Abstract
Metnase fusjonsgenet består av et sett histone metyltransferase domene og en transposase domene fra Mariner transposase. Dette transposable element er involvert i kromosom decatenation, forbedrer DNA reparasjon, fremmer fremmed DNA integrasjon, og bistår topoisomerase II-funksjonen. Denne studien undersøker rolle Metnase i tykktarmskreft homeostase og vedlikehold av stemness fenotype i tykktarm kreft stamceller (cscs). Stanse av Metnase ble utført i humane kreftcellelinjer før og etter behandling med cisplatin, og i kolon cscs. Senere endringer i uttrykket av gener involvert i reparasjonsmekanismer, DNA-syntese, topoisomerase II-funksjon, og metastaser samt stemness transkripsjonsfaktorer ble undersøkt med RT-qPCR eksperimenter. Cellulær levedyktighet og apoptose ble evaluert ved flow cytometri. Resultatene tyder på at Metnase påvirker ekspresjonen av mange gener som er involvert i de ovenfor angitte prosesser. Videre Metnase nivåer ser ut til å påvirke ved ekspresjon av Nanog, OCT3 /4, og SOX2. Undertrykkelse av Metnase førte også til en økning i apoptose. Derfor kan Metnase ha en viktig rolle i DNA-reparasjon, topoisomerase II-funksjon, og vedlikehold av stemness under tykktarmskreft utvikling
Citation. Apostolou P, Toloudi M, Kourtidou E, Mimikakou G, Vlachou jeg, Chatziioannou M, et al. (2014) potensielle rolle for Metnase Transposase Fusion Gene i Colon Cancer gjennom forskrift av nøkkelgener. PLoS ONE 9 (10): e109741. doi: 10,1371 /journal.pone.0109741
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 18 juni 2014; Godkjent: 08.09.2014; Publisert: 15 oktober 2014
Copyright: © 2014 apostolou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Alle forfatterne er ansatt i forsknings Genetisk Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Ltd), og mottok lønn fra R.G.C.C. Ltd, som finansierte studien. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er ansatt i forsknings Genetisk Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Ltd). Den R.G.C.C. Ltd finansiert denne studien. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Metnase er en fusjonsgenet med en SET histon metyltransferase domene og en Mariner transposase domene. Flere av de viktigste funksjonene til HsMar1 transposase er delt med Metnase [1]. Metnase er en ikke-homolog ende-sammenføyning (NHEJ) reparasjon protein [2], og er involvert i mange cellulære prosesser, inkludert formidling av fremmed DNA integrasjon, kromosom decatenation [3], og DNA-reparasjon [4] og replikering [5]. Metnase formidler ytterligere motstand mot topoisomerase II-inhibitorer gjennom en interaksjon med topoisomerase (DNA) II alfa (TOP2A) [6]. Disse etablerte roller i kombinasjon med nyere eksperimentelle data tyder på at Metnase kan ha en avgjørende rolle i kreftutvikling og progresjon, noe som kan utnyttes under kreftbehandling.
Tykktarmskreft er den nest største årsaken til kreft hos kvinner, de tredje hos menn, og den fjerde vanligste årsaken til kreftdød samlet [7]. Bruk av platinabaserte kjemoterapeutika er vanlig i behandlingsregimer. Men mange pasienter enten ha eller utvikle resistens mot disse forbindelser [8]. Videre kreft stamceller (cscs) har evne til selvfornyelse og er resistens mot kjemoterapi og strålebehandling [9]. Derfor er forbedringer av dagens behandlingsstrategier nødvendig.
Denne studien undersøker sammenhengen mellom Metnase genekspresjon og tykktarmskreftutvikling. Som transposable genetiske elementer som er innblandet i genomet omleiring, kan de regulere mange transkripsjonsfaktorer. Disse faktorene kan i sin tur regulerer gener som er involvert i motstand, metastaser, eller apoptose. En evaluering av komplement av gener som påvirkes av Metnase samt deres sammenheng med grunnleggende cellulære aktiviteter kan øke vår forståelse av hvordan Metnase påvirker kreftutvikling. Slik kunnskap vil også kunne bidra til forbedringer i kreft behandling programmer.
