere i vevskultur applikasjoner [20]. Det er egnet fordi det er billig og er kompatibel med hurtig fabrikasjon metodikk slik som myklitografi [21]. PDMS flater har blitt formet og brukt i kultur programmer for å styre formen og størrelsen på enkeltceller [22], og spesielt mikro dannet fra PDMS har blitt brukt til å fremstille celleaggregater for å forbedre differensiering av humane embryoniske stamceller inn i nerveceller [23 ], [24] og stamceller til osteoblaster eller kondrocytter [13], [24], [25]. Denne studien er den første til kultur prostataceller på en PDMS mikro overflate kontrollert samlede størrelsen. Prostata kreftceller ble dyrket som 3D-aggregater av strengt kontrollerte dimensjoner ved bruk av en PDMS mikro overflate bestående av 600 mikrobrønner /cm
2, som hver er 360 mikrometer ved 360 nm (figur 1A). Den mikro Overflaten ble modifisert med enten 5% Pluronic eller flere lag (figurene 1B og C). Begge overflatebelegg blokkert overflaten celle adhesjon og fremmet microaggregate formasjon. Aggregater dannet fra LNCaP-celler forble levedyktig og økt metabolisme i løpet av 7 dager ved en frekvens sammenlignbar med celler dyrket i kultur 2D (figurene 1B og C). På dag en, etter at 50.000 celler ble sådd, LNCaP-celler dannet ensartede microaggregates av 70 pm diameter (figur 2A). I løpet av en 7 dagers kultur aggregatene jevnt vokste til å være 120 pm diameter. Dette syntes å være en begrensende diameter og størrelsen ikke vesentlig øker med ytterligere kultur (figur 2A). RWPE-2 celler dannet betydelig mindre aggregater av 60 mikrometer på dag én, og de microaggregates ikke øke i diameter over 14 dager (Figur 2A). Diameteren på RWPE-1-celler ble ikke målt som aggregatene var ustabile, disassociating inn i løse klynger av celler etter tre dager i kultur. RWPE-1 og RWPE-2-celler ble dyrket i RPMI 5% FBS + PS istedenfor deres anbefalte vekstmedium, keratinocytt-SFM, for å optimalisere microaggregate formasjonen. I det sistnevnte medium de RWPE-1 og RWPE-2-celler dannet dispergert klynger av celler med en høy andel av døde celler etter 7 dager (figur S1A). Endring av vekstmediet hadde ingen vesentlige negative effekter på celle metabolisme i forhold til det anbefalte medium (figur S1B). Derfor, RPMI 1640, 5% FBS + P /S ble anvendt i alle ytterligere eksperimentering
(A) De diametre på LNCaP og RWPE-2 celle-aggregater ble målt i løpet av 14 dager.; mener +/- SD, n = 50 fra * p 0,05, ble en paret elevenes t-test brukes til å vise signifikante forskjeller i diameter på dag 7 og 14. (B) FDA /PI flekken ble brukt for å farge levende celler grønn og døde celler rødt på de dagene vist og den prosentvise område av døde celler pr microaggregate har blitt kvantifisert for å vise at de ikke-cancerprostataceller (RWPE-1) har større celledød (prosent røde piksler) i mikro innsatsene i forhold til prostata kreftceller (LNCAP og RWPE-2); mener +/- SD, n = 10. En paret elevenes t-test ble brukt til å beregne betydningen * p 0,05. (C) De konfokale bilder og fasekontrastbilder (Day 14 Fase) viser at prostatacancercellelinjer (RWPE-2 og LnCap) vokse som en kompakt glatt microaggregates inntil dag 14. Omvendt, de ikke-cancerceller (RWPE-1) form spredt løse klynger som er ikke-levedyktig og uten definer diameter på dag 14. Scale bar er 100 mikrometer.
