Abstract
TRIM protein familien er en evolusjonært konservert gen familien innblandet i en rekke kritiske prosesser inkludert inflammasjon, immunitet, antivirale og kreft. I et forsøk på å profilere de uttrykk mønstre av TRIM super i flere ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer, fant vi at uttrykket av 10 TRIM gener inkludert TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59 , TRIM66 og TRIM70 var signifikant oppregulert hos NSCLC cellelinjer sammenlignet med normal menneskelig bronkial epitel (HBE) cellelinje, mens uttrykket av 7 andre TRIM gener inkludert TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 ble betydelig ned- reguleres i NSCLC-cellelinjer sammenlignet med det i HBE celler. Som TRIM59 har blitt rapportert til å fungere som en proto-onkogen som påvirker både Ras og RB signalveier i prostatakreft modeller, vi her fokusert på rollen TRIM59 i reguleringen av NSCLC celleproliferasjon og migrasjon. Vi rapporterte at TRIM59 protein øker betydelig hos ulike NSCLC cellelinjer. SiRNA-indusert banket ned av TRIM59 betydelig hemmet spredning og migrasjon av NSCLC cellelinjer ved å arrestere cellesyklus i G2-fasen. Videre TRIM59 banket ned påvirket uttrykk for en rekke cellesyklusproteiner inkludert CDC25C og CDK1. Til slutt, vi slått ned TRIM59 og funnet ut at p53 protein uttrykk nivåer ikke oppregulere, så vi foreslått at TRIM59 kan fremme NSCLC cellevekst gjennom andre veier, men ikke p53 signalveien
Citation. Zhan W, Han T Zhang C, Xie C, Gan M, Deng K, et al. (2015) TRIM59 Fremmer spredning og migrasjon av ikke-småcellet lungekreft celler ved oppregulering Cell Cycle Relaterte Proteiner. PLoS ONE 10 (11): e0142596. doi: 10,1371 /journal.pone.0142596
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 27 april 2015; Godkjent: 23 oktober 2015; Publisert: 24.11.2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Denne studien ble delvis støttet med tilskudd til JB Wang fra Natural Science Foundation National of China (81372823, 31360282), Department of Education i Jiangxi-provinsen (Science and Technology Luo Di program), og et tilskudd til MG Fu fra National Institutes of Health (AI103618).
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den tredelte motiv (TRIM) protein familie består av over 70 medlemmer som er innblandet i en rekke av cellulære prosesser, inkludert cellevekst [1], differensiering [2], utvikling [3], apoptose [4], inflammasjon og immunitet [5, 6]. Det mest slående trekk ved TRIM super proteiner er svært konservert rekkefølgen av domener i RBCC motiv, som inneholder en RING domene, en eller to B-box motiver og en coiled-spole region [7, 8]. De fleste TRIM proteiner utgjør en ny klasse enkelt ring-finger E3 ubiquitin ligaser som fremmer posttranslasjonelle modifikasjoner av ulike underlag, inkludert seg selv [7]. TRIM proteiner også danne multimerization ved hjelp av selv foreningen via coiled-spole domener, fungerer som stillas for montering av multi-proteinkomplekser som identifiserer subcellulære avdelinger [9]. I løpet av det siste tiåret, har mye oppmerksomhet blitt høstet i å utforske rollen som TRIM proteiner i medfødt immunitet mot virusinfeksjoner [10]. I de senere årene har flere grupper rapportert at TRIM proteiner er også fungerer som onkogener eller tumor suppressors implicating i ulike kreft vekst. For eksempel, Raheja et al. rapportert at TRIM3 er en bona fide tumor suppressor, dens evne til å hemme celleproliferasjon avhenger av NHL (oppkalt etter NCL1, HT2A og LIN41 gjenta) domene og dens RING domene [11]. TRIM16 inhiberer neuroblastom celleproliferasjon og migrering in vivo og in vitro tumorigenisitet gjennom endringer ekspresjon av cyclin D1 og p27 [12]. TRIM28 vises oppregulert i mange kreftformer. I tidlig stadium av lungesvulster, korrelerer høyt TRIM28 med økt totaloverlevelse [1]. Videre reduserer TRIM28 celleproliferasjon i modellen lungecancercellelinjer ved å bygge bro HDAC1 /E2F-interaksjoner [1]. Nylig, Zhou et al (2014) rapporterte at i mage tumor, samhandler TRIM59 med p53, fremme sin ubiquitinering og degradering; TRIM59 kan fremme mage karsinogenese via denne mekanismen [13].