Denne studien undersøker uttrykk nivåer av flere gener viktige i cellulær utvikling og DNA-syntese og reparasjon før og etter knockdown av Metnase av siRNA. Disse genene var DNA excision reparasjon protein (ERCC1), dipeptidylpeptidase IV (CD26), Met proto-onkogen (cMET), TOP2A, topoisomerase (DNA) II beta (TOP2B), tymidylatsyntase (TYMS) og DNA (cytosin-5-) metyltransferase 1 (DNMT1). Effekten av Metnase lyddemping ble også undersøkt i en kolorektal kreft cellelinje etter behandling med cisplatin. Mens oksaliplatin er hovedsakelig brukt i kliniske settinger, her ønsket vi å undersøke hvilken rolle Metnase i en resistent cellelinje. I henhold til eksperimenter som tidligere ble utført i HCT-116-cellelinjen, har vi funnet at flere resistensmekanismer utvikles etter behandling med cisplatin. Til slutt ble en potensiell sammenheng mellom Metnase og vedlikehold av stemness fenotype av tykktarms CSC forsket av stanse Metnase og måle nivåene av Nanog, POU klasse 5 homeobox1 (OCT3 /4), og SRY (sex bestemme region Y) -box2 (SOX2) , som alle har viktige roller i vedlikehold av stemness [10], [11].
Materiale og metode
Cell Kultur
menneske~~POS=TRUNC kolon cscs (36112-39P ; Celprogen, CA, USA) og HCT-116 human colon carcinoma celler (91,091,005; ECACC, UK) ble dyrket i et passende vekstmedium (M36112-39PS, Celprogen, og D5546; Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) supplert med 10% FBS (10270-106, Gibco, NY, USA) i 25 cm
2 kolber (E36102-29P-T25, Celprogen, og 430639, Corning, NY: USA) ved 37 ° C i 5% CO
2 miljø. HCT-116-celler ble også behandlet med 1 mg /ml cisplatin (P4394; Sigma-Aldrich). For mer enn 10 passeringer og dyrket på lignende måte som
siRNA transfeksjon
I løpet av den eksponensielle veksten fase, ble cellene sådd ut i 24-brønners plater (E36112-39, Celprogen, og 831,836, Sarstedt, Nümbrect, Tyskland) og transfektert med Metnase-spesifikk siRNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 Reagent (11668-027, Invitrogen, CA, USA), ifølge til produsentens instruksjoner. SiRNA (5′-UAAAACCUCACCAGCAUAUUU-3 «) ble utformet i samsvar med reglene i Reynolds et al. [12] og underkastet BLAST analyser for å sikre spesifisitet. Etter 48 timers inkubering ble cellene høstet ved trypsinering (25200-072, Invitrogen). Bruktbil alene og uspesifikke siRNA kontroller ble inkludert. MRNA-knockdown ble beregnet i forhold til ikke-målsøkende kontroll siRNA i hvert forsøk. Forsøkene ble gjentatt tre ganger i tre eksemplarer. Ekspresjonsnivået av genet av interesse og prosentknockdown ble beregnet ved hjelp av sammenlignende Ct metode:
Evaluering av celler
Celler ble evaluert av cellulære og molekylære assays. Cellulære forsøk var basert på evnen til cscs til å danne mikrosfærer. Kulturene har tidligere blitt evaluert ved genekspresjon analyse av spesifikke transkripsjonsfaktorer, slik autentisering av cellelinjer ble utført ved å måle den korte tandem gjentagelse profil og sammenligne med produsentens profil. Dyrking av cscs ble gjennomført i over 30 passasjer å utelukke muligheten for å innlemme embryonale stamceller (ESCs) i forsøkene, siden cscs er udødelig i motsetning ESCs.
