Abstract
activin og TGFB dele Smad signal- og tykktarm kreft kan inaktivere enten veien alene eller samtidig. De differensielle effekter av aktivin og TGFp signalering i kreft i tykktarmen har ikke tidligere vært dissekert. En viktig nedstrøms målet for TGFB signale er cdk2 inhibitor p21 (p21
cip1 /waf1). Her vurderer vi activin-spesifikke effekter på p21 regulering og følge funksjoner. Vi finner at TGFB er en mer potent induser av veksthemming, mens activin er en mer potent induser av apoptose. Videre er veksthemming og apoptose ved begge ligander er avhengig av SMAD4. Men activin nedregulerer p21 protein i en SMAD4 uavhengig måte i forbindelse med økt ubiquitinering og proteasomal degradering å forbedre migrasjon, mens TGFfi oppregulerer p21 i en SMAD4 avhengig måte å påvirke vekst arrest. Aktivin-indusert veksthemming og celledød er avhengig av p21, mens aktivin-indusert migrering motvirkes av p21. Videre primære tykktarm kreft vise differensial p21 uttrykk i samsvar med deres
ACVR2 /TGFBR2
reseptor status. I sammendraget, rapporterer vi p21 som et ulikt berørt activin /TGFB mål og formidler av ligand-spesifikke funksjoner i tykktarmskreft, som kan utnyttes for fremtidig risiko stratifisering og terapeutisk intervensjon
Citation. Bauer J, Sporn JC , Cabral J, Gomez J, Jung B (2012) Effekter av activin og TGFB på p21 i Colon Cancer. PLoS ONE 7 (6): e39381. doi: 10,1371 /journal.pone.0039381
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 26 januar 2012; Godkjent: 21 mai 2012; Publisert: 26 juni 2012
Copyright: © 2012 Bauer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av US Public Health service DK074019 til BJ, National Institutes of Health gi R01CA141057 og Arra P30 CA060553 til BJ, de UCSD Digestive Diseases Forskning Development Center DK080506 til BJ, og Robert H. Lurie Omfattende Cancer Center støtte stipend P30 CA060553 til BJ. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
activin er medlem av TGFB super som regulerer celledifferensiering, spredning og apoptose i mange epiteliale og mesenchymalceller [1]. I likhet med TGFfi, benytter aktivin to typer overflatereseptorer med intracellulær SMAD2, 3 og 4 for signaloverføring. Aktivin reseptor 1 (ACVR1B) og aktivin reseptor 2 (ACVR2) er transmembrane proteiner med ekstracellulære ligand-bindende aktivitet og intracellulær serin /treonin-kinase-aktivitet. ACVR2B erstatter ikke de funksjoner og signalering av ACVR2 [2].
Spesielt
ACVR2
ble funnet mutert i de fleste kolorektal kreft med mikro ustabilitet høy frekvens (MSI-H) , hovedsakelig på grunn av en rammeskifte i A
8 traktat av ekson 10 [3], [4]. Restaurering av activin signalering, dens veksthemming, vekst arrest og dens induksjon av migrasjon oppstår når
ACVR2
suppleres [5]. Vi har tidligere vist høy frekvens av
ACVR2
mutasjoner i MSI-H tykktarmskreft prøver i forbindelse med tap av ACVR2 protein uttrykk [6] og viste at ACVR2 tap er forbundet med større colontumorer og dårlig histologisk grad [7 ]. Begge
ACVR2 Hotell og
TGFBR2
mutasjoner forekommer ofte samtidig i MSI-kreft [6], og cellelinjer kan også miste både TGFB og activin signale [8]. Interessant, begge reseptorene mindre vanlig inaktivert i MSS tykktarm kreft, som har en tendens til å ha en dårligere prognose enn MSI-H tykktarm kreft [9], og begge veier kan være målrettet uavhengig. Til dags dato, er lite kjent om den distinkte bidrag activin signale til tykktarmskreftutvikling og metastasering og spesielt hvordan TGFp og activin signaleffekter avvike tross identisk intracellulær SMAD signalering.