prostata kreft celler er levedyktig i PDMS mikrosystem og har en lavere spredning rente i forhold til enkeltlag
levedyktighet av prostata microaggregates ble vurdert over 14 dager ved å beregne prosentandelen av døde celler med hensyn til levende celler (figur 2B) fra FDA /PI farget microaggregate confocal bilder (figur 2C). FDA fargestoff Resultatene viser at prostata kreftcelletyper, LNCaP og RWPE-2, har en intakt cellemembran i løpet av 14 dager. I motsetning til dette ikke-kreft cellelinje, RWPE-1 viser en proporsjonal økning i lyserte cellemembraner i løpet av 14 dager og vise løs organisasjon (dag 14 fase). Tilsvarende, LnCap microaggregates viser en økning i metabolismen i løpet av 14 dager (figur 3A) og en økning i DNA-innhold (figur 3B). Imidlertid RWPE-2 microaggregates viser en klar nedgang i metabolismen (figur 3C) og en nedgang i DNA-innhold (figur 3D) til tross for at intakte cellemembraner i henhold til FDA-farging (figur 2B). Derfor RWPE-2-celler er sannsynlig å være i en sovende tilstand celle, uten celledeling eller celledød. Dette støttes av den microaggregate dimensjonering data, noe som viser at RWPE-2 microaggregates ikke signifikant økning i diameter (figur 2A). For RWPE-2 celle 2D data, var det en svak korrelasjon mellom assayer, til tross for den klare sammenheng mellom analyser for 3D-data; 2D i metabolismen avtok etter dag 3 (figur 3C), men DNA-innhold fortsetter å øke helt til dag 14 (figur 3D). Dette indikerer at cellene fortsatt var i stand til å dele seg og ble derfor ikke næringsstoff sultet, men viser dårlig korrelasjon mellom disse analyser, som tidligere er blitt dokumentert [26]. Likevel, LNCaP PicoGreen data gjorde korrelerer godt med Alamar blå metabolske data (figur 3A og B). Totalt sett, metabolisme og proliferasjon av alle celler var lavere i 3D sammenlignet med monolaget (figur 3), som er i overensstemmelse med tidligere studier [9]. 2D overflaten gir en stor overflate for vedlegg, som er en forutsetning for vellykket celledeling dvs. knutepunkter vedheft ankerpunkter er gitt for de dele celler, som er nødvendige for spredning [27]. Imidlertid gir dette en falsk representasjon av divisjonen hastighet i en vev, og den nedre 3D-replikasjon hastighet er mer analog til sprednings priser i tumorer.
Levedyktigheten av LNCaP (A og B) og RWPE-2 (C og D) microaggreagtes versus det samme antall celler dyrket i 2D ble vurdert gjennom Alamar blue (A og C) og PicoGreen assay (B og D). LnCap microaggregates viser en økning i metabolismen i løpet av 14 dager (A) og en økning i DNA-innhold (B). Imidlertid RWPE-2 microaggregates viser en nedgang i metabolisme (C) og en nedgang i DNA-innhold (D). Gjennomsnittlig +/- SD; n = 4. Data representerer tre eksperimenter. * P 0,05, ble en paret elevenes t-test benyttet for å bestemme betydning mellom 2D og 3D
Prostata cellelinjer dyrket som microaggregates vise dårlig polaritet lik svulster
Microaggregates var. fiksert på dag 7 og immunofarget for apikal (E-cadherin og β-catenin) og basal (α6-integrin og laminin-5) markører 3D polaritet (figur 4). Disse markørene ble valgt i henhold til deres tidligere bruk som apikale og basal overflatemarkører i 3D-matrix systemer [18], [28] – [30]. Fra disse data er det klart at alle microaggregates ikke har en hul lumen og ikke danner polare strukturer, med bare Laminin-5 blir observert i en stilling forventet for en polar aggregat, som var på den basale overflaten på den ytre kant av den microaggregate (figur 4 LM-5). For å kontrollere at antistoffene arbeidet cellelinjer dyrket i monolag ble også immunfarget for samme polaritet markørene og avbildes ved bruk av konfokal Z-snitting (figur S2). Som forventet, Laminin 5 og α6-integrin flekke den basale overflaten av alle typer celler dyrket i monolag, med noen cytoplasmatisk farging (figur S2B sorte piler). og E-Cad og β-catenin er hovedsakelig uttrykt på celle til celle knutepunkter (fig S2B hvite piler). Polare 3D microaggregates eller kuler er definert av en apikale overflate som omgir en hul lumen og en basal overflate som vil feste til den omgivende matrise [18]. Den mikrobrønn-system er blottet for matrisen, bortsett fra hvilken som helst celle utskilte løselige matriksproteiner og det er ingen stillas for feste og dermed mangel på en klar basal overflate. Derfor er det forutsigbart at microaggregates mangler en hul lumen og således en apikale overflate som matrise spenning bidrar til vev organisasjon [31], men noen grad av celle organisasjon exsists. For eksempel, LNCaP, RWPE-1 og 2-celler uttrykker Laminin-5 på den ytre samlede overflate, men uttrykker ikke α6-integrin. I tillegg ble E-cadherin og β-catenin funnet uttrykte mellom cellesammenvoksninger av LNCaP og RWPE-2 microaggregates (figur 4), men det er ingen luminal overflate, og dermed er det ingen ekspresjon av disse markørene ved en apikale overflate. Således cellene er i stand til å uttrykke disse fenotypiske markører, men krever andre signaler, sannsynligvis fra en ekstracellulær matriks eller omgivende celler slik som ville være til stede i tumoren mikromiljøet, for dannelse av organiserte vev acini [32]. Selv om det ikke er noen klare forskjeller mellom kreft og ikke-kreft cellelinjer, er mer en indikasjon på kreftcellen de-differensiert observert i høy klasse prostatakreft indikerer at analysen er fortsatt egnet for høy gjennomstrømning narkotika testing av prostatakreft fenotype observert celler. Imidlertid er dette system ikke er levedyktig for kulturen av ikke-neoplastiske cellelinjer som på grunn av fravær av matrisen. Men med tillegg av Matrigel til PDMS mikrosystemet, normal prostata cellelinje, RWPE-1, for å danne aggregater som viste polaritet (fig S3A og S3b). Ved tilsetning av 8% Matrigel de RWPE-1 aggregatene vises polar organisasjon med basal ekspresjon av α6-integrin (figur S3b), og dette ble opprettholdt polaritet med 1% Matrigel (figur S3A). Men microaggregates dyrket i PDMS innsatser med Matrigel var større enn de som dyrkes på inserts alene (Figur S3C) eller hos 8% Matrigel alene (figur S3D). Derfor er tilsetning av Matrigel gir en matrise for å indusere α6-integrin polaritet, som ble tapt i RWPE-1 celler dyrket på modifiserte PDMS alene. A-6-integrin har vist seg å være viktig for dannelsen acinus i RWPE-1-celler [33], derfra mangelen på α6-integrin kan bidra til dårlig microaggregate formasjonen vises ved vanlige RWPE-1-celler.
