Abstract
Bakgrunn
Det er et økende behov for nøyaktige biomarkører for tidlig non-invasiv tykktarms deteksjon kreft. Vi benyttet et genom-skala markør oppdagelse metode for å identifisere og kontrollere kandidat DNA metylering biomarkører for blodbasert deteksjon av tykktarmskreft.
metodikk /hovedfunnene
Vi brukte DNA-metylering data fra 711 kolorektal svulster, 53 matchet tilstøtende-normal colonic vevsprøver, 286 friske blodprøver og 4,201 tumorprøver av 15 forskjellige krefttyper. DNA-metylering data ble generert av Illumina infinium HumanMethylation27 og HumanMethylation450 plattformer, som bestemmer metylering status for 27,578 og 482,421 CpG områder hhv. Vi først utført en flertrinns markør utvalg for å identifisere kandidat markører med høy metylering tvers av alle kolorektal tumorer mens husing lav metylering hos friske prøver og andre krefttyper. Vi brukte deretter pre-terapeutiske plasma og serumprøver fra 107 pasienter med kolorektal kreft og 98 kontroller uten tykktarmskreft, bekreftet av koloskopi, for å kontrollere kandidat markører. Vi valgte to markører for videre evaluering: metylert
THBD plakater (THBD-M) og denaturert
C9orf50 plakater (C9orf50-M). Når testet på kliniske plasma- og serumprøver disse markørene utkonkurrerte carcinoembryonic antigen (CEA) serum måling og resulterte i en høy sensitiv og spesifikk test ytelse for deteksjon tidlig tykk- og endetarmskreft.
Konklusjon /Betydning
systematisk markør oppdagelse og verifikasjon studie for blodbaserte DNA-metylering markører resulterte i to nye kolorektal kreft biomarkører, THBD-M og C9orf50-M. THBD-M i særdeleshet viste lovende resultater i kliniske prøver, begrunner den videre optimalisering og klinisk testing
Citation. Lange CPE, Campan M, Hinoue T, Schmitz RF, van der Meulen-de Jong AE, Slinger H , et al. (2012) Genome-Scale Funn av DNA-Metylering Biomarkører for blodbaserte Påvisning av tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (11): e50266. doi: 10,1371 /journal.pone.0050266
Redaktør: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, USA
mottatt: 08.08.2012; Godkjent: 17 oktober 2012; Publisert: 28.11.2012
Copyright: © 2012 Lange et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. forfatterne ønsker å erklære at PW Laird har følgende patenter på MethyLight teknologi ( «Process for høy gjennomstrømming DNA Metylering Analysis», US Patent # 6,331,393; Dato Arkivert: May 14, 1999; Utstedelsesdato: 18. desember 2001. «Process for høy gjennomstrømming DNA Metylering Analysis «, US patent # 7,112,404; Dato Arkivert: 10 desember 2001, Utstedelsesdato: 26. september 2006.» Prosess for høy gjennomstrømming DNA Metylering Analysis «; Dato Arkivert: 10 desember 2001, Utstedelsesdato: 30. juni 2009), som er lisensiert til Epigenomics AG. I tillegg, P.W. Laird, D.J. Weisenberger, og M. Campan er navngitt som oppfinnere på følgende patentsøknad for Digital MethyLight teknologi ( «DNA Metylering Analyse av Digital Bisulfite Genomisk Sequencing og Digital MethyLight»; Pub App No: 20080254474, Dato Arkivert: 14. april 2008) . D.J. Weisenberger er konsulent for Zymo Research. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatterne, og i henhold til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en vanlig sykdom med anslagsvis 143,460 nye tilfeller i USA i 2012 [1]. CRC er den tredje hyppigst diagnostisert kreft hos menn og kvinner i den vestlige verden, og en betydelig andel av pasienter som har CRC vil ha fjernmetastaser (stadium IV) ved diagnose, som ofte er uhelbredelig. Det er klart at lokalisert kreft (stadium I /II) som detekteres tidlig er mer mottagelig for kurativ terapi, tilbyr overlegen prognose [2], [3]. Følgelig kan diagnostiske metoder som fører til tidlig oppdagelse av ondartet eller premaligne sykdom har betydelige kliniske fordeler, redusere dødelighet og sykelighet hos pasienter med tykktarmskreft. Tilgjengelige potensielle screening teknikker for CRC inkluderer fekal okkult blod test, dobbel kontrast barium klyster, endoskopi, med preferanse for pancolonoscopy, og virtuell koloskopi [4], [5]. Målingen av serum carcinoembryonic antigen (CEA) er også blitt foreslått som en mulig screening modalitet men det mangler tilstrekkelig følsomhet til å detektere CRC på et tidlig stadium, og dens nivå er også forhøyet i ikke-maligne sykdommer (f.eks divertikulitt, gastritt, diabetes) [6].