p21 (også kjent som p21
cip1 /waf1) er en cyklin-avhengig kinase inhibitor bestemmende cellesyklus-stans via CDK1 og 2 inhibitor og er en hovedregulator av flere tumor suppressor reaksjonsveier via både p53-avhengige og uavhengige mekanismer [10]. Det er en kjent målgen av TGFp i tykktarmskreft [11], og har vært forbundet med aktivin-indusert veksthemming i plasmacytic og brystcancerceller [12], [13], men virkningene av aktivin for p21 i tykktarmskreftceller som samt nedstrøms konsekvenser er ikke vurdert.
i denne studien har vi utforsket mekanismene for TGFB og activin på p21 regulering og de påfølgende funksjonelle effekter av dette i tykktarm kreft. Vi har funnet at til tross for identisk intracellulær SMAD signalisering, TGFp og aktivin regulere p21 via forskjellige mekanismer som er funksjonelt relevante i colon cancer som fører til mer apoptose eller reduksjon i veksthemming avhengig av aktivin /TGFp signale status med p21 som en differensielt regulert mål.
Resultater
i nærvær av SMAD4, er TGFfi en mer potent induser av veksthemming Mens activin er en mer potent induser av apoptose
for å teste og sammenligne effekten av activin og TGFB på cellevekst, brukte vi tykktarmskreft cellelinjer med ulik SMAD4 status som beskrevet andre steder [22], [23] i tillegg til SMAD4 knockdown.
ACVR2 Twitter /
TGFBR2 /SMAD4
vill type mikro stabil tykktarmskreft cellelinje FET og
ACVR2 /TGFBR2
villtype /
SMAD4
-null SW480 tykktarmskreftceller ble behandlet med enten aktivin eller TGFp og cellevekst, ble målt. Som en ekstra kontroll, ble SMAD4 slått ned via siRNA i FET celler som ble behandlet og analysert tilsvarende. Mens både activin og TGFB behandling førte til betydelig vekst undertrykkelse i
SMAD4
villtype FET, effekten var mer uttalt følgende TGFB behandling. I kontrast, verken ligand var veksten undertrykkende i fravær av SMAD4 i
ACVR2 /TGFBR2
villtype /
SMAD4
-null SW480 tykktarmskreftceller eller følgende SMAD4 knockdown i
SMAD4
villtype FET celler (figur 1A).
A) Etter
ACVR2 /TGFBR2 /SMAD4
-wild typen Fet, Fet celler etter forbigående SMAD4 knockdown, og
ACVR2 /TGFBR2
-wild type /
SMAD4
-null SW480 celler ble behandlet med kjøretøy (kontroll), activin eller TGFfi i 24 timer, metabolsk aktivitet via MTT-vekst analysen ble vurdert. Vekstsuppresjon skjedde bare i nærvær av SMAD4 følgende både aktivin og TGFp behandling (*** p 0,001). Videre, TGFp førte til en betydelig økning i veksthemming sammenlignet med aktivin (*** p 0,001). B) For å bestemme frekvensen av apoptose, ble en TUNEL analyse utført i
SMAD4
-wild typen FET,
SMAD4
-KD FET, og
SMAD4
-null SW480 celler behandlet med kontroll bærer (C), aktivin (A), eller TGFp (T). Apoptose ble bestemt av TUNEL-merking av apoptotiske legemer. C) Normalisering [% apoptotiske legemer /kjerner] viste at activin- og TGFB-indusert apoptose skjedde hovedsakelig i
SMAD4
-wild typen FET og ikke i
SMAD4
-KD FET eller
SMAD4
-null SW480 tykktarmskreftceller. I de SMAD4 uttrykkende celler, aktivin indusert apoptose i større grad enn TGFp (* p 0,05). D) intracellulære DNA-fragmenter BrdU-merket, som indikerer apoptose, ble bestemt 24 timer etter activin eller TGFB behandling av
SMAD4
-wild typen FET tykktarmskreftceller, FET celler med p21 KD, FET celler med SMAD4 KD og
SMAD4
-null SW480 tykktarmskreftceller. Økning i DNA-fragmentering ble registrert etter activin og TGFB behandling bare i SMAD4 villtype celler, med activin indusere mer fragmentering i forhold til TGFB. I nærvær av SMAD4, p21KD føre til en basal økning i apoptose, men aktivin behandling førte til ingen induksjon av apoptose. SMAD4 knockdown resulterte i tap av apoptose i FET celler beslektet med effekter observert i
SMAD4
-null SW480 celler (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)
.