Molekylære analyser
RNA fra cellekulturer ble ekstrahert med RNeasy mini kit (74105; Qiagen, Hilden, Tyskland). RNA-prøvene ble evaluert både spektrofotometrisk og ved agarosegelelektroforese visualisering av 18S-28S band. Genomisk DNA ble fjernet ved hjelp av RNase-fri DNase (79254; Qiagen) .Subsequently, 1 ug av dette RNA ble anvendt som et templat for cDNA-syntese med en iScript cDNA syntese kit (1,708,891; Bio-Rad, CA USA). Real-time PCR ble utført ved hjelp av iTaq Universal SYBR Grønn Supermix (1725124, Bio-Rad) med hver prøve i tre eksemplarer. Spesifikke primere for hver markør og for en endogen kontroll genet (18S rRNA) ble utformet med Genamics Expression 1.1 programvare [13] – [16]. Primer sekvenser ble analysert ved BLAST å ekskludere de som forsterkes uønskede gener. Tabell 1 viser sekvensene av primerne
PCR-reaksjonen programmet var som følger: a. Første denaturering ved 95 ° C, 50 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, etterfulgt av hybridisering ved 59 ° C i 30 sek. En endelig forlengelse trinn ble utført ved 72 ° C i 10 minutter, etterfulgt av smelting kurve analyse. Data ble analysert i henhold til metoden ifølge Livak og Schmittgen [17]. I alle PCR-reaksjoner, ble passende kontroller anvendt. Den positive kontrollen var cDNA fra en universell menneskelig Reference RNA (740000-41, Agilent, CA, USA) og negative kontrollene var ingen mal, no-enzym styrer samt humant genomisk DNA (G304A, Promega, WI, USA). Til slutt ble en no-revers transkripsjon kontrollen som brukes i cDNA syntese. Standard-kurver av alle primere er presentert i figur S1
Strømningscytometri
Celler ble farget med PE Annexin V og 7-amino-Actinomycin. (559763; BD Biosciences, CA, USA) for 15 min etterfulgt av resuspensjon i 0,5 ml slire væske (8546859, Beckman Coulter, Nyon, Sveits) og flowcytometri analyse av mer enn 50.000 hendelser. Dataene ble analysert med FCS Express programvare (DeNovo). I hvert tilfelle egnede positive og negative kontroller ble brukt
Statistical Analysis
Den kvantitative polymerase chain reaction (qPCR) Resultatene ble vurdert i henhold til Kolmogorov-Smirnov test.; Alle prøver hadde normalfordeling. Medianverdier ble anvendt for analysen. Mann-Whitney tester ble også utført på qPCR data [18], [19]. Alle forsøkene ble utført på triplikate tre ganger. En p-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Gene Expression
stanse av Metnase uttrykk av siRNA var opp til 65% effektiv i HCT-116 celler, 52. % i HCT-116 celler behandlet med cisplatin, og 40% i tykktarm cscs (figur 1-3). Undertrykkelse av Metnase i HCT-116 celler førte til en økning i CD26 genekspresjon og en reduksjon i uttrykket av alle andre gener målt Nedgangen var høyere for TOP2A, TOP2B, ERCC1, TYMS, og DNMT1, alt 25-35%, mens et mindre fall på 5-10% av cMET ekspresjon ble observert (figur 1). ERCC1 er involvert i DNA reparasjonsprosesser, og dens uttrykk har blitt koblet med følsomhet på denne cellelinjen til platinaforbindelser [20].
Relativ genekspresjon av transkripsjonsfaktorer i Colon cscs følgende Metnase knockdown. Prosentandelen av Metnase knockdown nådd 40%. Den ΔΔCt metoden ble brukt til å utføre analysen. Hver søyle representerer gjennomsnittet av Ct-verdier. Analysene ble utført in triplo og en p-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. I kontrollprøven gjennomsnittsverdien er 1,00 som indikerer at det ikke er noen forandring i genekspresjon. Verdier 1 indikerer en økning i gen-ekspresjon, mens verdier mindre enn 1 indikerer en reduksjon i genekspresjon. Betingelsene for senere eksperimenter var de samme.
Relativ genekspresjon av transkripsjonsfaktorer i HCT-116 celler etter Metnase knockdown. Prosentandelen av knockdown nådd 65%.
Relativ genekspresjon av transkripsjonsfaktorer i HCT-116 celler behandlet med cisplatin, etter Metnase knockdown. Prosentandelen av knockdown nådd 52%.