En optimal screening test forventes å være svært følsom og spesifikk, ikke utgjør noen risiko for pasientene, og har høy pasientaksept. Det bør også være kostnadseffektive og enkle å utføre. Som dagens screening prosedyrer mangler tilstrekkelig positiv prediktiv verdi, krever ubehagelig forberedelse eller forårsake ubehag, er det behov for å utvikle nye ikke-invasive tester for påvisning av CRC på en scene tidlig nok for behandling skal være vellykket. DNA metylering markører er lovende verktøy som kan være nyttig for påvisning tidlig kreft. I det siste tiåret har det blitt klart at kreftcellene har avvikende mønster av DNA-metylering, og at disse avvik kan påvises i tumor-avledet DNA som finnes i plasma eller serum fra cancerpasienter [7], [8]. Flere studier har dokumentert tilstedeværelse av fritt DNA stammer fra solide tumorer i blodet av kreftpasienter, noe som øker muligheten for å påvise disse kreft-spesifikke molekyler i fag med eksisterende sykdom [9] -. [22]
En rekke studier har allerede rapportert ved bruk av DNA-metylering markører for blod basert deteksjon av CRC med varierende resultater [9] – [22]. Men de fleste av disse studiene har stolt på testing av et begrenset antall forhåndsvalgte gener og bruken av ikke-kvantitative gjenkjenningsmetoder, så som gel-basert metylering-spesifikk PCR. Målet med denne studien er å identifisere blodbaserte DNA metylering biomarkører for CRC bruker et genom-skala DNA metylering tilnærming for markør oppdagelse og å teste utvalgte markører i pre-operative kliniske blodprøver fra pasienter som gjennomgår kurativ kirurgi for CRC.
Metoder
menneske~~POS=TRUNC Prøver og etikk erklæringen
De lokale og regionale institusjonelle gjennomgang boards godkjent denne studien. Informert samtykke ble oppnådd fra alle deltakende pasienter og kontroller. Pre-terapeutiske plasma og serumprøver ble innhentet fra CRC pasienter i poliklinikk via blodprøvetaking av median cubital blodåre fra april 2008 til desember 2011. Plasma og serum ble isolert innen 30 minutter venepunktursted som tidligere beskrevet [22]. Hver plasma eller serumprøve ble ytterligere delt i to separate rør og lagret ved -80 ° C inntil behandling. Serumet CEA ble målt ved hver venepunktursted i CRC-pasienter.
Kontroller ble definert som individer uten CRC eller malignitet i de siste fem årene, og ble inkludert i denne studien ved endoskopi avdelingen. Personer som gjennomgår koloskopi, som viste ingen tegn til en kolorektal kreft, var kvalifisert til å delta. Indikasjoner for koloskopi for disse pasientene var overvåknings colonoscopies grunn av inflammatorisk tarmsykdom (IBD, Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt), positiv familiehistorie med CRC, gastrointestinale klager eller rektal blodtap. En erfaren gastroenterolog utført alle koloskopier. Pasienter med mild, kontrollert IBD ble inkludert, så lenge det var mulig å pålitelig inspisere colonic slimhinnen ved koloskopi
og Selge hvis overvåkings biopsier som er rutinemessig tatt langs hele colorectal skrift var patologisk normal (viser ingen tegn til dysplasi). Plasma- og serumprøver ble isolert fra disse individer som bruker den samme protokoll som for CRC-pasientene.