så sammenlignet apoptose-induksjon av enten ligand i nærvær og fravær av SMAD4 eller p21. Aktivin indusert apoptose i større grad enn TGFp, og apoptose bare forekom i nærvær av SMAD4 (figur 1 B, C). SMAD4 /p21 avhengighet ble bekreftet ved en alternativ apoptose analyse bestemme BrdU-merking av intracellulær DNA-fragmenter. Apoptose ble økt etter aktivin og TGFp behandling i SMAD4 positiv FET-celler, med aktivin indusere en større grad av apoptose. Det ble ikke observert induksjon av apoptose med enten ligand i
SMAD4
-null SW480 celler eller FET celler etter SMAD4 knockdown parallelt tunel eksperimenter (figur 1B, C). p21 knockdown i
SMAD4
villtype FET celler resulterte i tap av apoptose induksjon (figur 1D).
I konklusjonen, tyder dette på data at selv activin og TGFB dele intracellulær SMAD signalering, hver favoriserer distinkte nedstrøms fysiologiske effekter ved konsekvent doser. I tillegg viser vi at både veksthemming og apoptose indusert av enten ligand er SMAD4 avhengige.
activin Regulerer Nuclear p21 i en SMAD4 uavhengig
En av de kjente vekst undertrykkende målgener av TGFfi er p21, som er oppregulert etter TGFp behandling i FET tykktarmskreftceller [11]. Effekten av activin på p21 i tykktarmskreft er ikke vurdert. For å analysere nedstrøms effekter av SMAD4 avhengige activin signalering, bestemt vi p21 uttrykk følgende activin behandling i forhold til TGFB behandling. I motsetning til de tidligere kjente TGFp effekt på p21, fant vi ingen økning i p21 transaktivering og bare en beskjeden økning i transkripsjon følgende aktivin behandling i nærvær av SMAD4, mens TGFp markert induserte både p21-spesifikke transaktivering og transkripsjon når SMAD4 var til stede (figur 2A). Med hensyn til p21 protein ekspresjon, har vi funnet at i motsetning til TGFfi, redusert aktivin behandling atom og total p21 uavhengig av tilstedeværelsen av SMAD4, mens cytosoliske p21 holdt seg forholdsvis konstant (figur 2B). For ytterligere å analysere regulering av p21 protein med aktivin, utførte vi et tidsforløp som viser at etter å ha svak initial oppregulering, er p21-protein nedregulert ved 24 timer etter behandling aktivin (figur 2C, to tilstøtende rette baner).
A )
SMAD4
-wild typen FET og
SMAD4
-null SW480 tykktarm kreft celler ble behandlet med kjøretøy (kontroll), activin, eller TGFfi i 24 timer. p21-spesifikke trans ble bestemt ved bruk av en dual luciferase assay med pWWP-luc og PRL-TK (venstre panel) og mRNA uttrykk nivåer av p21 ble kvantifisert ved qPCR og normalisert til L19 (høyre panel). Mens TGFp markert induserte både p21-spesifikke transaktivering og transkripsjon i nærvær av SMAD4, ble ingen økning i p21 transaktivering og bare en beskjeden økning i transkripsjon følgende aktivin behandling i nærvær av SMAD4 funnet (* p 0,05). B)
SMAD4
-wild typen FET og
SMAD4
-null SW480 celler ble behandlet med kontroll kjøretøy (C), activin (A), TGFfi (T), eller en kombinasjon av begge ligander (A + T) i 24 timer før lysering av totalt protein, kjernefysiske, og cytoplasmisk forberedelse. Histone H3, α-tubulin, og GAPDH ble brukt som laste kontroller for de respektive fraksjoner. Mens TGFB markert økt p21 nivåer i alle tre fraksjoner i SMAD4 positive cellelinje bare, activin induserte en nedgang i kjernefysisk og total p21 protein i SMAD4-positive og -negative celler (venstre panel). Densitometrisk analyse av alle blotter viste statistisk signifikante endringer i p21 nivåer (panel høyre) (ns = ikke-signifikant, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). C) Initial oppregulering av p21-proteinet er etterfulgt av nedregulering av 24 timer etter behandling aktivin.
