Abstract
Bakgrunn
selenoenzyme tioredoksinreduktase en har en kompleks rolle i forbindelse med cellevekst. Det er indusert som en komponent av den cellulære respons til potensielt mutagene oksidanter, men synes også å tilveiebringe vekst fordeler for transformerte celler ved å hemme apoptose. I tillegg har selenocystein-manglende eller alkylerte former av tioredoksinreduktase 1 viste også oksydativ, pro-apoptotisk aktivitet. Derfor er en større forståelse av rollen tioredoksinreduktase i redoks initiert apoptotiske prosesser hjemlet.
Metodikk
Rollen tioredoksinreduktase 1 i RKO celler ble evaluert ved å dempe endogen tioredoksinreduktase en uttrykks med siRNA og deretter enten å indusere en selen-manglende tioredoksinreduktase eller behandling med forskjellige redoks utfordringer, inkludert, hydrogenperoksyd, en oksydert lipid, 4-hydroksy-2-nonenol, og en nitrogenoksyd donerende prodrug. Tioredoksin redoks-status, cellulær levedyktighet, og effektor caspase-aktivitet ble målt.
Konklusjoner /Betydningen
I celler med svekkede endogen tioredoksinreduktase 1, en stabilt integrert selenocystein-manglende formen av enzymet ble indusert men endret ikke enten thioredoxin redox status eller celleveksten kinetikk. Den oksidert lipid og nitrogenoksid donor vist forbedret cytotoksisitet når tioredoksinreduktase en ble slått ned; Men effekten var mer uttalt med nitrogenoksid prodrug. Disse resultatene er konsistent med hypotesen om at demping av thioredoxin-system kan fremme apoptose i en nitrogenoksid-avhengig måte
Citation. Edes K, Cassidy P, Shami PJ, Moos PJ (2010) JS-K en nitrogenoksid Prodrog, har forbedret Cytotoksisitet i tykktarm kreft celler med knockdown av tioredoksinreduktase 1. PLoS ONE 5 (1): e8786. doi: 10,1371 /journal.pone.0008786
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 18 september 2009; Godkjent: 30 desember 2009; Publisert: 20 januar 2010
Copyright: © 2010 Edes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av en USPHS Grant CA115616 (PJM). Vi erkjenner også bruk av kjernefasiliteter som støttes av P30 CA042014 tildelt Huntsman Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Moos støttes av NIH men design og utførelse er hans egen. Dr. Shami er grunnlegger av og har lager i JSK Therapeutics, Inc. Dr. Cassidy og Ms Edes erklære ingen potensielle interessekonflikter.
Innledning
pattedyr thioredoxin Systemet består av selenoprotein tioredoksinreduktase (TR), tioredoksin (Trx), og elektrondonor NADPH. TR-Trx system deltar i ulike redoksreaksjoner i celler [1], fra å støtte DNA-syntese [2] til Redox-avhengige cellesignalveier [3] – [6]. TRX og TR kan lette vekst og /eller overlevelse av ondartede celler som sitt uttrykk er forhøyet i noen svulster [7], [8]. Tioredoksinreduktase enzymatisk aktivitet er ikke begrenset til tioredoksin, i stedet, har mange substrater blitt identifisert, inkludert; selenocompounds, askorbat, lipoate og oksiderte lipider [9] – [11]. Imidlertid, i noen oksiderte lipider funksjon inhibere TR1-aktivitet ved å reagere med den nukleofile C-terminus som inkluderer Sec rest [12] – [14].
tilstøtende selenocystein (sek) og cystein (Cys) rester i C-enden av TR-pattedyr er nødvendig for reduktaseaktivitet når Trx er substratet; Imidlertid kan Sec-mangel TR1 har biokjemiske [15] og biologiske [16] aktiviteter forskjellige fra Sec forsynte TR1 som kan være relevant i kreft eller annen sykdom. Sec-mangel TR1 har vist pro-apoptotiske aktivitet i studier hvor rollen av TR1 i interferon og retinsyre-indusert apoptose [17], samt nyere støttedata som har vist sec-manglende TR1 arter (betegnet SecTRAPs) er etter seg potente initiativtakerne apoptose i humane kreftcellelinjer [16]. Apoptose i disse tilfellene var antatt å være mediert ved økt oksidativt stress i cellene. Disse eksemplene viser at forstyrrelse av C-terminalen av TR1 resulterer i en gevinst-of-funksjon protein som kan være et nyttig pro-apoptotiske middel om det kunne være målrettet mot ondartede celler.
