Abstract
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis med mer enn en million dødsfall per år. Den dårlig prognose er på grunn av høy aggressivitet og dens tidlig metastasering. Selv om de nøyaktige mekanismer er fortsatt ukjent, prosessen med epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) ser ut til å være involvert i disse neoplastiske prosesser. Vi har allerede vist at serumnivåer av CCL18, en primat spesifikk kjemokin, er sterkt forhøyet hos pasienter med lungekreft og korrelerer med deres overlevelsestid for pasienter med adenokarsinom av lungen. Derfor hypotese vi at CCL18 kan være direkte involvert i patologiske prosesser av lungekreft, f.eks EMT. Vi undersøkte effekten av CCL18 på A549, en adenocarcinom-cellelinje fra lungen, på EMT og andre cellefunksjoner som proliferasjon, kjemotaksis, invasjon, chemoresistance og proliferasjon. Eksponering av A549 lungekreftceller til CCL18 i forskjellige konsentrasjoner senker epiteliale markør E-cadherin, mens FSP-1, en markør av mesenchymale fenotype øker. Følgelig, CCL18 induserte transkripsjons EMT regulator SNAIL1 på en doseavhengig måte. I motsetning til dette ble en økende konsentrasjon CCL18 forbundet med en nedgang av celleproliferasjon hastighet. I tillegg, CCL18 induserte kjemotaksen av disse cellene og deres økte chemoresistance. Derfor kan CCL18 være en interessant terapeutisk mål for NSCLC
Citation. Ploenes T, Scholtes B, Krohn A, Burger M, Passlick B, Müller-Quernheim J et al. (2013) CC-kjemokin Ligand 18 induserer Epitelial å Mesenchymale Overgang i Lung Cancer A549-celler og løfter Invasive Potential. PLoS ONE 8 (1): e53068. doi: 10,1371 /journal.pone.0053068
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 25 juni 2012; Godkjent: 28 november 2012; Publisert: 18 januar 2013
Copyright: © 2013 Ploenes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Det er ingen aktuelle eksterne finansieringskilder for denne studien. T.P. er en mottaker av et stipend ved Albert-Ludwig Universitetet Freiburg (Stiftung Mattern). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. J.M.Q. og G.Z. har søkt om patent på CCL18 og CCL18R som biomarkør og terapi mål (patent pending). G.Z. er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
metastase er en kompleks hendelse som involverer flere trinn, blant annet utskillelse av kreftceller fra den kompakte primærtumor, migrasjon i kar, invasjon i vev og dannelse av en sekundær svulst nodule. Selv om det fortsatt under debatt, epitelial til mesenchymale overgang (EMT) ser ut til å være en av de viktigste hendelsene i lokal utvikling og metastasering av epiteliale maligniteter [1], [2]. EMT er en kompleks multistep hendelse, noe som endrer ikke bare cellemorfologi men også gjør cellene til å få viktige nye funksjoner som uttrykk for nye molekyler eller migrasjon og invasjon. I tillegg til morfologiske endringer, er prosessen med EMT, karakterisert ved forskjeller i transkripsjon og ekspresjon av epiteliale og mesenkymale gener. En av de viktigste molekylære markører for epitelceller er det epiteliale adhesjonsmolekylet E-cadherin, som formidler celle-celle-interaksjoner [3]. Prosessen med EMT er forbundet med et tap av E-cadherin, noe som er positivt korrelert med tumorstadium og dårlig overlevelse i mange epitelial tumor [4] – [6]. Ved siden av tapet av epiteliale markører uttrykket av mesenchymale markører som FSP-en er også et viktig skritt i prosessen med EMT [7]. FSP-1, også kalt S100A4, korrelerer med det metastatiske potensiale i neoplasmer og noen forfattere vist at et høyt nivå av FSP-en er assosiert med dårlig prognose i forskjellige