SMAD4
-wild typen FET-celler ble behandlet med aktivin eller bærer (kontroll) og innhøstet ved forskjellige tidspunkter for kvantifisering av protein p21 ekspresjon. GAPDH ble brukt som lasting kontroll og relative uttrykk ble beregnet via densitometry. D) mens TGFp-indusert oppregulering av p21 var SMAD4 avhengig, aktivin-indusert nedregulering av p21 ble fremdeles observert i fravær av SMAD4.
SMAD4
-wild typen FET-celler ble behandlet med vehikkel (CNT), aktivin eller TGFp, i nærvær av enten krafse siRNA (SC) eller SMAD4 siRNA (KD) og total p21-nivåer ble bestemt. GAPDH ble brukt som laste- og C32 cellelysat som p21 positiv kontroll.
For å bekrefte at ligand effekter på p21 var direkte avhengig SMAD4, vi slått ned SMAD4 i
SMAD4
vill skriver FET tykktarm kreft celler ved hjelp av siRNA. Vi fant at referanse p21-ekspresjon i FET-celler ble redusert med SMAD4 knockdown (figur 2D, spor 3), noe som underbygger viktigheten av SMAD4 veien for opprettholdelse av høye p21 nivåene i denne cellelinjen [11]. Konsekvent ble TGFfi-indusert oppregulering av p21 avskaffet med tap av SMAD4 (figur 2D, spor 7). Som forventet, ble det nedregulering av p21 med aktivin, påvirkes ikke av fravær av SMAD4 (figur 2D, kolonne 5) som er i overensstemmelse med våre Western blot-analyse av p21 nivåene i FET og SW480-celler (figur 2B) som viser nedregulering av p21 i SMAD4 positive og negative cellelinje. Således synes SMAD4 signalering for å være nødvendig for prosesser som er avhengig av høy p21-ekspresjon, men unnværlig for prosesser forbundet med lavt eller redusert p21 nivåer.
aktivin-indusert veksthemming er avhengig av p21 Expression, og SMAD4 /p21 Signa kan motvirke activin-indusert SMAD4 uavhengig Migration
Deretter vi søkt å bestemme den funksjonelle rollen til p21 i activin-indusert veksthemming og celle levedyktighet. Vi fant at tap av p21 via siRNA knockdown medført bortfall av activin-indusert veksthemming i
SMAD4-
villtype celler, noe som indikerer at activin /SMAD4-indusert veksthemming er p21-avhengig (figur 3A). Videre er tapet av p21 ikke bare ført til opphevelse av aktivin-indusert celledød, men også til en økning i celletall indikerer en overlevelsesfordel med tap av p21 (figur 3B). Disse observasjonene understreker viktigheten av SMAD4 /p21 akse i activin-mediert veksthemming og celledød.