Vi observerte lignende resultater i HCT-116 celler behandlet med cisplatin. Den forbedrede reduksjon av topoisomerase II-gen-ekspresjon observert etter Metnase stanse i HCT-116-celler behandlet med cisplatin sammenlignet med de ikke behandlede er også bemerkelsesverdig. TYMS og DNMT1 uttrykk ble redusert med opp til 60%, mens TOP2B uttrykk ble redusert med 18-35% og cMET med nesten 40%. ERCC1 nivåer ble ikke påvirket, noe som indikerer at behandling med cisplatin for mange passasjer fører til utvikling av resistensmekanismer (figur 2).
Etter å stanse all Metnase i tykktarm cscs, den eneste gen målt som vist økt uttrykk var CD26. En reduksjon ble observert for de TYMS og TOP2A gener, mens ekspresjonen av ERCC1, cMET, og TOP2B først upåvirket (figur 3). Disse resultatene viste at cscs er mer motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske midler enn differensierte kreftceller. Totalt sett er uttrykk nivåer av gener anses som stemness transkripsjonsfaktorer ble redusert etter stanse av Metnase uttrykk i cscs. Denne reduksjonen i ekspresjon var opp til 60% for SOX2, 40% for OCT3 /4 og 45% for Nanog (figur 4).
Relativ genekspresjon analyse av stemness transkripsjonsfaktorene Nanog, OCT3 /4, og SOX2 følgende Metnase knockdown.
Cell Livskraftig-apoptose
antall celler som gjennomgår apoptose som bestemmes av flowcytometri ble doblet etter undertrykkelse av Metnase uttrykk i både HCT-116 og HCT- 116 + cisplatin celler. En økning i antall døde celler ble også observert. Imidlertid cellulær levedyktighet ble ikke vesentlig endret. I kolon cscs, redusert cellelevedyktighet følgende Metnase stanse, men ble ikke observert noen endring i antall celler som gjennomgår apoptose. Populasjonen av døde celler var høyere i HCT-116-cellelinjen enn i de to andre. Dette kan være forårsaket av de resistensmekanismer som utvikler seg i den cisplatin-behandlet cellelinje, eller slike mekanismer kan opprinnelig finnes i cscs. Tabell 2 viser data for hver cellelinje.
Diskusjoner
Metnase fusjonsgenet methylates histon H3 på lysin 36 og besitter mange egenskaper ved en transposase, inkludert terminal invertert gjenta sekvens-spesifikk DNA-binding og DNA looping [21]. Men det kan ikke fullføre innarbeiding reaksjoner. Gjennom sin metylering aktivitet, Metnase innblandet i DNA-reparasjon av NHEJ veien. Dette reparasjon aktivitet krever et samspill med Pso4 [22]. Den ERCC1 protein er også involvert gjennom nucleotide excision reparasjon [23]. Denne studien tyder på at det eksisterer en sammenheng mellom ERCC1 uttrykk og Metnase. Nærmere bestemt, undertrykkelse av Metnase førte til redusert ekspresjon av genet reparasjon, men denne reduksjonen var mindre uttalt når cellene ble behandlet med cisplatin. Dette støtter ytterligere en rolle for ERCC1 i cisplatinbehandling.
TOP2A er den primære decatenation enzymet, løse floker eller catenated kromatider [24]. Denne studien bekrefter også at Metnase formidler resistens mot topoisomerase II-a-hemmere, med genekspresjon av TOP2A påvirket mer enn andre gener følgende Metnase knockdown. Denne nedgangen ble forsterket i celler behandlet med cisplatin og i cscs. Videre, undertrykkelse av både TOP2A og TOP2B ble observert, noe som indikerer at Metnase kan være et mål for kombinasjonskjemoterapi med topoisomerase II-inhibitorer.