krefttyper [8] – [10]. EMT er regulert av flere transkripsjonsfaktorer [11]. En av de viktigste er SNAIL1, som også fungerer som E-cadherin repressor. Det er blitt vist at høy SNAIL1 ekspresjon er assosiert med dårlig prognose i lungekreft [12]. EMT kan induseres av flere vekstfaktorer og cytokiner, viktigst av TGFbeta men også av EGF, FGF, HGF og andre [13]. De fleste av disse faktorer er til stede i tumoren miljø og produsert av tumorcellene selv, eller ved å omgi cellulære komponenter. Mikromiljøet av faste tumorer er en kompleks blanding av cellulære og ikke-cellulære faktorer, hvor tumorassosierte makrofager (TAM) representerer opp til 50% av tumormassen [14]. TAMs alternativt aktiveres makrofager utskiller et bestemt mønster av flere tumor fremme cytokiner og vekstfaktorer. En av disse cytokiner er den humane spesifikk CC-kjemokin Ligand 18 (CCL18) som er meget til stede i lungevev og er involvert i flere patologiske prosesser av maligne sykdommer eller fibrose [15] – [20]. Vi har allerede vist at CCL18 er sterkt forhøyet i serum hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft og korrelerer med tumorstadium og total overlevelse i undergruppen av adenokarsinom [21], [22]. Mean CCL18 serumnivå av pasienter med ikke-småcellet lungekreft var 150 (857) ng /ml vs. 32 (61) ng /ml i den friske kontrollgruppen [22]. Vi har derfor antatt at CCL18 induserer EMT i humane adenokarsinom celler i lungene og forbedrer metastatisk potensial.
Materialer og metoder
Reagenser
Rekombinant human TGFbeta1 ble kjøpt fra R https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/). Tiltredelse Koder for disse nukleotidsekvenser brukes til å generere de respektive primere og primer sekvenser er listet opp i tabell 1.
Alle primere ble intron-spenner og syntetisert av Biomers (Biomers.net, Ulm, FRG ). Real time PCR ble utført ved hjelp av iQ SYBR Grønn SuperMix, iCycler termo, og iCycler iQ 3.0-programvaren (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, FRG) i henhold til produsentens protokoll. Smelting kurve analyse ble brukt for å kontrollere for spesifisitet av amplifiseringsproduktene. Ingen amplifisering av uspesifikke produkter ble observert i noen av reaksjonene. En terskelverdi syklus (Ct) ble beregnet og anvendt for å beregne det relative nivået av spesifikk mRNA i våre prøver ved følgende formel:
Western Blot
Cellene ble vasket tre ganger med iskald PBS og skrapt fra bunnen. Cellene ble lysert med lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,1% ernæring-X) inneholdende en protease inhibitor cocktail. Total proteinkonsentrasjon ble målt ved anvendelse av BCA proteinanalysesett (Thermo Scientific, Waltham, MA) med bovint serumalbumin som standard. Helcellelysater ble kokt ved 93 ° C i 5 minutter i like volumer av lastebuffer (0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 0, 05% bromfenol-blå, 20% 2-merkaptoetanol, 10% glyserol ).
Alle prøver ble underkastet 12% natriumdodecylsulfat-PAGE, separert ved elektroforese og overført til en membran polyvinylidendifluorid (PVDF). Etter blokkering i 2 timer i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 5% ikke-fett tørrmelk, ble membranene inkubert med primært antistoff fortynnet 1:200 (FSP-1), 1:500 (E-cadherine) eller 1: 3000 (SNAIL1) med TBS inneholdende 5% ikke-fett tørrmelk ved 4 ° C over natten. Visualisering ble utført ved hjelp av egnede sekundære antistoffer merket med IRDye 800CW eller IRDye 700CW (Li-COR Bioscience, Bad Homburg, FRG) fortynnet 1:10 000-1:20000 i 2 timer og skannet med Odyssey system (Li-COR Bioscience, Bad Homburg , FRG) i henhold til produsentens anvisninger.