Microaggregates ble fiksert på dag 7 og immunostained for apikale og basal polaritet markører (grønt). E-cadherin (E-Cad) og β-catenin ble brukt som apikale markører og basal markører var α6-inte (α6-INT) og Laminin 5 (LM5). Kjerner ble farget med DAPI (magenta) og målestokken er 100 mikrometer.
Den PDMS mikrosystemet kan brukes til å styre apoptotisk kjerne
LNCaP celler dyrket i mikrosystemet ( 360 x 360 um), som når en maksimal størrelse på 120 pm ikke danner en apoptotisk kjerne som er identifisert av spaltede caspase-3-farging ved dag 7 (figur 5A). Imidlertid kan apoptotisk kjerne kontrolleres for ved å øke størrelsen av mikro godt til 800 um og øke seeding celletallet til 2000 celler pr aggregat. Dette skapte aggregater av ~300 pm i diameter i løpet av 7 dager med en sentral kjerne av spaltet caspase-3-farging (figur 5B). En apoptotisk kjerne er vanligvis observert i 3D kulturer av større enn 500-600 mikrometer diameter [34] – [36] men apoptotiske kjerner har blitt observert selv i LNCaP celle aggregater av 200 mikrometer diameter [37]. Variasjonen i observasjonene gjenspeiler det faktum at effektiv oksygentilførsel er en funksjon av mange variabler, inkludert totale kulturcellenummer, og høyden av mediet i tillegg til aggregatdiameter [38]. I våre studier inokulert vi med større diameter aggregater med 6 ganger høyere celletall enn de mindre aggregater, og på grunn av kubikk forhold i volumet radius ligning (V = 4 /3πr
3) resulterte dette i underkant av en fordobling av den samlede diameter (figur 5C). Prolifererende celler er tidligere blitt vist å være konsentrert ved periferien av LNCaP aggregater av 200 um dyrket ved hjelp av agaren flytende legget teknikk [36]. I vår studie benyttet vi Ki67-farging for å avsløre at prolifererende celler ble funnet jevnt gjennom hele aggregatet, og at disse cellene ikke ble konsentrert i et hvilket som helst bestemt område (figur 5D), kanskje på grunn av fraværet av en basal overflate utstyrt med en matrise flate . Derfor har vi vist at vi kan styre for apoptotisk kjerne å bruke forskjellig størrelse mikro og at spredning er jevnt fordelt i hele microaggregates
(A) kløyvde caspase-3. (CASP3, grønn), en apoptose markør, var brukes til å farge deler av RWPE-en, RWPE-2 og LNCaP microaggregates. (B) På grunn av fravær av spaltede caspase-3 i de små LnCap aggregatene, en stor mikro (800 um x 800 um x 800 um) ble brukt til å skape store LnCap microaggregates med en apoptotisk kjerne (CASP3 Lge). (C) Diameteren på LNCaP microaggregates (Sml) ble sammenlignet med LnCap microaggregates dyrket i store mikro (LGE). Et minimum av 50 aggregater ble målt pr tilstand. (D) Ki67 (grønn) ble også anvendt for å farge prolifererende celler i det store LNCaP aggregat. Kjerner ble farget med DAPI (magenta); skala bar er 100 mikrometer.