CRC-vev ble oppnådd i løpet av kirurgisk fjerning av tumoren, og straks sendt til patolog. Patologen dissekert en representativ del av svulsten og lagret i frisk-frosne prøve ved -80 ° C i løpet av en time etter kirurgisk reseksjon. I tillegg ble en patologisk normal kolon prøve tatt minst 10 cm fra kanten av svulsten og lagres på samme måte
Marker Discovery:. Technologies og datasett
I markør oppdagelsen fasen av denne studien brukte vi DNA-metylering data generert av Illumina infinium HumanMethylation27 BeadChip® (HM27) og HumanMethylation450 BeadChip® (HM450) plattformer. Den infinium assay kvantifiserer DNA-metylering nivåer på bestemte cytosinrestene i tilknytning til guaninrester (CpG loci), ved å beregne forholdet (β-verdi) av intensitetene mellom locus-spesifikke metylerte og unmethylated kulebundne prober. Den β-verdien er en kontinuerlig variabel, som strekker seg fra 0 (unmethylated) til 1 (fullt metylert) [23]. Den HM27 BeadChip® vurderer DNA metylering nivået 27,578 CpG områder som ligger i promotorområdene av 14,495 proteinkodende gener. Den HM450 BeadChip® evaluerer DNA metylering status for 482421 CpG loci og dekker 99% av RefSeq gener og 96% av UCSC CpG øyer (www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq, www.illumina.com).
Vi brukte tilgjengelige infinium HM27 og HM450 data fra 711 tykktarmssvulster, 53 matchet prøvene tilstøtende-normal colonic vev og 10 perifere blod lymfocytter (PBL) prøver av friske individer for å identifisere og kontrollere kandidat DNA metylering tumormarkører. I tillegg har vi brukt infinium data fra offentlig tilgjengelige datasett (GEO og TCGA) representerer 274 sunne PBL prøver og 4,201 vevsprøver ondartede fra 15 ulike krefttyper for å maksimere CRC spesifisitet (se tabell 1). P-verdier på 611 CRC svulster og 24 matchede prøvene colonic vev tilstøtende normalt ble hentet fra DNA metylering datasettet for CRC lagt ut på The Cancer Genome Atlas (TCGA) Portal (http: //tcga-data.nci.nih. gov /TCGA /tcgaHome2.jsp). Data over de andre 100 CRC svulster og 29 matchede prøvene tilstøtende-normal colonic vev ble generert på USC epigenome Center i en tidligere studie [24]. Infinium data for 274 PBL prøver ble lastet ned fra Gene Expression Omnibus (GEO) database ved National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, tiltredelse antall GSE 19711). Dataene for de 10 gjenværende PBL prøvene ble generert ved hjelp av HM27 plattform for en tidligere markør funn studie ved USC epigenome Senter [25]. Dokument S1 oppsummerer arkivnumrene til alle offentlig tilgjengelige GEO og TCGA datasett er brukt i denne studien. DNA metylering status ble vurdert ved hjelp av HM27 BeadChip for 336 CRC prøver, 29 normal kolon prøver og 274 PBL prøver (Tabell 1). For de resterende 375 CRC-tumorer og for 24 normale tykktarm prøvene, ble DNA metylering status evaluert med HM450 BeadChip (tabell 1). Vi har også generert HM450 data på to PBL-prøver fra samlingen av 10 studeres på HM27 plattformen. Av de 375 CRC, data fra kun 40 prøvene var tilgjengelig på det tidspunktet vi utførte markør oppdagelse. DNA-metylering av data for de andre 335 CRC-tumorer ble ikke brukt i den markør seleksjonsalgoritmen. Vi fikk imidlertid bruke disse dataene til å bekrefte de siste to markørene utvalgte
Marker Discovery. Avgrensninger