chemotaxis Assay
chemotaxis analyser ble utført ved anvendelse av en 10-brønns chemotaxis kammer (NeuroProbe, Gaithersburg, USA). De nederste Brønnene ble fylt med 400 ul DMEM inneholdende CCL18 i konsentrasjoner på 100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml og 100 ng /ml (kontroll: TGFbeta 2 ng /ml). En 12 um-pore-diameter polyvinylpyrrolidon-fri polykarbonatfilter (NeuroProbe, Gaithersburg, USA) ble plassert på bunnplaten. En silisium pakning og topp-platen med 12 hull ble deretter montert, danner toppen brønnene. 2 x 10
4 celler ble tilsatt i et volum på 285 ul. I parallelle eksperimenter ble DMEM uten kjemokin lastet inn i de nederste brønner som en negativ kontroll. En andre negativ kontroll med kjemokin av den samme konsentrasjon i det øvre og det nedre brønn ble også utført. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C og 5% CO2, ble filterarket fjernet, og ikke-migrerte celler ble tørkes av fra oversiden av filteret. Filteret ble deretter farget ved hjelp av krystall-fiolett (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) og fiksert i klarlakk. Etter dette 9 høyeffekts felt per filter ble telt ved 200 ganger forstørrelse ved hjelp av en Zeiss mikroskop.
Invasion analysen
Evnen til cellene til å migrere gjennom en Matrigel basalmembran matrix ble målt ved hjelp av Cell Invasion Assay Kit (Chemicon International, Temecula CA) med 8 mikrometer porestørrelse polykarbonat membran. Etter rehydratisering av gelene i 2 timer, 1 x 10
5-celler i serumfritt DMEM ble påført til det øvre kammer, mens det nedre kammer inneholdt serum-fritt DMEM og serum-fritt DMEM supplert med CCL18 i forskjellige konsentrasjoner eller TGFbeta som en kontroll. Etter inkubering ved 37 ° C i 24 timer, ble alle cellene i det øvre kammer side fjernes med en bomullsdott, og membranen ble fjernet og invasive cellene ble farget ved hjelp av krystallfiolett. Analysene ble utført ved å telle 9 høy effekt felt per filter ved 200 gangers forstørrelse ved hjelp av et Olympus mikroskop (Olympus, Tokio, JPN).
Chemoresistance analysen
For å måle påvirkning av CCL18 på chemoresistance av tumorcellene, ble A549-celler dyrket i en 6-brønns plate og dyrket til 80% konfluens. Celler ble dyrket i 24 og 72 timer med eller uten CCL18 ved konsentrasjoner som indikert. Deretter ble en fortynningsserie av Cisplatin i området fra 0,4 til 25 ug /ml tilsatt i ytterligere 72 timer. Ved slutten av forsøksperioden ble levende celler målt ved anvendelse av MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazoliumbromid] assay. Mediet ble skiftet og MTT-løsning (5 mg /ml i fosfatbufret saltoppløsning /brønn) ble tilsatt i 4 timer, og den genererte formazan ble oppløst i isopropanol og måles spektrofotometrisk ved 563 nm. Den optisk tetthet hentet for ikke-behandlede celler ble satt 100% og anvendt for å beregne prosentandelene av levedyktige celler i behandlede kulturer.