Culture of prostatakreftceller som 3D microaggregates øker legemiddelresistens, noe som skyldes forskjeller i spredning
LNCaP celler ble dyrket i 2D eller PDMS mikro 2 dager før behandling. Opp til 1000 nM av docetaxel ble tilsatt, og sammenlignet med en DMSO-bærerkontroll. Docetaxel ble anvendt som en representativ kreft legemiddel i denne studien på grunn av sin rutinemessig bruk i prostata cancer behandling [39]. Det forhindrer mitotiske spindelenheten og mitotisk celledeling, som fører til apoptose, ved å redusere mengden av fritt tubulin som er nødvendig for dannelsen mikrotubulus [39]. Celler dyrket i 3D var mer motstandsdyktig mot alle doser av docetaxel enn de dyrket i 2D etter 48 timer (Figur 6A). Ved 72 timer forskjeller ble observert bare ved de høye medikamentdoser på 10 og 100 nM docetaxel (figur 6B). Med en lengre narkotika økende inkubasjonstid IC50 for både 2D og 3D. For eksempel i 2D i 48 timer IC50 var 11 nM, og dette økte til 51,3 nM i løpet av 72 timer. I 3D IC50 var usedvanlig høy indikerer at 3D microaggregates er svært motstandsdyktig mot docetaxel, beregnet IC50 på 48 timer var 4,3 × 10
8 og 426 Nm ved 72 timer. Med økende doser av docetaxel celler i 3D beholdt deres aggregering, men ble mer løst forbundet, men i 2D cellene frittliggende (figur 6C). Det har blitt rapportert i flere typer kreft som 3D-kulturer viser mer motstand mot kjemoterapeutika [9], [40], og som i 3D, LNCaP-celler er mer motstandsdyktig mot docetaxel enn sine motstykker monolags [9]. I tillegg har vi vist at LNCaP-celler dyrket i 3D har lavere replikasjon sammenlignet med sine motparter 2D (figur 3B) og er således mer motstandsdyktig mot docetaxel, som retter seg mot prolifererende celler [41]. Vi har vist at disse effektene er midlertidig, og at når 7 dager gamle microaggregates blir returnert til et 2D-plast substrat som en enkelt cellesuspensjon de oppviser den samme doseresponsprofil som celler dyrket i 2D (fig S4). Denne medikamentpenetrering i 3D-systemer er langsommere sammenlignet med et enkelt monolag av celler, noe som gjør det mer kan sammenlignes med solide svulster [42]. Faktisk medikamentpenetrering inn i faste tumorer er vanligvis 5 til 10 ganger langsommere enn i monolagskulturer [43].
LNCaP-celler (50.000 celler /brønn) ble behandlet med docetaxel i løpet av 48 timer (A) eller 72 timer (B) på dag to av vekst, enten i 2D og 3D. Alamar blue ble brukt for å vurdere cellelevedyktighet. Mean +/- SE, n = 4 biologiske replikat * P 0,05; dataene er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Fase kontrast viser effekten av docetaxel etter 72 timer på morfologi av microaggregates (3D) sammenlignet med celler dyrket i monolag (2D).
Sammendrag
I Oppsummert kan den PDMS-systemet anvendes for å regulere dimensjonene av cancercelle microaggregates å replikere ulike stadier av tumorvekst. Den mikrosystemet produserer prostatakreft microaggregates av strengt kontrollerte dimensjoner ved hjelp av en PDMS mikro-overflaten består av 600 mikrobrønner /cm
2, hver av dem 360 mikrometer ved 360 nm. Overflate modifisering med enten 5% Pluronic eller multi-lagdeling blokker protein adsorpsjon og cellebinding på de PDMS, og dette fremmer microaggregate formasjon. LnCap aggregater var levedyktige og celletallet i aggregatene økt over tid. Apoptotisk kjerne i LNCaP-celler aggregater kan styres enten ved hjelp av små (360 x 360 um) eller store (800 x 800 um) dimensjonsmikrobrønnene. Kreft microaggregates, dannet fra LNCaP og RWPE-2-celler mangler polaritet som ville bli observert i en svulst, mens de normale RWPE-1-celler danner en basal overflate som er identifisert ved α6-integrin uttrykk etter tilsetningen av Matrigel matrise til de mikrobrønnplater. De normale prostataceller, RWPE-1, dyrket uten matrise var ikke levedyktige i systemet, og 80% av cellene i 3D-kulturer hadde dødd ved dag 14. Dette systemet kan anvendes for høy gjennomstrømming medikament testing for kreftceller i 3D. De små og store mikro overflater mulig produksjon på 600 eller 150 microaggregates per cm
2, henholdsvis. En 96-brønners plate med den lille mikro overflate muliggjør ensartet fremstilling ~34,000 microaggregates, og dette kan være integrert med lufthåndtering robotikk å muliggjøre høy gjennomstrømming medikamenttesting. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