I et forsøk på å profilere uttrykk mønster av TRIM super i flere NSCLC cellelinjer, uttrykket av flere TRIM gener inkludert TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant oppregulert hos NSCLC cellelinjer sammenlignet med normal menneskelig bronkial epitel (HBE) cellelinje, mens uttrykket av andre TRIM gener inkludert TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 ble signifikant nedregulert i NSCLC-cellelinjer sammenlignet med det i HBE celler. Som TRIM59 har blitt rapportert til å fungere som en proto-onkogen som påvirker både Ras og RB signalveier i prostatakreft modeller [14], vi her fokusert på rollen TRIM59 i reguleringen av NSCLC celleproliferasjon og migrasjon. Vi først fant ut at TRIM59 protein øker betydelig hos ulike NSCLC cellelinjer. SiRNA-indusert banket ned av TRIM59 betydelig arrestert spredning og migrasjon av NSCLC cellelinjer ved å arrestere cellesyklus i G2-fasen.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelig bronkial epitelceller (HBE) celler var fra Sciencell Company og dyrkes i bronkial epitelcelledifferensiering medium (ScienCell, 3211). Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer (H1299, H292, A549) var fra ATCC og SPC-A1 cellelinjen var en gave fra Dr. Xuerong Wang gruppe (Department of Pharmacology, Nanjing Medical University). NSCLC-cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Gibco). Alle celler ble dyrket under en atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
RNA rensing og Q-PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen, 15596 -026). CDNA syntese ble utført ved hjelp PrimeScript RT reagenssett med gDNA Eraser (Takara, RR047A). Q-PCR eksperimenter ble utført ved bruk av SYBR Grønn Premiks Ex Taq II kit (Takara, RR820A) og RT-PCR System-Applied Bio-system. Den relative mengde av mRNA-ekspresjon av målgener ble beregnet ved den komparative Ct-metoden ved hjelp av GAPDH som en kontroll. Alle Q-PCR-reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Data ble anskaffet ved hjelp ABI ViiATM 7 Real-Time PCR System instrument. Alle primere for de 72 TRIM gener ble validert ved hjelp av universelle cDNA standarder (BD Clontech). Kvantifisering ble utført av ΔCt metode, med 18S eller aktin brukes til normalisering. mRNA med syklustider ≥ 34 var fast bestemt på å bli uoppdaget. Normaliserte mRNA nivåer er uttrykt som vilkårlige enheter ved forvandlet syklustider med to
ΔCt. Dataene ble i motsetning til log2 og organisert i en varme kart ved hjelp av MEV programvare (Dana-Farber Cancer Institute, https://www.tm4.org/mev.html).
Lav serum analyse og metning tetthet analyse
for lavt serum-analysen ble cellene sådd ut i en tetthet på 10
5-celler i 12-brønners skåler og tillatt å forholde seg over natten i RPMI 1640 supplert med 10% FBS. På den følgende dag, ble celletallet regnet som data fra dag 0, ble mediet forandret til RPMI 1640 supplementert med 1% FBS og deretter skiftet annenhver dag i 6 dager. På de angitte tidspunkter ble cellene trypsinisert og tellet med et hemocytometer. For metningstetthet assay, 10
5-celler ble sådd ut i 12-brønn plater i RPMI 1640 supplert med 10% FBS. Mediet ble endret annenhver dag. Celletettheten ble bestemt ved telling av cellene på den sjette dagen.