BrdU -Proliferation assay
DNA-syntesen ble målt ved anvendelse av en bromdeoksyuridin (BrdU) Cell Proliferation Kit (Calbiochem, Darmstadt, FRG). BrdU-merking oppløsning ble tilsatt til cellene i kombinasjon med de forskjellige behandlingene og inkubert i 24 timer. Etter fjerning av kulturmedium, ble cellene fiksert, permeabilisert og DNA ble denaturert via mikrobølgeovn. Anti-BrdU-antistoff ble tilsatt i en time før tilsetning av muse-IgG-peroksidasekonjugat i 20 minutter. Signalet ble utviklet med tetrametylbenzidin oppløsning i mørke. Absorbans ble målt ved anvendelse av en spektrofotometrisk plateavleser ved 450 nm med en referansebølgelengde på 595 nm.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Statview (SAS Institute, Cary, NC). Verdiene er vist som gjennomsnitt ± SD av i det minste et minimum av tre uavhengige eksperimenter utført. Dose-avhengigheter ble beregnet ved Friedman Test fulgt av parvise sammenligninger ved hjelp av Wilcoxon test.
Resultater
Endring av Cell morfologi
I utgangspunktet A549 avslørt en typisk cuboid epitelial morfologi med trange celle-celle kontakter (fig. 1a). Behandling av cellene med CCL18 i 24 timer indusert markerte forandringer i cellemorfologi (fig. 1C og D). Celler endret morfologi fra cuboid eller trekant-form til spindel-form; utviklede langvarig celleprofiler og celle-celle kontakt var mindre intens. Disse endringene kan bli observert over et doseområde fra 1 til 100 ng /ml (Fig. 1C). Som forventet, stimulering med 2 ng /ml TGFbeta i 24 timer induserte også en spindel-form, fibroblast-lignende fenotype (Fig. 1B). Dermed CCL18 og TGFbeta indusere morfologiske forandringer kompatible med EMT
Morfologiske endringer i celler behandlet med CCL18 og TGFbeta. Ubehandlede A549 cellene vise typisk epitelial morfologi med nære celle-celle-kontakter, som er merket med hvite piler ( EN). Etter behandling med 2 ng /ml -B celler endret fenotype til en mer mesenchymale morfologi med lengre celleprofiler og løsnet celle-celle-kontakter merket med pilspisser. (B) CCL18, endres også cellemorfologi på en doseavhengig måte (C [1 ng /ml] og D [10 ng /ml]) å fibroblast-lignende mesenchymale fenotype og løsnet celle-celle-kontakter som er merket med pilspisser.
uttrykk for EMT-relaterte gener
Ved hjelp av RT-PCR, kunne vi ikke påvise noen entydig effekt av CCL18 på E-cadherin uttrykk i noen av de konsentrasjoner som brukes etter en stimulering tid på 72 timer (fig. 2A). I motsetning til stimulering av A549 med CCL18 i 72 timer øker SNAIL1 (Fig. 2B) og FSP-1-ekspresjon (Fig. 2C). Økningen i FSP-1-ekspresjonen var statistisk signifikant (p 0,03). Interessant nok effekten var maksimal ved 1 ng /ml CCL18 og sank svakt med økende konsentrasjoner (Fig. 2C.). Sammenlignet med kontroll CCL18 stimulering nesten doblet bety SNAIL1 uttrykk. Men denne økningen ikke komme betydning og ingen klar dose-forholdet kunne påvises (Fig. 2B). Interessant, selv om TGFbeta induserte en økning i SNAIL1 og FSP1 uttrykk, effektene var lavere enn observert med de tilsvarende CCL18 konsentrasjon (1 ng /ml). Igjen kunne ingen virkning på E-cadherin ekspresjon funnet.
mRNA-nivåer av (A) E-cadherin, (B) SNAIL1, (C) FSP-1 etter stimulering med -β eller forskjellige konsentrasjoner for CCL18 72 h i forhold til den ikke-stimulert kontroll. Hver søyle representerer middel ± SD av fire uavhengige forsøk. GAPDH ble brukt som husholdningsgenet for å normalisere for forskjeller i mengden av total RNA.