I denne studien har vi undersøkte effekten på tykktarmskreftceller av to scenarier der kanonisk TR1 aktivitet (dvs. evnen til å redusere Trx) er minskes enten ved siRNA behandling eller mutasjon av de C-terminale Sec og Cys-rester. Vi begynte med å evaluere redox status for TRX i RKO tykktarm kreft celler hvor endogene TR1 nivåer ble svekket med siRNA. I de samme cellene som mangler villtype TR1, vi så indusert uttrykt en Sec-mangel TR1 og funnet ut at dette proteinet endret verken TRX redox status eller de cellulære vekstkinetikk. Bare i cellene under oksidativt stress fra behandling med diamide gjorde vi finner forskjeller i TR1-comprimised celler. Dette førte oss til å undersøke effekten av TR1 knockdown på en rekke oksidative stressfaktorer inkludert reaktive oksygenforbindelser, et elektro lipid og nitrogenoksid (NO) -prodrug. Virkningene av TR1 uttømming var mest uttalt i kombinasjon med sistnevnte behandling.
NO utviser et bredt spekter av fysiologiske effekter, inkludert markerte effekter på vaskulær og nervesystemer [18], [19]. Det er også lovende som et antineoplastisk medikament som på grunn av sin cytotoksisitet; krever imidlertid optimal klinisk respons romanen levering mekanismer av NO til svulsten i stedet for systemisk administrasjon for å unngå de vaskulære skadevirkninger [20].
O
2- (2,4-dinitrofenyl) 1 – [(4-etoksykarbonyl) piperazin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolate (JS-K) er et prodrug designet for å frigjøre NO intracellulært [21] derfor unngå generaliserte effekter på blodkar. Frigjøringen av NO fra JS-K er avhengig av metabolismen av glutation S-transferaser (GST), og denne avhengigheten kan gi ytterligere neoplastisk selektivitet siden GST er ofte overuttrykt i kreft [22]. JS-K har vist antineoplastiske effekt hos både menneskelige kreftcellelinjer samt dyremodellsystemer [23].
NO kan ha ulike effekter i celler. Fungere som et oksidasjonsmiddel, kan det reagere med metallioner, eller direkte modifisere proteiner på cysteinrester som danner S-nitrosothiols. Denne endringen kan modulere protein funksjon [24]. Den cellulære redoks styring av cystein nitrosylation er et aktivt forskningsområde, og den TR-Trx-systemet har blitt identifisert som en regulator av dette fenomenet [25]. Spesielt har apoptotiske proteiner blitt identifisert som målproteiner modifisert ved nitrosylation [26]. Faktisk effektoren caspase, caspase-3, er mål for nitrosylation som moduleres av cytosolisk og mitokondrielle TRX systemer [27]. Derfor, NO og TR-TRX systemet er integrerte komponenter i cellulære prosesser av programmert celledød. I dagens arbeid utvider vi studiet av dette samspillet til å inkludere effekten av TR1 på aktiviteten til en viktig ny kandidat kreft terapeutisk agent, JS-K.