kolonidannelse assay
kolonidannelse assay ble utført med H1299-celler som ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 60 mm plater og transient transfektert med kontroll siRNA, TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2 eller ubehandlet som en positiv kontroll. Etter transfeksjon ble cellene trypsinert, telles og 500-celler ble utsådd i 6-brønners skåler, og tillates å følge natten over. Dagen etter ble mediet endret til RPMI 1640 + 5% FBS. Alle celler ble deretter dyrket i 2 uker, med mediet skiftet annenhver dag. Platene ble fiksert med 4% formaldehyd og farget med 2% krystallfiolett. Bildene ble tatt av et digitalt kamera.
siRNA
banket ned av TRIM59 ble utført ved hjelp av to forskjellige Stealth Velg RNAi tomannsboliger (Life Technologies Company). Målrettede oligonukleotidsekvenser var: siRNA-1: GCCUCUCUAUCUGUUUACCAAAGUU; siRNA-2: UCCUCGUGUACUGCCAUGCUCUCAU; Stealth RNAi negativ kontroll duplex fra Life Technologies Company ble brukt som kontroll. RNAi nucletides ble transient transfektert i enten HBE celler eller NSCLC celler ved hjelp SuperFectin siRNA Transfeksjon Reagens (Pufei, Shanghai, 2103-100) og den relative slå ned effektivitet ble bestemt av TRIM59 antistoff.
Scratch sårheling analysen og Transwell migrasjon analysen
Cell migrasjon ble målt ved hjelp av en ripe analyse [15]. H1299 cellene ble sådd ut i 6-brønns plater for å skape et sammenflytende monolag av 90-100% konfluens, da den monolaget ble skrapet i en rett linje for å skape en «scratch» med en 200 ul pipettespiss. Etter å ha fjernet rusk og legge friske medier som inneholder 2% FBS ble cellene fotografert ved hjelp av fasekontrastmikroskop (Olympus IX71, forstørrelse: 200 ×; mål: LCAch20XPh, ingen filter, kamera: DP72, eksponering og bildeanalyse: cellSens programvare; pikselstørrelse: 1,4 megapixel monokrom CCD). Migrasjonen avstand ble vurdert ved hjelp av image J programvare (National Institutes of Health, https://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). En migrasjonshastigheten ble beregnet ved cellemigrering relativ område for hver behandling.
Transwell migrering analysen ble utført ved anvendelse av 8 pm porestørrelse Transwell kamre (BD Falcon). Totalt 10
5-celler i 0,2 ml medium supplementert med 1% FBS ble sådd ut i det øvre kammer. Det nedre kammer i transwell enheten ble fylt med 500 ul RPMI 1640 supplert med 10% FBS. Etter inkubering ved 37 ° C i 10 timer, ble cellene igjen på den øvre overflate av membranen fjernet. Cellene på den nedre overflaten av membranen ble fiksert, farget med krystallfiolett og deretter telles under et lysmikroskop (Olympus IX71, forstørrelse: 40 ×; mål: UplanFl4XPh, ingen filter, kamera: DP72, eksponering og bildeanalyse: cellSens programvare ; pikselstørrelse: 1,4 megapiksler monokrom CCD). Totalt 400 celler ble fotografert.
Cell syklus analyse
Nylaget cellene ble høstet og re-suspendert i 0,5 ml PBS. Deretter ble cellene fiksert med 70% alkohol på is i minst 2 timer. Etter sentrifugering ble supernatanten kastet og sedimentet ble vasket med PBS i gang. Cellepelleten ble resuspendert i 5 ml PBS, og deretter ble cellene tellet. Re-suspendert 2 × 10
5 celler med 400μl guava cellesyklusen reagent (Millipore, 4700-0160). Etter inkubering i vannbad ved 37 ° C i 15 min, ble cellesyklus analysert av Millipore Guava easyCyte ™ strømningscytometer (Millipore).