a) FET celler ble behandlet med enten rykke (SC) eller p21 bestemt siRNA (KD). Veksthemming ble bedømt ved MTT-assay metabolsk følgende aktivin behandling. Aktivin indusert hemming av cellevekst i nærvær av p21, men effekten ble reversert i fravær av p21 (* p 0,05). B) Total levedyktigheten blir redusert i SMAD4 villtype coloncancere følgende aktivin behandling i nærvær av p21. FET celler ble behandlet med enten rykke eller p21 bestemt siRNA. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå farving følgende aktivin behandling. Trypanblått positive celler etter activin behandling ble redusert i nærvær av p21, men økte etter p21 knockdown (*** p 0,001). C) aktivin (A) induserer cellemigrering in SMAD4-positive og SMAD4-negative cellelinjer. Cellular migrasjon blir indusert i
Smad
4-villtype FET celler og
SMAD4
-null SW480 celler etter activin behandling, men mer uttalt induksjon av migrasjon er sett i fravær av SMAD4. Tap av p21 fører til en økning i referanse migrasjon i SMAD4 uttrykkende celler (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). D) p21 knockdown øker den samlede pro-trekkende virkning av aktivin i FET-celler. Tap av p21 i fravær av SMAD4 tillater ytterligere å øke trekk- induksjon (* p 0,05, ** p 0,01)
Følgelig, testet vi rollen til p21 i aktivin-indusert migrering av. vurdere cellular mobilitet i nærvær og fravær av SMAD4. Vi fant ut at activin forbedret migrasjon i SMAD4 positive og SMAD4 negative celler (figur 3C), som argumenterer for en SMAD4 uavhengig sti regulere migrasjon. Denne informasjonen er støttet av lignende funn i TGFB signalering som en sterk pro-trekkfugl og SMAD4 uavhengig effekt ble vist [20], [22]. Som aktivin behandling ble assosiert med en reduksjon i p21 nivåer i tillegg til en økning i migreringen, forventet vi at tap av p21 ved knockdown ville forbedre basislinje migrasjon samt migrering etter aktivin behandling i SMAD4 intakte celler, hvis gjenværende p21 var i det minste delvis involvert i å motvirke activin-indusert migrasjon. I samsvar med denne hypotesen, viser vi en økt basal migrasjonsrate i SMAD4 uttrykke celler følgende p21 knockdown (Figur 3C) samt samlet mer uttalt migrasjon ved activin behandling (Figur 3D).
Vi videre funnet at basal cell migrering ble forsterket av aktivin behandling i fravær av enten p21 eller SMAD4 i SMAD4-positive FET-celler, men det knockdown av p21 hadde ingen ytterligere virkning på migrering når SMAD4 var fraværende, som i SW480 celler (Figur 3D). For TGFfi, fant vi at cellemigrasjon ble forsterket uavhengig av tilstedeværelsen av p21 (figur 2B, Figur S1D). Dette underbygger igjen at p21-medierte effekter etter aktivin behandling er avhengig av SMAD4 og at p21 virker på nedstrømssiden av SMAD4 for sin anti-proliferative og anti-trekkende virkning (figur 4). Videre tyder dette på at, i tilfelle av TGFp, kan noen promigratory passerer signalene SMAD4 som tidligere postulert [22] omgå p21 og dets hemmende effekter. I sammendraget, utlede vi at p21 kan motvirke migrasjon nedstrøms SMAD4 og at nedregulering av p21 kan være ansvarlig for noen av de pro-vandrende potensialet activin signalering. Dermed kan differensial regulering av p21 være i sentrum av distinkte funksjonelle effekter av activin og TGFB.
activin behandling fører til ubiquitinering av p21 og Hemming av Proteasome opphever activin-indusert p21 Nedregulering
for ytterligere å dissekere mekanisme activin-mediert p21 protein nedgang, vurdert vi p21 ubiquitinering følgende activin behandling og sin avhengighet av proteasome (figur 5A, B). For dette, sammenlignet vi p21 ubiquitinering følgende activin og TGFB behandling. I motsetning til TGFfi, aktivin behandling indusert p21 polyubiquitination (figur 5A). Behandling med MG-132 proteasomal inhibitor avskaffet activin-indusert p21 protein nedgang, (figur 5B), påkalle ubiquitin-mediert proteasomal nedbrytning i activin-indusert p21 downregulation. Dette er beslektet med UV-indusert p21 protein degradering [24], men skiller seg fra basal p21 proteasomal degradering [25], som ikke benytter ubiquitinering.
A)
ACVR2 /TGFBR2 /SMAD4
-wild typen FET-celler ble forbehandlet i 30 minutter med inhibitor proteasomal MG-132 og ble deretter behandlet med bærer (kontroll), aktivin, TGFp i 24 timer og ubiquitinering av total p21 ble vurdert gjennom immunpresipitering av p21 og blotting med et ubiquitin-spesifikk antistoff (øvre panel) og reblotting av p21. Flere band som tyder på polyubiquitination ble bare sett følgende activin behandling. B) aktivin-indusert p21 nedregulering er avhengig av proteasomet.