Resultater
Pattedyr tioredoksinreduktase uten en Sec ble antatt å ha minimal aktivitet; men de siste rapportene tyder på at Sec-mangel tioredoksinreduktase kan ha andre redox aktiviteter. Derfor har vi konstruert en induserbar cellelinje der vi kan uttrykke en C-terminal mutant av TR1 som var motstandsdyktig mot siRNA knockdown. Vi målte ekspresjonen av TR1 ved Western blotting og målte TR aktivitet basert på insulin reduksjon samt liponsyre reduksjon (figur 1). SiRNA effektivt slå ned det endogene TR1 med ~70% og tetracyklin induksjon av stabilt integrert i den C-terminale mutanten var ca 75% av nivået av det endogene TR1 (figur 1A). I tillegg knockdown resulterte i ~70% reduksjon av TR-aktivitet som målt ved den biokjemiske analyse av NADPH oksydasjon med Trx som det mellomliggende og insulin tjener ved det endelige elektronakseptor (figur 1B). Siden TR1 kan redusere alternative substrater til Trx
in vitro
, evaluerte vi også evnen av den C-terminale mutanten av TR1 for å redusere liponsyre i et cellebasert assay (figur 1C). En rekke cellulære enzymer kan redusere lipoate men vi observere en ~40% reduksjon av lipoate reduksjon i RKO celler med endogent TR1 reduseres av den siRNA og i celler som uttrykker den C-terminale mutanten TR1.
Celler ble eksponert til siRNA rettet mot TR1 for totalt 96 timer, og en Sec-mangel C-terminale mutanten TR1 ble indusert for de siste 24 timer. A) Immunoblot-analyse av TR1 proteinekspresjon følgende siRNA behandlinger og induksjon av den Sec-manglende mutant TR1. B) TR biokjemisk aktivitet målt i cellelysater ved å overvåke NADPH-oksydasjon i en analyse som er avhengig av Trx og bruker insulin er den endelige elektronakseptor. Den første linjen på venstre representerer aktiviteten av kontroll (Si-scramble) uten Trx tilsatt til reaksjonsblandingen, hvilket indikerer bakgrunnssignal. C) Cellebasert TR-aktivitet som målt ved hjelp av liponsyre reduksjon i en kolorimetrisk analyse ved hjelp av Ellmans reagens. Den første linjen på venstre representerer aktiviteten av kontroll (Si-scramble) uten liponsyre tilsatt til reaksjonsblandingen. Lysatene fra celler med TR1 slått ned showet betydelige reduksjoner i aktiviteten sammenlignet med kontrollgruppen (SI-Scramble) i begge analysene (***, p 0,001).
Siden TRX er en primær substrat av TR1 og siden andre Sec-manglende TR1 har vist oksidativt stress, målte vi den Trx redoks-status for å bestemme om den Sec-manglende C-terminale mutanten TR1 endret redoks-status av Trx. Vurdering av Trx redoks-status ble utført ved alkylering med jodeddiksyre, reduksjon av oksydert Cys med DTT, og deretter jodacetamid alkylering, som har blitt beskrevet [28]. Ingen endringer ble observert i Trx redox status blant cellene med endogen TR1, celler med TR1 slått ned, og celler med endogen TR1 slått ned pluss induksjon av Sec-mangel C-terminal mutant TR1 (f.eks datasett i figur 2 og sammendrag av flere eksperimenter i tabell 1). Hvis cellene ble utfordret med 1 mM diamid, ble det ikke observert forandringer i redoks-status av Trx, og en forskjell mellom de si-TR1 behandlede celler og Si-krafse var tydelig noe som tyder på at analysen påviser forandringer i redox-status etter en oksydativ utfordring .
i celler uten stimulering (venstre tre baner), er Trx hovedsakelig i den reduserte tilstand, selv med TR1 slått ned og den C-terminale mutanten TR1 uttrykt. Med 1 mm diamide stimulering i 30 min (høyre tre baner), celler med endogen TR1 demonstrere mer redusert Trx enn celler med endogen TR1 slått ned med siRNA.
Siden Sec-mangel TR1 har vist forbedret cytotoksisitet i andre systemer, og så en mulighet var at celler med induserbar Sec-mangel TR1 ikke formerer like hyppig som celler med endogen TR1. Vi målte graden av cellevekst følgende siRNA knockdown og induksjon av ekspresjon av Sec-manglende TR1 ved å telle cellepopulasjon nummer (figur 3). Den cellulære dobling tid for alle tre forholdene var ~24 timer, etter en innledende etterslep periode. Derfor kom denne Sec-mangel TR1 mutant ikke ut til å endre vekstkinetikk av RKO celler som ingen signifikante forskjeller i bakken av vekstkurver ble målt (0,35 ± 0,004 celler /t for si-Scramble, 0,36 ± 0.006 celler /time i si-TR1, og 0,33 ± 0,008 celler /t for si-TR1 samt induksjon av den C-terminale mutanten TR1).