Immunofluorescence farving
Celler ble sådd ut i 24-brønners plater og fikk vokse i 18-24 timer. Celler ble fiksert med avkjølt metanol i 5 min ved romtemperatur og skylt med PBS tre ganger. Da celler ble blokkert med 5% normalt geiteserum, 0,3% Triton X-100 i PBS ved romtemperatur i 1 time. Anti-PCNA-antistoff (Abcam, ab92552) inkubering ble utført i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, ble rhodamin-konjugert geit-anti-kanin-antistoff (Proteintech, SA00007-2) påført ved romtemperatur i 1 time på et mørkt sted. Cellene ble vasket med PBS tre ganger, og deretter montert med DAPI Fluoromount-G monteringsmedium (Southern Biotech, 0100-20). Endelig celler ble fotografert med en fluorescens mikroskopi (Olympus IX83, forstørrelse: 200 ×; mål: LUCPlanFl20XPh; filterinnstilling og timing: DAPI: BA420 filter og 220ms, PCNA: BA590 filter og 360ms, kamera: DP80, eksponering og bildeanalyse: cellSens programvare; pikselstørrelse: 12,5 megapikslers farge CCD). Totalt 600 celler ble fotografert.
Protein isolasjon og western blot
De proteiner fra vev og celler ble separert ved standard 10% SDS-PAGE etterfulgt av overføring av proteiner til en PVDF membran. Proteinene ble oppdaget av følgende primære antistoffer: TRIM59 (Sigma, R06835), cyclin B1 (Proteintech, 55004-1-AP), CDC25C (Proteintech, 16485-1-AP), CDK1 (Proteintech, 19532-1-AP) , p53 (Proteintech, 10442-1-AP), PCNA (Abcam, ab92552) og β-aktin (Santa Cruz, sc-4778) og etterfulgt av inkubasjon med et sekundært antistoff. Farging ble utført med ECL western blot påvisning reagens. Antistoff mot p-actin ble servert som den endogene kontroll. Alle forsøk ble utført in triplo.
Statistisk analyse
For hvert forsøk ble tre uavhengige replikater utført. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistiske Evalueringen ble gjennomført ved hjelp av Student t-test. Den forskjell mellom behandlingsgruppene ble sammenlignet ved hjelp av enveis variansanalyse fulgt av Dunnetts test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. *,
p
0,05 vs. kontroll; **,
p
0,01 vs. kontroll; ***,
p
. 0,001 vs. kontroll
Resultater
TRIM59 er sterkt uttrykt i NSCLC cellelinjer
Lungekreft er den mest vanligste kreftformen blant menn over hele verden. De viktigste primære typer lungekreft er småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). NSCLC er ikke godt svar på cellegift og har høyere dødelighet enn SCLC [16]. I et forsøk på å profilere de uttrykk mønstre av TRIM genet familien i NSCLC cellelinjer, valgte vi fire NSCLC cellelinjer inkludert H1299, SPC-A1, A549 og H292. Den humane bronkiale epitelceller (HBE) ble tjente som kontroll. De mRNA nivåer av TRIM genet familie i disse cellelinjene ble målt ved Q-PCR og analysert av MEV programvare (S1 tabell). Uttrykket av flere TRIM gener inkludert TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant oppregulert hos NSCLC cellelinjer sammenlignet med HBE celler (fig 1A og 1B), mens uttrykket av andre TRIM gener inkludert TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 ble signifikant nedregulert i NSCLC cellelinjer sammenlignet med i HBE celler (fig 1A og S1 fig). De mRNA uttrykk nivåer av andre 12 TRIM gener ble ikke påvist verken i NSCLC cellelinjer eller HBE celler. Som TRIM59 har blitt rapportert til å fungere som en proto-onkogen som påvirker både Ras og RB signalveier i prostatakreft modeller [14], vi her fokusert på TRIM59 i NSCLC for videre forskning.