Vi ansatt en flertrinns filtreringsprosess i discovery fasen av denne studien. DNA-metylering data som genereres av de to forskjellige BeadChips (HM27 og HM450) ble analysert hver for seg, men ved anvendelse av de samme filtreringsfremgangsmåten (figur 1 og 2). Vi startet ved å utelukke alle infinium sonder som feilet i noen av prøvene. HM27 prober som ikke ble entydig justert til det humane genomet (hg19, GRCh37), eller som er forbundet med enkelt nukleotid (SNP) i løpet av 10 basepar fra målet CpG (identifisert ved hjelp av NCBI dbSNP bygger 126 og 128), eller prober som omfattes repeterende elementer (identifisert av RepeatMasker) ble også ekskludert. Vi er fast bestemt på høyeste β-verdi for hver sonde i 10 friske PBL prøver (β-PBL
H) og 10
th persentil av CRC kreftbetaverdier (β-CRC
10) (Figur 2A). Vi utelatt alle sonder med en β-PBL
H høyere enn 0,2 eller høyere enn den tilhørende β-CRC
10. Vi så filtrert de resterende sondene mot normal tykktarm vev og 15 andre krefttyper. I detalj fant vi ut middelverdien β-verdien av hver sonde i normal tykktarm vev (β-NC
M) og fjernet alle sonder som hadde en β-NC
M verdi som er høyere enn 0,2 eller høyere enn den tilhørende β -CRC
10 verdi (figur 2B). Vi valgte de 25 beste merkene i begge datasett etter vurdering sondene basert på forskjellen mellom β-CRC
10 og β-PBL
H (figur 2C). For filtreringen mot andre krefttyper, bestemt vi middelverdien β-verdi (β-OC
M) for de gjenværende sondene i hver krefttype og fjernet alle sonder som hadde en β-OC
M høyere enn den midlere CRC β-verdi (β-CRC
M). De resterende prober ble valgt for MethyLight reaksjon design og videre evaluering.
Vi brukte DNA-metylering data fra infinium HumanMethylation27 Beadchip (HM27) og HumanMethylation450 Beadchip (HM450) infinium plattformer for å screene 27578 (HM27) og 482421 (HM450 ) CpG loci for deres metylering status i CRC prøver, PBL prøver fra friske personer, sammenkoblede normal kolorektal vevsprøver (NC) og 15 andre typer kreft (OC). Vi brukte en trinnvis måte å eliminere sonder som feilet i noen av prøvene, prober som inneholdt SNP’er eller gjentatte sekvenser, prober med en høyest PBL β-verdi (β-PBL
H) eller en midlere normal tykktarm vev β-verdi ( β-NC
M) høyere enn det tilhørende 10. persentil av CRC-tumor p-verdier (β-CRC
10) eller høyere enn 0,2 i noen av PBL eller NC prøver (infinium panel). De resterende prober ble rangert basert på forskjellen mellom β-CRC
10 og β-PBL
H og topp 25 ble valgt ut fra begge datasett (HM27 og HM450) for å filtrere mot OC prøver. Prober med en gjennomsnittlig OC β-verdi høyere enn den tilhørende middel CRC β-verdi (β-CRC
M) ble eliminert. Totalt 15 MethyLight reaksjoner (markører) ble laget for 10 prober og testet i en sekvens av verifikasjon trinn (MethyLight panel). Markører ble eliminert hvis deres prestasjoner var suboptimal i kontroller som
in vitro
metylert
Sss
en DNA, PBL og plasmaprøver fra friske kontroller og CRC tumorvev. Markører ble også eliminert hvis de ikke klarte å oppdage CRC metylert DNA i sammenslått plasma og serum fra CRC pasienter. To markører møtte alle utvalgskriteriene og ble avansert i rørledningen for ytterligere bekreftelse på individuelle pasientprøver. (* Prober som feilet i noen av prøvene, så vel som de som er inkludert SNP’er, og gjenta sekvenser; ** Andre krefttyper som brukes i denne undersøkelsen er oppsummert i tabell 1, *** M.