Ekspresjon av dipeptidylpeptidase IV (CD26) er korrelert med tykktarmskreft progresjon og CD26 + cscs ha er identifisert i humant tykktarmskreft. Her ble CD26 genekspresjon økt i alle tilfeller av Metnase knockdown. Dette enzymet er forbundet med immunregulering, signaltransduksjon og apoptose. Dette indikerer at Metnase er involvert i regulering av apoptose, kanskje gjennom et samspill med CD26 [25].
cMET proto-onkogen koder hepatocytter vekstfaktorreseptor og er nært knyttet til kreftutvikling. Avvikende aktivering av cMET fører til tumorvekst, angiogenese og metastase til slutt. I motsetning til normale stamceller, cscs uttrykke cMET, tilrettelegging utholdenhet kreft og spre [26]. Negative tilbakemeldinger regulering av MET-avhengig invasiv vekst av Notch har blitt vist i Drosophila [27], og Notch gener også regulere MET hos mennesker [28]. Men denne studien fant ingen sammenslutning av cMET nivåer med de av Metnase transposase.
Vi har observert en sammenheng mellom Metnase og to gener viktige i DNA homeostase, TYMS og DNMT1. Genekspresjon av både ble redusert i alle cellelinjer følgende stanse av Metnase uttrykk. TYMS genererer tymidin-monofosfat som deretter fosforylert til tymidintrifosfat for bruk i DNA-syntese og reparasjon [29]. DNMT1 er et enzym som er involvert i reguleringen av metylert cytosinrestene, og dens avvikende metylering er assosiert med utviklingen av kreft [30]. Denne reduksjonen i nivåene av TYMS og DNMT1 ble forbedret i celler behandlet med cisplatin. Derfor kan Metnase bli innblandet i kreftutvikling og etablering gjennom interaksjon med eller påvirkning av flere enzymer som innehar viktige roller i kreft.
Vi har også undersøkt sammenhengen mellom Metnase og transkripsjonsfaktorer avgjørende for å opprettholde stemness. Cscs er definert av evnen til å fornye seg selv, differensiere, og sprer. Cscs uttrykke mange transkripsjonsfaktorer markører, men det viktigste er Nanog, OCT3 /4 og SOX2 genet. Nanog er uttrykt i ESCs og har en nøkkelrolle i å opprettholde pluripotency. Dens overekspresjon forårsaker selvfornyelse i ESCs, mens dens fravær fører til differensiering [31], [32]. For å opprettholde stemness, blir tilstedeværelsen av to ytterligere transkripsjonsfaktorer, OCT3 /4 og SOX2 nødvendig. OCT3 /4-ekspresjon er også forbundet med en udifferensiert scene og selvfornyelse, som danner en heterodimer med SOX2 og sammen disse to proteinene binder seg til DNA. SOX2 er en transkripsjonsfaktor avgjørende for å opprettholde pluripotency, men ektopisk uttrykk kan være involvert med unormal differensiering av kolorektal kreft celler [33], [34]. Knockdown av Metnase førte til redusert genekspresjon av alle transkripsjonsfaktorer, noe som indikerer at Metnase kan være involvert i kreft etablering samt i kreftutvikling og framgang.
Cellular levedyktighet dukket upåvirket av Metnase knockdown. Den cisplatin-behandlede cellelinjen viste seg å ha færre døde celler i sammenlignet med den ikke-behandlede cellelinje. Lignende funn ble oppnådd ved hjelp av kolon cscs. Dette støtter ytterligere motstanden i kjemoterapi observert i cscs. Imidlertid Metnase stanse gjorde innvirkning på antall celler som gjennomgår apoptose. Disse kan forklares med utviklingen av alternative apoptose-unndra mekanismer utviklings i cscs sammenlignet med det behandlede cellelinje.
Denne studien identifiserer at Metnase fusjonsgenet er tungt involvert i DNA-reparasjonsmekanismer, DNA-syntese, topoisomerase II motstand, apoptose, og vedlikehold av stemness fenotype i tykktarmskreft. Videre studier er nødvendig for å belyse detaljer om disse interaksjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
standardkurver – standardkurver for alle primere brukes. A: 18S rRNA, B: Metnase, C: ERCC1, D: cMET, E: CD26, F: TOP2A, G: TOP2B, H: TYMS, I: DNMT1, J: Nanog, K: OCT3 /4, og L: . SOX2
doi: 10,1371 /journal.pone.0109741.s001 plakater (TIF)