(A) mRNA uttrykk nivåer av 60 TRIM familie gener i fire NSCLC cellelinjer (H1299, H292, SPC-A1 og A549) og normal menneskelig bronkial epitel (HBE) cellelinje ble bestemt av Q-PCR. Dataene ble organisert i et varmekart ved hjelp av MEV programvare. De relative uttrykk nivåer av genene ble vist i fargeskalaen fra 0-4.0435486 i grønn-rød-svart fargevalg. (B) mRNA uttrykk nivåer av TRIM gener inkludert TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant oppregulert hos NSCLC cellelinjer sammenlignet med det i HBE celler. (C) Skjematisk fremstilling av TRIM59. TRIM59 inneholder en ringfingeren domene (RING), en B-BOX2 domene (B2), to coiled-spole domener (CC) og et transmembrandomene (TM). (D) Et uttrykk for TRIM59 i 14 typer normale vev ble undersøkt ved western blot ved anvendelse av TRIM59 antistoff. (E) Ekspresjon av TRIM59 protein i fire NSCLC-cellelinjer og HBE cellelinje. Lysater fra cellelinjene ble utsatt for immunoblotanalyse med TRIM59 antistoff.
Humant TRIM59 er et protein av 403aa inneholdende en RING domene, en B-boks domene, to kveil-spole domene og et transmembrandomene ved dens C-terminal (figur 1C). Western blot viste at TRIM59 var svært anriket i benmarg og milt, lavt nivå i muskel og lunge, påvises i andre vev som ble undersøkt (Fig 1 D). I tillegg, western blot ytterligere bekreftet at TRIM59 proteinnivå var signifikant høyere i alle NSCLC-cellelinjer som ble undersøkt enn det i HBE (figur 1E). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at TRIM59 er overuttrykt i NSCLC cellelinjer og kan innebære i reguleringen av NSCLC vekst.
TRIM59 fremmer spredning av NSCLC celler
For å undersøke funksjonen av TRIM59 i NSCLC celler, vi kjøpte tre sirnas som er rettet mot menneskers TRIM59 fra Life Technologies Company. Disse sirnas ble transfektert inn i H1299 cellelinjen. Etter 48 timer ble proteinnivået TRIM59 detektert ved Western-blot. Som vist i de nederste figurer av figur 2A, både siRNA-1 og siRNA-2 effektivt slått ned TRIM59 i forskjellige cellelinjer sammenlignet med den for kontroll siRNA. Deretter undersøkte vi effekten av siRNA-indusert banket ned av TRIM59 på den lave serum veksten av NSCLC-cellelinjer. Som vist i de øverste tallene i figur 2A, alle NSCLC cellene var ekstremt effektiv på å vokse i lav serum, men når TRIM59 ble slått ned, var de ikke i stand til å vokse under disse forholdene.
(A) lav serum analyse . De angitte NSCLC-cellelinjer transient transfektert med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontroll siRNA eller utransfekterte ble dyrket i RPMI 1640 medium supplementert med 1% FBS. På de angitte tidspunkter ble cellene trypsinisert og tellet. Dataene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SD) (Topp figurene). Immunoblot av TRIM59 å sjekke knockdown effektiviteten av TRIM59 siRNAs i de angitte cellelinjer (nederst tall). (B) Metning tetthet assay. De angitte NSCLC-celler transient transfektert med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontroll siRNA eller utransfekterte ble dyrket i RPMI 1640 supplementert med 10% FBS i 6 dager, trypsinisert og tellet. Dataene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SD). (C) kolonidannelse assay. Fem hundre H1299-celler transient transfektert med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontroll siRNA eller utransfekterte ble sådd i 6-brønns plater i RPMI 1640 med 5% FBS. Etter to uker ble cellene fiksert og farget med krystallfiolett. Representative brønner ble fotografert og vist.