SMAD4
-wild typen FET-celler ble forbehandlet i 30 minutter med inhibitor proteasomal MG-132 etterfulgt av behandling med bærer (kontroll) eller aktivin i 24 timer og sammenlignet med celler behandlet følgelig uten proteasomal hemming. p21 uttrykk ble undersøkt og viste hemming av p21 downregulation følgende activin behandling i forbindelse med proteasomal hemming.
Nuclear p21 er tapt i en undergruppe av primær tykktarm kreft med Intakt
ACVR2
Vi deretter vurdert om svekket activin /TGFB signale påvirket p21 lokalisering i primær tykktarm kreft. Vi er fast bestemt nærvær versus tap av kjernefysisk p21 uttrykk i 56 primærtykktarmskreft eksemplarer av ulike genomiske undergrupper, og korrelert disse dataene med activin og TGFB reseptor status (tabell 1). Vi har funnet at en stor delmengde av tykktarmskreft viste tap av nukleær p21, og at dette tapet var assosiert med bevaring av ACVR2 (tabell 1 og figur 6), noe som tyder på redusert signalisering gjennom de SMAD4 /p21 akse, men intakte aktivin SMAD4-uavhengig signale . Det motsatte var tilfelle for TGFBR2: Bevaring av TGFBR2 var assosiert med vedvarende atom p21 (tabell 1). Denne informasjonen er i tråd med vår
in vitro
funn av TGFB /SMAD4 avhengig oppregulering av p21 og activin /ikke-SMAD4 avhengig nedregulering av p21.
Femti-seks tykktarm kreft ble farget for ACVR2, TGFBR2 og p21. Representative eksempler for p21 flekker vises: normal kolon vev med nukleær farging (venstre panel), tykktarmskreft prøven med opprettholdt atom p21 farging (midtre panelet), og tykktarmskreft prøve med tap av kjerne p21 farging (høyre panel)
.
Diskusjoner
i MSI-H tykktarm kreft, er begge TGFp og activin signale opphevet på grunn av rammeskifte mutasjoner i type II reseptor [26]. Tapet av begge disse signalveier kan være fordelaktig og additiv for tumorvekst [20], [27], men differensial virkning på migrering er fortsatt uklar. TGFB og activin utnytte de samme intracellulære Smad proteiner (SMAD2 /3 og SMAD4) til å overføre sine signal. Begge ligand bestemte veier er vanligvis inaktivert i MSI-H tykktarm kreft, som vi tidligere har observert større enn 50% overlapping mellom
ACVR2 Hotell og
TGFBR2
mutasjoner [6]. Interessant, de er mindre vanlig inaktivert i MSS tykktarm kreft, som har en tendens til å ha en dårligere prognose enn MSI-H tykktarm kreft [9], og begge veier kan være målrettet uavhengig. Her viser vi at mens aktivin og TGFp begge kan indusere veksthemming og apoptose i varierende grad, er de også forbedre migrasjon, således deling i tumorundertrykkende samt kreftfremmende egenskaper. Finjustering av disse motstridende effekter samt differensial regulering av TGFB versus activin signalering er trolig en viktig prosess i kreftutvikling påvirke skjebnen til kreftceller. Dette manuskriptet utforsker forskjellige effekter og regulering av activin og TGFB signalering i tykktarm kreft.