Sss
I behandlet DNA)
A (øverste figur. HM27, bunn figur: HM450), scatterplots av høyeste PBL β-verdi (β-PBL
H) på 10 (HM27) og 2 (HM450) friske kontrollprøver (X-aksen) mot den tilknyttede 10. persentil av CRC kreftbetaverdier (β-CRC
10) på Y-aksen. De blå prikkene representerer de eliminerte sonder (HM27: n = 23049; HM450: n = 367,833) og de røde prikker (HM27: n = 695, HM450: n = 30 207) representerer tilbakeholdt sonder med en β-CRC
10 p-PBL
H eller en β-PBL
H 0,2. B, scatterplots av den midlere normal tykktarm vev β-verdi (β-NC
M) for de tilbakeholdte prober fra Panel A (X-aksen) mot det tilhørende β-CRC
10 (Y-aksen). De røde prikkene (HM27: n = 512; HM450: n = 28,428) representerer eliminert sonder, de grønne prikkene representerer tilbakeholdt sonder (HM27: n = 183, HM450: n = 1779) med en β-CRC
10 p-NC
M, eller en β-NC
M 0,2. C, scatterplots av de tilbakeholdte prober fra Panel B (grønn) som vises ved forskjellen mellom β-CRC
10 og β-PBL
H (X-aksen) mot tilhørende β-CRC
10 (Y -akser). Prikkene innenfor den gule firkanten er sondene som er valgt for ytterligere filtrering mot andre typer kreft. De hvite piler peker ut sondene til de to kandidat markører. D, ROC-kurver for probene som benyttes i multipleks reaksjonen basert på metylering p-verdier på 335 uavhengige kolorektal kreft prøver og 23 uavhengige passet prøvene normale tykktarms vev (de DNA-metylering data til disse prøvene ble ikke brukt i den markør oppdagelse rørledningen). Den mørke grå farge er arealet under kurven.
DNA Extraction og Bisulfite Modification
DNA fra to friske PBL prøver og 25 CRC tumorprøver ble hentet i henhold til den tidligere beskrevet protokollen [25]. DNA fra plasma og serumprøver ble ekstrahert med QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen), spesielt utviklet for å gjenopprette et maksimumsbeløp på sirkulerende cellefritt DNA fra serum eller blod. Den Zymo® EZ DNA metylering kit (Zymo Research) ble brukt til å bisulfit konvertere hentet DNA. Alle ekstraksjoner og konverteringer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Kvaliteten og kvantiteten av bisulfitt-konvertert DNA, så vel som fullstendigheten av bisulfitt omvendt, og ble vurdert ved hjelp av et panel av kvalitetskontroll reaksjoner som tidligere beskrevet [26].
MethyLight Analyse
Den MethyLight-analysen ble utført som tidligere beskrevet [27]. Sekvensen av de MethyLight primere og prober som brukes i disse analysene er beskrevet i tabell S1. De MethyLight reaksjoner ble evaluert i fire trinn. Først, M.
Sss
I (New England Biolabs) ble behandlet PBL DNA (Promega) ble anvendt for å bestemme om reaksjonen forsterkes
in vitro
metylert kontroll-DNA [28]. Reaksjoner med en syklus terskel [C (t)] høyere enn 35 ble ekskludert. For det andre, ble reaksjonene screenet mot 50 ng PBL DNA fra to friske individer. Reaksjoner med C (t) verdier lavere enn 40 ble ekskludert. De resterende reaksjoner ble testet på 25 CRC DNA-prøver, ved hjelp av en ALU-basert MethyLight reaksjon og en M.
Sss
en DNA standardkurve for å beregne hvor stor andel av denaturert Referanse (PMR) som beskrevet tidligere [27], [29]. Reaksjoner med PMR 10 i mer enn én CRC svulster ble eliminert. Til slutt ble reaksjonene testet i 10 plasmaprøver fra friske donorer (ekvivalent med 100 pl plasma) og rangert i henhold til deres C (t) verdier. Reaksjoner med C (t) verdier som er mindre enn 50 i ett eller flere av disse prøvene ble eliminert.
Digital MethyLight Analyse
Poolede kliniske prøver.