Endringer i uttrykket av EMT-relaterte PROTEINES
For å bekrefte våre PCR funn, vi analysert protein uttrykk ved Western blot. Parallelt med PCR-resultater, E-cadherin ekspresjon beskrevet en svak, men ikke signifikant reduksjon når cellene ble stimulert med CCL18 i 72 timer (fig. 3A). I kontrast, fant vi betydelig økt SNAIL1 (p 0,005 Fig. 3B) og FSP-1 uttrykk (p 0,05; Fig. 3C) av førti og femti prosent. TGFbeta (2 ng /ml) indusert enten ingen (snail1) eller bare marginal og ubetydelige endringer (E-cadherin, FSP1, fig. 3).
Alle resultater ble normalisert til den ubehandlede kontroll. Barer oppsummere resultatene av tre uavhengige western blot analyser, i panelet til høyre en representant blot er avbildet.
CCL18 relatert Chemotaxis og Invasion
Boyden kammer eksperimenter viste at CCL18 induserer kjemotaksis av A549-celler på en doseavhengig måte. Vi har observert en doseavhengig og signifikant (p 0,0001) økning av kjemotakse indusert av CCL18, som nådde sitt maksimum (50% i forhold til kontroll) ved en dose på 100 ng /ml CCL18 (Fig. 4). TGFbeta (2 ng /ml) forbedrer kjemotakse med 40%, hvilket var også statistisk signifikant (p 0,0001). Forsterkningen av evnen for invasjonen i et vev eller matrise er en ytterligere og viktig egenskap ved EMT krever proteolytisk aktivitet i tillegg til kjemotakse. Derfor, analyserte vi effekten av CCL18 på evnen av invasjon. Vi fant at CCL18 (1 ng /ml) øker invasjon mer enn doblet sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,0001, Fig. 5). . TGFbeta (2 ng /ml) øker invasiv i det samme området, men mindre uttalt (p 0,0001)
betydninger ble beregnet ved hjelp av parret sammenligning (Wilcoxon Signed Rank Test), kontroll: ubehandlede celler (n = 4) .
betydninger ble beregnet ved hjelp av parret sammenligning (Wilcoxon Signed Rank Test), kontroll: ubehandlede celler (n = 3)
Proliferation
Til. bestemme virkningen av CCL18 på celleproliferasjon, ble A549-cellene ble behandlet i 24 timer med enten 2 ng /ml TGFbeta eller 0,1 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml eller 100 ng /ml av CCL18, hhv og deretter en BrdU-analyse ble utført. Inkubering med CCL18 nedsatt formeringshastigheten på en doseavhengig måte når en signifikant reduksjon på 50% sammenlignet med kontroller på 1000 ng /ml (p 0,001, fig. 6). TGFbeta (2 ng /ml) redusert formeringshastigheten med 55% sammenlignet med kontroller (p 0,001).
Chemoresistance
Vi videre undersøkt om CCL18 modulerer følsomheten av A549 celler til Cisplatin behandling. Derfor inkubert vi cellene med CCL18 og deretter behandlet av cellene med seriefortynninger av Cisplatin. Etter CCL18 stimulering i 72 timer, kan ingen toksiske effekter av CCL18 eller TGFbeta oppdages (data ikke vist). LD
50 ubehandlede A549 celler ble 6 ug /ml cisplatin. Etter CCL18 stimulering (0,1 ng /ml) av cellene i 72 timer, LD
50 øket til 9 ug /ml cisplatin. Likeledes er LD50 av stimulerte celler steg til 10 ug /ml når cellene ble forbehandlet med 1 ng /ml CCL18 (fig. 7). Høyere konsentrasjoner av CCL18 ble prøvet, men ingen ytterligere effekt ble observert (data ikke vist).
Cellene ble dyrket i nærvær eller fravær av -TGFbeta eller CCL18 i de konsentrasjoner som er angitt i 72 timer. Etter dyrkningsperioden ble mediet forandret, og cellene ble inkubert med cisplatin i ytterligere 72 timer ved konsentrasjoner i området 0,4 til 25 ug /ml. Celleoverlevelse ble målt ved MTT-analyse. Den horisontale linjen viser LD
50, vertikale linjer indikerer LD
50 for de respektive pre-inkubasjon tilstand (n = 4).