Her viser vi at i tykktarm kreft celler, til tross for identisk nedstrøms SMAD signalering, activin og TGFfi har motstridende effekter på cdk2 inhibitor p21 resulterer i forskjellige forskrifter i hvert veien. Mens TGFB har en sterk up-regulerende effekt på p21, fører activin signalering til en svak nedgang i p21 protein nivåer. Interessant nok, begge ligander indusere SMAD4 avhengig p21-mediert celleveksthemming og celledød, men TGFp synes å være en mer potent induser av veksthemming, mens aktivin på den annen side er en mer potent induser av apoptose. Som tidligere beskrevet, både TGFp og aktivin forbedre cellevandring [20], [22]. Spesielt, viser vi nå at activin pro-trekkende effekt er regulert i en SMAD4 uavhengig mote og beskriver for første gang en samtidig økning i p21 ubiquitinering og proteasomal degradering. Derfor, mens activin-indusert veksthemming er avhengig av p21, er activin-indusert migrering ledsaget av redusert p21 nivåer og uavhengig av SMAD4. Mens det er kjent at UV-indusert degradering p21 protein er ubiquitinin-avhengig [24], er basal p21-degradering via proteasomet ikke [25]. Nyere data impliserer ERK2 i formidling atom til cytosolic giring og påfølgende ubiquitinin-mediert degradering av p21 [28]. En rekke av ubiquitin-ligaser å inkludere Ecto og Smurf-1 har blitt funnet å målrette både SMAD avhengig og uavhengig TGFp signalering [29]. Den spesifikke ubiquitin ligase ansvarlig for activin-mediert p21 ubiquitinering er ikke bestemt ennå.
Økning eller reduksjon av p21 nivåer kunne kjøre en celle mot fortrinnsrett aktivering av enten SMAD4 avhengig eller uavhengige signalveien og vice versa, og dermed moduler den generelle cellulær respons. Sikkert, synes p21 å være en viktig spiller for differensial regulering av SMAD4-avhengige og uavhengige veier kontrollert av activin og TGFB (figur 4).
Faktisk ser det ut til at både activin og TGFB SMAD og ikke- SMAD signalering forekommer samtidig og at nettoeffekten er et resultat av den relative kontekstavhengige dominans av en gitt ligand og /eller veien. Differential regulering av p21 kan være en viktig mekanisme for å kontrollere og finjustere fortrinnsrett signale avhengig eller uavhengig av SMAD med potensial prognostisk betydning. Tap av SMAD signale har vært forbundet med økt migrasjon og tap av veksthemming i tykktarmskreft [22], og vi viser nå en mulig mekanisme i tykktarmskreft der SMAD signale kan omgås via fortrinnsrett activin signale, presentere en forklaring på pro -migratory og pro-proliferative effekter tilhørende tapt SMAD signale.
p21 spiller en kompleks rolle i kreft. Tumor suppressive egenskaper av p21 er blitt beskrevet i forbindelse med induksjon av vekstarrest, differensiering og begynnende alderdom og studier i forskjellige krefttyper viste at p21 ekspresjon korrelerer med en gunstig diagnose [10]. I samsvar med den ovennevnte funn, flere studier i tykktarmskreft viste en sammenheng mellom p21 nedregulering og metastasering samt dårlig overlevelse [30], [31], [32] [33], men noen rapporter peker i retning av en dobbel rolle i flere cancere med økning av p21 korrelerer med dårlig resultat [34], [35].
Her, avdekker et betydelig antall primær coloncancere med tap av nukleær p21, som korrelerer med tilstedeværelsen av ACVR2 og fravær av TGFBR2 . Dette er i tråd med vår
in vitro
data der vi viser nedregulering av p21 i sammenheng med økt SMAD4-uavhengig signale indusert av activin. Det er også i samsvar med konseptet med en fraværende oppregulering av p21 etter opphevelse av TGFp /SMAD4 akse, noe som kan forklares ved knockdown av SMAD4, som i våre eksperimenter, men også ved fravær av TGFBR2, som sett i kreftprøvene. De funksjonelle konsekvenser vi forventer av redusert p21 nivåer i forbindelse med bevaring av ACVR2 og tap av TGFBR2 basert på våre data er forbedret migrasjon via SMAD4-uavhengig signalering og tap av veksthemming gjennom TGFB /SMAD4 /p21 aksen. Uavhengig av den virkning på veksthemming, som alene er blitt funnet å være en svak prognostisk markør i mange kreftformer [36], den ACVR2 + /TGFBR2- reseptoren status i forbindelse med tap av atom p21 punkter til en pro-metastatisk og dermed mer aggressiv cancer fenotype. Dette er i overensstemmelse med tidligere funn som viser at tapet av p21 er forbundet med dårligere resultat i forskjellige krefttyper [10]. Mens andre signalveier kan lede p21 lokalisering, våre data etablere grunnlag for videre vurdering av activin og TGFB receptor status i forbindelse med p21 lokalisering for prediksjon av utfallet og effekten av behandlingen i tykktarmskreft.