Digital MethyLight er en kvantitativ PCR-teknikk hvor bisulfitt-omdannet DNA analyseres ved hjelp av PCR-analyse MethyLight i en fordelings måte i løpet av 96 reaksjonskammere for hver prøve. Denne teknikken er en effektiv fremgangsmåte for oppnåelse av DNA-metylering informasjon for prøver med små mengder DNA, og ble utført som beskrevet tidligere [25], [30]. Vi har utarbeidet fire separate bassenger av plasma og fire bassenger av serum DNA for å teste kandidatens markører (Pool 1 = 16 kontroller (uten IBD), Pool 2 = 16 pasienter med mild IBD, Pool 3 = 16 pasienter med stadium I /II CRC og Pool 4 = 16 pasienter med etapper III /IV CRC). Hver av disse bassenger inneholdt DNA fra 190 mL av plasma eller serum fra hver av de 16 individer i bassenget. For hver reaksjon vi først testet DNA fra 50 pl plasma eller serum av hvert basseng. For reaksjonene som ikke resulterte i noen PCR presiseringer (treff) med 50 ul, ble volumet økt til 150 ul tilsvarende. Til slutt ble reaksjoner som ikke resulterte i noen treff i CRC bassengene eller ga treff i kontrollene med eller uten IBD utelukket.
De to kandidat markører som overlevde dette eliminering prosessen ble merket med forskjellige fluorophores. Dette gjorde det mulig reaksjon spesifikke fargede PCR resultater som mulig for oss å skille treff fra hver av disse markørene da de ble kjørt sammen (multiplex). Alle prober og primere ble syntetisert ved Biosearch Technology, Inc., Novota, California, USA.
Individuelle kliniske prøver.
De to-markør multiplex ble testet på plasma- og serumprøver fra 75 uavhengige CRC pasienter og 70 kontroller med et testvolum på 1 ml. Tabell 2 gir en oversikt over de kliniske kjennetegn ved CRC pasienter og kontrollpersoner brukes for klinisk markør testing i denne studien.
Statistical Analysis
Beregningen av konfidensintervall av områder etter kurven (AUC) og statistiske tester ble utført i R (versjon 2.14.0), med R pakken Proc [31]. Metoden som foreslått av DeLong og kolleger [32] ble brukt i testen.
Resultater
Marker Discovery i Genome-Scale DNA Metylering datasett
Vi utførte en trinnvis men da oppdagelse analyse ved hjelp av tilgjengelige DNA-metylering datasett fra et stort antall CRC tumorer, 15 forskjellige andre krefttyper, og kontrollprøver fra plasma, PBL og passet tilgrensende-normal colonic vev (figur 1 og 2, tabell 1) for å identifisere CRC DNA metylering markører. Vi brukte data generert ved hjelp av to forskjellige Illumina infinium HumanMethylation BeadChip plattformer, HM27 og HM450 (se metodedelen). Etter å ha fjernet potensielt problematiske sonder, probe sekvenser som overlappet SNPs eller gjentatte elementer, og prober som ikke klarte å utføre i alle prøvene, det var 23,049 HM27 prober og 367,254 HM450 sonder. Av disse probene, 695 forble i HM27-gruppen og 29 640 i HM450 gruppen, etter å eliminere de som hadde høyere DNA metylering nivåer i friske PBL prøvene enn i CRC svulster. I tillegg har vi utelatt alle prober med høyere DNA-metylering i normal tykktarm vev enn i CRC og rangert de resterende prober basert på forskjellen mellom friskt PBL og CRC tumor DNA-metylering. DNA metylering status for de kombinerte 50 beste prober (rangert etter den største forskjellen mellom sunn PBL og CRC DNA metylering) ble sammenlignet mellom CRC og 15 andre typer kreft. Prober med en høyere midlere DNA-metylering nivå i en hvilken som helst annen type av cancer enn i CRC ble ekskludert. Ti CRC-spesifikke kandidat prober (assosiert med ti unike genet arrangører) forble, som viste høyere gjennomsnittlig DNA metylering verdier i CRC enn gjennomsnittet tilsvarende DNA metylering verdien av alle andre kreftformer.
Kandidat Marker MethyLight analysen Utvikling og verifisering
Vi har konstruert og testet totalt 15 real Time PCR-basert MethyLight analyser (markører) for de ti gjenværende sonder. MethyLight-baserte teknikker er meget følsomme fremgangsmåter for deteksjon av denaturert DNA-molekyler [27]. Den primer og probe-sekvenser for disse reaksjonene er beskrevet i tabell S1. Sekvensen av testene utført på disse markørene er illustrert i panel av figur retten 1. Tre MethyLight reaksjoner ikke forsterke
in vitro
metylert (M.