Lignende resultater ble oppnådd når undersøke den relative evne TRIM59 å aktivere NSCLC celler til å øke sin metningstetthet. Cellene ble behandlet med TRIM59 siRNA var betydelig mindre tett enn det behandles med kontroll siRNA eller ubehandlet. På samme måte, siRNA-indusert banket ned fra TRIM59 betydelig retardert vekst av NSCLC-celler, men ikke i betydelig grad påvirket veksten av HBE celler (figur 2B). Deretter utførte vi de kolonidannelse eksperimenter. Som vist i figur 2C, er banket ned av TRIM59 dramatisk reduserte kolonidannelse i H1299 celler. Tatt sammen tyder disse resultater på at TRIM59 er essensiell for proliferasjon, kolonidannelse av NSCLC-cellelinjer. En fersk studie antydet at TRIM59 fremmer gastric tumorvekst i det minste delvis gjennom p53 [13]. Som H1299 celler er en p53 sletting cellelinje (ATCC informasjon), våre resultater antydet at TRIM59 kan målrette andre proteiner for å fremme cellevekst av NSCLC.
TRIM59 fremmer migrasjon av NSCLC celler
Gitt evne TRIM59 å fremme NSCLC cellevekst og kolonidannelse, er vi interessert i å undersøke effektene på NSCLC celle migrasjon. For å utforske disse mulige effektene ble sårheling analyse utført. Resultatene viste at H1299 celler migrert, og det åpne området skapt av «såret» er nesten leget etter 36 timer. Men helbredelse av det åpne området ble markert svekket når TRIM59 ble slått ned (fig 3A). For ytterligere å påvise disse effekter, vi gjorde også transwell assay, som vist i figur 3B, antallet migrerte celler ble sterkt redusert da TRIM59 ble slått ned. Derfor banket ned TRIM59 hindret H1299 celle migrasjon.
(A) H1299 celler transient transfektert med TRIM59 siRNA-1, styrer siRNA eller utransfekterte ble dyrket for å lage en konfluent monolag av 90-100% samløpet, så mono ble skrapet i en rett linje for å skape en «scratch». Graden av cellemigrering ble fotografert ved de indikerte tider (venstre tall). De tverrgående skrape sårene ble re-undersøkt og analysert ved hjelp av image J programvare på 3 forskjellige steder fra hvert sår område av hull på hvert tidspunkt. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil (høyre figuren). (B) H1299-celler transient transfektert med kontroll siRNA eller TRIM59 siRNA-1 eller TRIM59 siRNA-2 og dyrket med RPMI 1640 inneholdende 10% FBS i 48 timer. Deretter ble cellene trypsinert og sådd i Transwell kamre. Etter inkubasjon i 10 timer ble cellene fiksert, farget, fotografert og telles i fem tilfeldige visninger.
Knocking ned av TRIM59 arrestasjoner NSCLC cellesyklus i G2 fase
Knocking ned TRIM59 hemmet NSCLC cellevekst indikerer at TRIM59 kan forurolige cellesyklusrelaterte hendelser i NSCLC celler. For å undersøke effekten av TRIM59 slå ned på cellesyklus, vi transfektert TRIM59 siRNA eller kontrollere siRNA inn HBE eller H1299 celler, ble cellesyklus analysert av flowcytometri etter propidiumjodidfarging. Som vist på fig 4A og 4B, banket ned av TRIM59 betydelig økt andel av G2 /M fase og minsket andelen av S eller G0 /G1 faser sammenlignet med den for kontroll siRNA behandlede eller ubehandlede H1299 celler. For mer nøyaktig å definere TRIM59 banket ned arrest cellesyklusen av H1299 enten i G2 eller M fase, vi neste undersøkt PCNA ved immunfluorescens farging og western blot. Som vist i figur 4C, fant vi ut at å slå ned TRIM59 i H1299 celler dramatisk nedregulert farging av PCNA. Morever, western blot resultatet viste også at PCNA protein nivået ble nedregulert (Fig 4D). Samlet utgjør disse resultatene antydet at redusert proliferativ aktivitet i TRIM59 slå ned celler ble forårsaket ved å arrestere cellesyklus i G2-fasen. Interessant, banket ned av TRIM59 har ingen åpenbar effekt på cellesyklus av HBE celler (figur 4A og 4B), kan dette forklare hvorfor slå ned på TRIM59 ikke har signifikante hemmende effekt på veksten av HBE celler fordi hadde ingen virkning på celle syklus.