Diskusjoner
Lung kreft er en av maligniteter med høyest forekomst i den vestlige verden, og til tross for alle fremskritt i diagnostikk og terapi en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall [23]. Nesten 85% av disse pasientene lider av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som er oppdelt i skvamøs karsinom, adenokarsinom, store cellekreft og andre sjeldne subtyper [24]. Adenocarinoma representerer de høyeste andelene av NSCLC og siden 1970-tallet sin andel øker [25]. På tidspunktet for diagnose de fleste pasienter med NSCLC lider allerede fra fremskreden eller metastatisk sykdom som er assosiert med dårlig prognose [26]. Mekanismen for metastasering i lungekreft er ikke fullt ut forstått, men epitelial til mesenchymal overgang (EMT) synes å være en nøkkelhendelse i prosessen med metastasering. Noen forfattere allerede vist at ulike meglere utgitt i mikromiljøet av solide svulster er i stand til å indusere EMT og derfor fremme sykdomsutvikling [14]. CCL18 er en chemokin produsert og utgitt av tumor-assosiert makrofager (TAM) i mikromiljøet av kreftceller og lungefibrose [16], [17]. Vi kunne vise at CCL18 er sterkt forhøyet hos pasienter med NSCLC og korrelerer med T-fasen og midlere overlevelsestid i adenokarsinom undergruppe [21]. Dette fører til spørsmålet om CCL18 er direkte involvert i sykdomsfremkallende prosesser i kreftsykdommer. Siden CCL18 ble funnet å indusere kollagen i lungefibroblaster og å virke på en lignende måte som TGFbeta [17], [27], [28], hypotese vi at CCL18 kan fremme prosessen med metastasering via EMT. A549 celler er et godt karakterisert, human cellelinje isolert fra et adenokarsinom av lungen, som allerede har vært brukt i flere studier undersøke induksjonen av EMT av TGF-β [29], [30]. I overensstemmelse med andre, viser vi at A549-celler behandlet med til og med lav dose av TGF-β gikk morfologiske forandringer fra cuboid epitelceller til spindel formede fibroblast-lignende celler og tilegnet en mesenchymale fenotype etter 24 timers behandling. På samme måte, vi var også i stand til å vise at CCL18 induserer de samme morfologiske endringer som TGF-β. Dette støttes videre ved å analysere uttrykk mønster av epiteliale og mesenkymale gener på mRNA og protein nivå. Den oppregulering av mesenchymale gener som FSP-1 eller SNAIL1 er et kjennetegn i ferd med EMT. De observerte endringene i den karakteristiske uttrykket mønsteret var ganske lik i TGF-β og i CCL18 stimulering. I denne sammenheng er det bemerkelsesverdig at Miyazaki et al. publisert i 2006, at pasienter med lunge adenokarsinom demonstrere en lav E-cadherin uttrykk i kombinasjon med en høy FSP-1 uttrykk har for å møte en betydelig dårligere prognose på grunn hematogenous metastaser [9]. Vi observerte også at SNAIL1, en transkripsjonsfaktor involvert i de tidlige hendelsene i EMT, ble oppregulert ved CCL18 behandling på samme måte som ved TGFbeta. I prosessen med metastase, kreftceller skaffe nye evner som invasjon, migrering og forbedret nedregulering av proliferasjon. Vi har derfor studert også påvirkning av CCL18 på disse cellefunksjoner og observert en forbedret trekkfugl og invasiv potensial etter 24 timer med CCL18 behandling. Videre er formeringshastigheten av A549 ble redusert etter 24 timer med CCL18 behandling, som kan være på grunn av igangsetting av differensieringsprosesser. Til sammen er disse brede forandringer i cellefunksjoner som er nevnt ovenfor, viser en sterk innflytelse av CCL18 i prosessen med metastasering. Dermed er basert på våre data som presenteres her, på våre tidligere publiserte data som økte serum CCL18 korrelerer med redusert overlevelse i adenokarsinom i lungene [22] og på observasjon av Chen et al. viser at CCL18 fremmer metastaser ved brystkreft [5] vi en hypotese om at CCL18 kan være en av de viktigste faktorene som driver EMT i svulsten miljø.