Sss
I-behandlet) kontroll DNA og ble derfor eliminert. Fem markører som var positive i friske PBL prøver og tre markører som hadde en PMR 10 i mer enn en av 25 CRC-tumorer ble testet ved MethyLight ble også fjernet. De fire gjenværende markørene ble testet i plasmaprøver fra friske donorer ti og ingen av dem ble funnet i disse prøver (data ikke vist). Alle fire markører ble neste analysert av Digital MethyLight i sammenslåtte serum og plasmaprøver fra kontroller med eller uten IBD og CRC pasienter. To markører som ikke kunne oppdages i de sammenslåtte CRC prøvene ble eliminert (data ikke vist). De siste to kandidat DNA metylering biomarkører som møtte alle våre strenge kriterier valg var:.
THBD plakater (THBD-M) og
C9orf50 plakater (C9orf50-M)
Foreløpige resultater evaluering av
THBD Hotell og
C9orf50
Vi har evaluert resultatene av
THBD plakater (infinium sonde nummer cg24562819) og
C9orf50 product: ( infinium sonde nummer cg14015706) i diskriminerende CRC vev og tilstøtende normal tykktarms vev i en uavhengig datasett av 335 CRC tumorer (tabell 1).
THBD Hotell og
C9orf50
hadde fram β-verdier 0,4 i 95% og 100% av alle analyserte CRC svulster hhv. Figur 2 viser mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver for
THBD Hotell og
C9orf50
i diskriminering av CRC tumorprøver versus normal colonic vev. AUC for
THBD Hotell og
C9orf50
var 0,97 og 1,0, henholdsvis. Viktigere, begge markører viste lavere DNA-metylering nivåer i alle andre krefttyper, inkludert bryst, lunge, prostata, skjoldbruskkjertel, livmor, nyre, ovarie, mave, bukspyttkjertel og blære kreft, så vel som melanom, akutt myeloid leukemi, glioblastoma multiforme og hode og hals plateepitelkarsinom (figur 3).
Jitter tomter representerer infinium baserte DNA metylering betaverdier for
THBD plakater (venstre panel) og
C9orf50 plakater (høyre panel) i 335 uavhengige CRC svulster, matchet normale kolon vev, en rekke andre krefttyper og PBL fra friske individer. Den spesifikke antall prøver for hver vevstype er beskrevet i Tabell 1.
Testing av ytelsen THBD-M og C9orf50-M i enkelte kliniske prøver
Vi har utviklet en multipleks reaksjon for de to markørene ved hjelp av forskjellige reporterfargestoffer for hver av reaksjonene. Den THBD-M-proben ble merket med en fluorofor Quasar som resulterer i en rød fluorescerende signal og den C9orf50-M-proben ble merket med blå FAM fluoroforen. De primere og prober av de to markørene ble testet for interferens ved å kombinere dem i én løsning på ulike konsentrasjoner ved hjelp av M.
Sss
jeg behandlet kontroll DNA for MethyLight og Digital MethyLight analyser (data ikke vist). Siden multipleks reaksjonen mellom de to markørene er utført, så vel som de individuelle reaksjonene vi benyttet tidligere for ytterligere klinisk testing.
Totalt 106 CRC-pasienter og 98 kontroller uten CRC, verifisert ved kolonoskopi, ble inkludert i denne prospektiv studie. Sammenkoblede serum og plasma var tilgjengelig fra alle kontroller og 103 CRC pasienter, mens bare plasma ble hentet fra tre CRC pasienter. Selv stadium IV CRC var et eksklusjonskriterium i denne studien ble aspecific abnormiteter sett på preoperative bildediagnostikk for tre pasienter (for eksempel små lunge knuter på CT-thorax) som senere, men før operasjonen, viste seg å være fjernmetastaser. Disse pasientene ble senere overskygget å iscenesette IV CRC. Trettito plasma- og serumprøver fra kontroller og CRC pasienter ble tidligere brukt i den samlede analysen som nevnt ovenfor.