A egge siRNA ble anvendt som en kontroll for å måle det basale vekstrate (fylt square) TR1 ble slått ned av siRNA (fylt sirkel) og med induksjon av Sec-mangelfull, C-terminal mutant TR1 (fylt trekant). Ingen signifikante forskjeller i vekstrater ble observert som heltrukne linjer brukes til å beregne vekstratene for disse forholdene er nesten parallelt.
Siden den induserte uttrykk for Sec-mangel C-terminal mutant TR1 konstruere gjorde ikke fremkalle en forandring i redox-status av Trx, evaluerte vi den cytotoksiske respons av RKO celler med endogent TR1 samt celler hvor TR1 ble dempet med siRNA til reaktivt oksygen og nitrogen i form av H
2o
2 , det oksyderte lipid 4-HNE, eller NO donor JS-K (figur 4). Livskraftig følgende H
2o
2 eksponering var ikke annerledes (figur 4A); 4-HNE eksponering viste en liten, ca. 2 ganger økt følsomhet i cellene med TR1 slås ned med et LC
50 forskjell på 10,6 ± 0,7 pM i cellene med TR1 slått ned i forhold til 24 ± 3,4 uM i cellene med endogen TR1 (figur 4B); NO donor, JS-K, demonstrerte ~6 ganger økt følsomhet i cellene med TR1 svekket av siRNA med en LC
50 forskjell på 3,1 ± 0,5 mikrometer i cellene med TR1 slått ned sammenlignet med 19 ± 2 mikrometer i cellene med endogen TR1, målt med en MTT analysen (Figur 4C).
celler med endogen TR1 (si-Scramble, fylt kvadrat) og celler med TR1 slått ned av siRNA (si-TR1, fylt sirkel) ble sammenlignet ved ekvivalente doser av redox-modulatorer. A) RKO celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av H
2o
2 og levedyktighet ble målt etter en 24 timers eksponering. Ingen ble observert signifikante forskjeller. B) RKO-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av 4-HNE og levedyktighet ble målt etter en 24 timers eksponering. SI-TR1 celler vises ca. 2 ganger økt følsomhet for 4-HNE. C) RKO celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av JS-K og levedyktighet ble målt etter en 24 timers eksponering. SI-TR1 celler vises ~6 ganger økt følsomhet for JS-K.
Siden NO-donor fremmet en mer fremtredende forskjell i levedyktighet mellom RKO celler med endogen TR1 sammenlignet med celler med TR1 slått ned, ytterligere evaluering av celle redoks status ble utført for å evaluere mekanismen av NO-mediert cytotoksisitet forbedret. Først, på grunnlag av de betydelige forskjeller i cellelevedyktighet observeres i MTT-analysen, ble det Trx redoks-status vurdert ved å følge 5 uM JS-K inkubasjon. JS-K behandlede TR1 knockdown-celler viste en mer oksydert fordeling av TRX redox-tilstander etter 90 min inkubering med NO-prodrug (tabell 2). Deretter ble en mer generalisert evaluering av den oksidative tilstanden til cellene vurdert ved å følge 5 uM JS-K-behandling i 24 timer ved å måle forholdet mellom redusert GSH til den totale GSH-nivåer. Ingen signifikante forskjeller i redusert GSH til totalt GSH ble observert (figur 5). Disse data antyder at en global forandring i redox-status ikke ble observert, men at utvalgte proteiner kan bli målrettet.
GSH-målinger ble utført etter behandling med 5 um JS-K i 24 timer., Og forholdet mellom redusert GSH til den totale GSH ble målt. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom behandlingsgruppene.