Husk at de fleste pasientene krever kjemoterapi enten som adjuvant eller neoadjuvant en del av en multimodal tilnærming eller som en enkelt behandling, er chemoresistance fortsatt en av de viktigste barrierene i tilstrekkelig behandling av NSCLC og grunnen av tumor fremgang, tilbakefall og tumor død. Kjemoterapi av NSCLC er fremdeles avhengig av platina avledet stoffer, selv om det er kjent at en rekke mekanismer hvor lungekreftceller unnslippe cisplatin cytotoksisitet og CCL18 kan være en sentral mediator i slike prosesser. Disse mekanismene synes å være knyttet til EMT fordi transkripsjonsfaktorer som regulerer EMT også regulere transportørproteiner er knyttet til en økt motstand mot platinaderivater [31], [32]. Derfor, undersøkte vi rolle CCL18 i chemoresistance. Vi observerte faktisk økt chemoresistance indusert av CCL18. Interessant, denne økningen i chemoresistance toppet seg i samme område som markører for EMT (f.eks FSP1). Dette gir bevis for en rolle av CCL18 i induksjon av chemoresistance. Fordi CCL18 er en chemokin, som også kan være involvert i homing av kreftceller, vi også undersøkt chemotacic egenskaper CCL18 på A549 celler. Vi observerte at CCL18 utøver en doseavhengig økning i chemotaxis av lungekreft celler indikerer at CCL18 tiltrekker lungekreftceller til områder av CCL18 utgivelse. Som lungene er det organet med det høyeste nivået av CCL18 produksjon, kan denne effekten påvirke homing av CCL18 responsive tumorceller til lungene.
Interessant, i de fleste av forsøkene vi ikke kunne observere en entydig doseavhengig effekt av CCL18. I motsetning til økende konsentrasjoner av CCL18 ofte resulterer i å redusere effekten av CCL18. Dette er forenlig med ekspresjon av forskjellige agonistiske og antagonistiske reseptorene til CCL18. Nylig, Catusse et al. publisert som CCL18, utløser via GPR30, fungerer agonistisk og reduserer CXCR4-mediert effekter av CXCL12 [15]. Chen et al. viste at PITPNM3, en membran-assosiert fosfatidylinositol overføring domene-inneholdende protein, kan fungere som en CCL18 reseptor [5]. Vi identifiserte det allerede kjent kjemokinreseptoren CCR6 som en CCL18 reseptor med potens til å initiere de beskrevne aktivitetene i fibroblaster [33]. Dette indikerer at CCL18 kan bruke flere reseptorer og balansen av reseptorekspresjon kan regulere den agonistiske og antagonistiske virkninger av CCL18.
Som konklusjon, våre data viser at CCL18 induserer EMT i A549-celler, forbedrer deres metastatiske potensial og støtter kjemoterapi motstand. Således er CCL18 ikke bare en mediator utgitt av tumorassosierte makrofager og potensielt reflekterende tumorstørrelsen, men den påvirker også neoplastiske prosesser av adenokarsinom. Dataene presentert her viser at CCL18 er i stand til å utløse hendelser involvert i tumormetastaser, for eksempel endring fra primære epitelceller tumorceller inn i trekk mesenchymale celler, kjemotakse, og invasjon. I tillegg, CCL18 beskytter også tumorceller fra kjemoterapi ved å øke chemoresistance. De konkluderer dermed med at CCL18 vil være en fremtidig mål ved behandling av lungekreft.