I sammendraget, vår data viser at TGFp er en mer potent induser av veksthemming mens aktivin er en mer potent induser av apoptose. Videre er veksthemming og apoptose ved begge ligander er avhengig av SMAD4 og p21. Men activin nedregulerer kjernekraft og total p21 protein i en SMAD4 uavhengig måte i forbindelse med økt ubiquitinering og proteasomal degradering assosiert med økt migrasjon. TGFp på den annen side oppregulerer atom p21 i en SMAD4 avhengig måte å påvirke vekststans og kan bypass p21 for å påvirke migreringen. Videre primære tykktarm kreft vise differensial p21 uttrykk i samsvar med deres
ACVR2 /TGFBR2
reseptor status. Sikkert, rapporterer vi p21 som et ulikt berørt activin /TGFB mål og formidler av ligand-spesifikke funksjoner i tykktarmskreft, som kan utnyttes for fremtidig risiko stratifisering og terapeutisk intervensjon.
Materialer og metoder
Etikk Uttalelse
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av Institutional Review Board ved University of North Carolina sykehus. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke for innsamling av prøver som en del av de under IRB godkjennelse gjennomført North Carolina Colorectal Cancer Study (NCCCS) som referert nedenfor. Studien ble godkjent av Northwestern University Institutional Review Board (IRB # STU00020989). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Pasientprøver
Colon svulster ble prospektivt samlet etter IRB godkjennelse som en del av North Carolina Colorectal Cancer Study (NCCCS), en populasjonsbasert, case -Control studie omfattende 503 pasienter [14], [15]. For denne studien ble 15 pasientprøver med rikelig tumor og normalt vev tilfeldig valgt. For verifikasjon, samlet vi ytterligere 41 sammenhengende kolorektal kreft prøver fra Northwestern University i henhold til institusjonelle IRB godkjennelse (IRB # STU00020989) (tabell S1). Alle svulster var formalinfiksert, i parafin og kuttet i 5 mikrometer seksjoner.
Colon Cancer Cell Lines
SW480 celler (ATCC, Manassas, Virginia) ble opprettholdt i Iscove modifiserte Dulbeccos og FET -celler (generøs gave fra Michael Brattain, University of Nebraska, Omaha, NE [16]) i F12 /Dulbeccos modifiserte Eagles medium (begge Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum og penicillin G [100 U /ml] /streptomycin [100 ug /ml] (Invitrogen). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Alle celler ble serum-sultet i 24 timer før eksperimenter til automatisk cellesyklus synkronisering. Celler ble testet for mykoplasmainfeksjon ved hjelp av PCR Mycoplasma Detection Set (Takara, Otsu, Japan) og godkjent av STR profilering bruke PowerPlex 1.2 System (Promega, Madison, WI).
Antistoffer og reagenser
aktivin A ble rekonstituert i PBS, TGFβ1 i 4 mM HCI i henhold til produsentens instruksjoner (både R & D, Minneapolis, MN) og anvendt ved endelige konsentrasjoner på 25 ng /ml og 10 ng /ml som tidligere beskrevet [17], [18], [19], [20]. MG-132 (Calchemie, Darmstadt, Tyskland) ble benyttet for inhibering av proteasomet. For immunhistokjemiske analyser, vi brukte en geitepolyklonalt antistoff mot ACVR2 (01:50) (ab10595, Abcam, Cambridge, MA), samt mus monoklonale antistoffer mot TGFBR2 (01:50) (ab78419, Abcam) og p21 (1: 150) (sc-817, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). For Western blotting, p21 (# sc-469) (1:250) (Santa Cruz, bioteknologi), α-tubulin (# 3873), H3 histon (# 9715) (begge Cell Signaling Technology, Danvers, MA), og GAPDH