Vi testet de multipleksede digitale MethyLight analyser for THBD-M og C9orf50-M markører på individuelle plasmaprøver fra 75 CRC og 66 kontroller og på individuelle serumprøver fra 72 CRC og 66 kontroller. Figur 4 viser det antall molekyler (summen av de to markører) som detekteres i 1 ml plasma (panel A) og serum (panel D) for forskjellige stadier av CRC sammenlignet med kontrollene. ROC kurver illustrerer teste ytelsen for multipleks reaksjon per sykdomsstadiet (panel B) og for begge merkene separat i plasma (panel C) og serum (panel E og F). AUC pr stadium av sykdommen, er beskrevet i figur 4. For alle trinn var det border betydelig forbedret teste ytelsen for serum sammenlignet med plasma som testmediet (p = 0,06 for alle stadier av CRC). THBD-M utviklet seg vesentlig bedre enn C9orf50-M i både plasma og serum (p 0,001). Tilsetningen av C9orf50-M til THBD-M for påvisning av CRC ikke forbedre teste ytelsen. AUC pr trinn, for hver markør separat og multipleks reaksjonen, er oppsummert i Tabell S2.
Digital MethyLight ble utført i 1 ml plasma (A) og serum (D) for å detektere THBD-M og C9orf50- M i CRC og kontrollprøver. Det absolutte antall molekyler som detekteres av multipleks (summen av de to markørene) Reaksjonen blir tatt opp på y-aksen. CRC prøvene er arrangert av scenen. Stjerne (*) indikerer prøver med mer enn 25 molekyler oppdaget (opp til 153 molekyler i plasma og 157 molekyler i serum). ROC-kurver og AUC-verdier (95% konfidensintervall) for de forskjellige CRC trinn i plasma (B) og serum (E) basert på antall detekterte molekyler. ROC analyse og AUC (95% konfidensintervall) for THBD-M, C9orf50-M som individuelle reaksjoner og som en multipleks reaksjon i plasma (C) og serum (F).
Vi har også bestemt CEA-nivåer i preoperative serumprøver fra 107 CRC-pasienter. En forhøyet serum CEA (≥5.0 ng /ml) ble observert hos 35/107 (33%) pasienter. For stadium I CRC serum CEA ble forhøyet i 14%, for trinn II i 33%, for stadium III i 39% og for stadium IV i 67%. Tabell S3 oppsummerer preoperativ CEA serumnivåer av alle pasienter med tilhørende antall oppdaget THBD-M og C9orf50-M molekyler per 1 ml plasma og serum.
Diskusjoner
En av de viktigste manglene i de publiserte CRC biomarkør studier er avhengigheten av en kandidat genet tilnærming for markør oppdagelse. Denne tilnærmingen er ofte basert på en nonsystematic utvalg av kandidatmarkørgener, som er testet hos friske og kreft vev og deretter validert i en pasientpopulasjon [9] – [22]. Selv om noen av disse studiene har resultert i lovende biomarkører for tidlig CRC deteksjon, mangelen på en grundig biomarkører strategi reiser spørsmålet om overlegne markører kan ha blitt oversett. Med de mer avanserte teknologiene for tiden er tilgjengelige, er det mulig å oppnå genom-skala DNA-metylering data som kan være nyttige for biomarkører. Vi utførte et genom-skala flertrinns markør oppdagelse å identifisere CRC biomarkører ved hjelp av HM27 og HM450 BeadChip plattform; sistnevnte vurderer DNA metylering status på over 482 000 CpG loci og dekker 96% av alle UCSC CpG øyer. Vi har nylig gjennomført en lignende markør-rørledning strategi for eggstokkreft og identifisert den nye følsomme tilbakefall biomarkør IFFO1-M [25]. For denne studien vi forbedret vår oppdagelse strategi ved hjelp av DNA metylering data fra 4,201 kreftprøver av ulik opprinnelse å optimalisere CRC spesifisitet. Våre funn viser at dette funnet strategien fungerer hell for CRC, noe som resulterer i to nye biomarkører: THBD-M og C9orf50-M. Med AUC for 0,97 og 1,0 henholdsvis på infinium analysen, disse to markørene har en utmerket evne til å skille mellom CRC tumorer og avstemt normal tykktarm vev.