HBE og H1299 cellene ble transient transfektert med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontroll siRNA eller utransfekterte ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 48 timer. (A) Adherente celler ble samlet opp og cellesyklusanalyse ble utført ved strømningscytometri. Innsatsene viste andelen av celler for hver fase og er merket med forskjellige farger (rosa: G0 /G1 fase grønn: S-fasen, og grå: G2 /M fase). (B) Forholdet mellom cellene i hver fase ble tellet. (C) H1299 celler ble fiksert og farget med anti-PCNA-antistoff (rød) og DAPI (blå). (D) De protein uttrykk nivåer av PCNA i H1299 celler ble undersøkt ved western blot.
Knocking ned av TRIM59 reduseres uttrykket av cellesyklusproteiner
For å belyse mekanismen av cellen syklus arrestert av TRIM59 banket ned, utførte vi Q-PCR for å sjekke mRNA nivåer av flere gener som spiller viktige roller i G2 /M-fasen. Som vist i figur 5A, ble mRNA-nivåene av CDC2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 og CDC25C betydelig redusert i TRIM59 siRNA behandlede celler sammenlignet med den i kontrollen siRNA behandlede celler. Videre har vi undersøkt protein nivåer av cyclin B1, CDC25C og CDK1 av western blot. Som vist i figur 5B, CDC25C og CDK1, men ikke cyklin B1 ble signifikant redusert i TRIM59 siRNA behandlede celler sammenlignet med den for kontroll siRNA behandlede celler. Disse funnene tyder på at sammen TRIM59 er viktig for cellesyklusregulering ved å påvirke cellesyklusproteiner.
H1299-celler transient transfektert med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2 eller kontroll siRNA ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 48 timer. (A) De mRNA uttrykk nivåer av G2 /M-fase relaterte gener CDC2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 og CDC25C ble testet av kvantitativ real-time PCR. (B) protein uttrykk nivåer av CDK1 (også kjent som CDC2), ble CDC25C og cyclin B1 undersøkt ved western blot med angitte antistoffer.
TRIM 59 fremmer NSCLC cellevekst ikke gjennom p53 signalveien
Zhou et al (2014) rapporterte at i mage tumor, samhandler TRIM59 med p53, fremme sin ubiquitinering og degradering; TRIM59 kan fremme gastrisk karsinogenese via denne mekanisme [13]. For å undersøke mekanismen for TRIM59 fremme cellevekst hos NSCLC celler, vi slått ned TRIM59 og sjekket protein nivåer av p53 i NSCLC cellelinjer og HBE celler. For H1299-celler, er det en delesjon p53-cellelinje, ble p53-protein ikke påvises. Forbløffende nok for HBE, H292 og A549 celler, er de cellelinjer for p53 villtype [17], de p53 protein nivåer ble ikke påvirket av TRIM59 banket ned. Men for SPC-A1 celler, ble p53 protein nivåer reduseres når TRIM59 ble slått ned (fig 6). Til sammen foreslått vi at TRIM59 kan fremme NSCLC cellevekst gjennom andre veier, men ikke p53 signalveien.
Fire typer indikert NSCLC celler og HBE celler transient transfektert med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontroll siRNA eller utransfekterte ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 48 timer. De protein uttrykk nivåer av p53 ble undersøkt ved western blot hjelp av anti-p53 og anti-TRIM59 antistoffer.
Diskusjon og konklusjoner
TRIM proteiner utgjør en stor super og er viktige regulatorer av cellulære prosesser, inkludert inflammasjon, immunitet, celleproliferasjon og apoptose, og antiviral [1, 4-6, 10]. Målet med denne studien er å identifisere trim proteiner som er potensielt involvert i å regulere spredning, kolonidannelse og migrasjon av NSCLC celler. Vi brukte Q-PCR for å profilere uttrykket nivåer av 72 TRIM gener i fire NSCLC cellelinjer og et normalt menneske bronkial epitel (HBE) cellelinje. Vi fant at uttrykket nivåer av 10 TRIM gener inkludert TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant oppregulert hos NSCLC celler sammenlignet med i HBE celler, mens uttrykket nivåer av andre 7 TRIM gener inkludert TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 signifikant nedregulert i NSCLC celler sammenlignet med det i HBE celler. Selv om de fleste av TRIM proteiner er dårligere karakteriserte noen TRIM proteiner spiller viktige roller i de cellulære prosessene knyttet til kreft. For eksempel har TRIM3, TRIM16, TRIM29 og TRIM36 blitt rapportert å virke som tumor-suppressorer [18-21]. Interessant nok TRIM7 ble identifisert som glycogenin-veksel protein og er involvert i regulering av cellulær glukosemetabolismen [22]. Som det unike trekk i kreftcellemetabolismen er viktig for vekst og vandring av kreftceller, vil det være viktig å ytterligere undersøke rollen til TRIM7 i den cellulære metabolismen av NSCLC-celler. I tillegg har TRIM67 blitt rapportert å virke som en inhibitor av Ras [23]. Den nedregulering av TRIM67 i NSCLC-celler kan bidra til den over-aktivering av Ras-signalisering og fremfor vekst av NSCLC-celler.
karakterisert ytterligere den biologiske funksjon av TRIM59 i proliferasjon, kolonidannelse og migrering av NSCLC-celler . SiRNA-indusert banket ned av TRIM59 betydelig svekket vekst, kolonidannelse og migrasjon av NSCLC celler, men ikke vesentlig påvirket veksten av HBE celler. Imidlertid in vivo eksperimenter må utføres for å bekrefte disse resultater. Khatamianfar et al. nylig identifisert TRIM59 som et tidlig signal svinger i to (SV40Tag og Ras) onkogene trasé i murine prostatakreft modeller. I tillegg Zhou et al. rapporterte også at TRIM59 fremmes gastrisk tumorigenesis gjennom nedregulering av p53-protein overflod og undertrykkelse av p53 nedstrøms signaler. For å sjekke om TRIM59 fremmer spredning av NSCLC celler også gjennom p53 vei, vi slått ned TRIM59 og sjekket p53 uttrykk. For H1299 celle, er det en delesjon p53-cellelinje, for andre cellelinjer, ingen effekt, eller til og med p53 redusert. Så TRIM59 regulerer spredning og migrasjon av NSCLC celler ved å målrette andre proteiner enn p53.
I konklusjonen, har vi identifisert at TRIM59 er en potensiell viktig regulator for spredning og migrasjon av NSCLC celler. SiRNA-indusert banket ned av TRIM59 betydelig hemmet spredning og migrasjon av NSCLC cellelinjer ved å arrestere cellesyklus i G2-fasen. Videre TRIM59 banket ned påvirket uttrykk for en rekke cellesyklusproteiner inkludert CDC25C og CDK1. Men in vivo fysiologiske rolle og mekanismer for TRIM59 protein må undersøkes nærmere.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. De mRNA uttrykk nivåer av TRIM gener inkludert TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 var signifikant nedregulert i NSCLC cellelinjer sammenlignet med i HBE celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0142596. S001 product: (TIF)
S1 Table. Profilen til uttrykk mønstre av TRIM genet familien i NSCLC cellelinjer.
Vi valgte fire NSCLC cellelinjer inkludert H1299, SPC-A1, A549 og H292. Den humane bronkiale epitelceller (HBE) ble tjente som kontroll. De mRNA nivåer av TRIM genet familie i disse cellelinjene ble målt ved Q-PCR. MRNA uttrykk nivå TRIM gener med syklustider ≥ 34 var fast bestemt på å bli uoppdaget. TRIM17, TRIM40, TRIM42, TRIM43, TRIM48, TRIM49, TRIM50, TRIM51, TRIM63, TRIM60, TRIM64 og TRIM77 var uoppdaget. Mean: gjennomsnitt; SD: standard feil; CT:. Syklus tid
doi: 10,1371 /journal.pone.0142596.s002 plakater (XLSX)