For å finne mekanismen bak endringene i mobilnettet levedyktighet som bestemmes av MTT-analyse, immunoblot analyse av caspase 3 og DNA-reparasjon protein poly ADP ribose polymerase (PARP) ble evaluert (figur 6). Spaltes kaspase 3 er i samsvar med initiering av apoptose og mengden av caspase 3 cleavage syntes å være mer omfattende når TR1 ble slått ned. Spaltes PARP ble også observert i disse eksperimentene på en doseavhengig måte.
RKO cellene behandlet med bærer, 1,5, eller 5 um JS-K i 24 timer. Protein ble separert ved SDS-PAGE og detektert med immunoblotanalyse. En doseavhengig økning i spaltet PARP og caspase 3 (CASP3) ble observert med mer spaltet materiale i TR1 knockdown. GAPDH ble vurdert som en lasting kontroll
Bevis av apoptose initiering ble observert ved både 1,5 og 5 mikrometer JS-K i immunoblot analyse.; Derfor, den cellulære levedyktighet og cytotoksisitet hvor re-evaluert etter 1,5 pM JS-K inkubasjonstider (hvor cellene fortsatt vises 75% levedyktige, figur 4) basert på protease-aktivitet ved anvendelse av MultiTox analysen. Disse analyser viste seg å være mer følsom enn den MTT-analysen, siden det selv ved denne lave dose, JS-K resulterte i signifikant cytotoksisitet og /eller tap av levedyktighet i TR1 knockdown-celler (~45% levedyktig) i forhold til celler med endogent nivå av TR1 (~68% levedyktige, figur 7A og 7B). Ved den relative caspase-3/7-aktivitet ble målt, og i samsvar med cytotoksisitets data, var det en betydelig forbedring av kaspase-aktivitet i cellene med TR1 slås ned (figur 7C). I separate eksperimenter, det brede spekteret konkurrerende kaspase-inhibitor, Z-Asp-CH
2-DCB, ble inkludert i løpet av inkubasjon med JS-K bekrefter den enzymatiske aktiviteten observert tidligere var kaspase-avhengig aktivitet.
RKO celler behandlet med 1,5 mikrometer JS-K for 24 timer. ble undersøkt med hensyn A) levedyktighet, B) cytotoksisitet, og C) caspase-3/7-aktivitet. I separate eksperimenter ble celler inkubert med Z-Asp-CH
2-DCB, et bredspektret, kompetitiv inhibitor caspase, for å fastslå at caspase-analysen ble virkelig demonstrere effektor kaspase-aktivitet (C). RKO celler med TR1 slått ned demonstrere betydelig større tap i levedyktighet, økt cytotoksisitet og økt caspase-3/7 aktivitet etter JS-K behandling enn RKO celler med endogen TR1 (**, p 0,01; ***, p 0,001; †††, p. 0,001)
Diskusjoner
Mens selenoprotein nivåene er generelt avhengig av selen og selen mangel ser ut til å føre til økt risiko for kreft dødelighet [29] kan den TR1-Trx system være uvanlig blant selenoenzymes i dens evne til å fremme kreft [8], [30]. Faktisk er Trx ofte over uttrykkes på mange tumorer, kan ha anti-apoptotiske egenskaper, og kan bidra til noen former for terapi motstand [7], [31] – [34]. Fra dette perspektivet er hemming av TR1 et utmerket mål for å hemme reduksjonen av tioredoksin i nærvær av ytterligere oksidativt stress. Også flere vanlig anvendte terapeutiske midler, slik som cisplatin, cyklofosfamid, doxorubicin og ser ut til å målrette tioredoksinreduktase så vel som DNA [35] – [39]. Våre resultater tyder på at dempningen av TR1 er utilstrekkelig til å endre status veksten av celler, men det er hensiktsmessig redox spenning følgende dempning av TR1 kan være det mest effektive middel for å oppnå en cytotoksisk respons.
antiapoptotic aktiviteten av Trx har blitt plassert som begrunnelse for målretting TR-Trx system i human kreft [40], [41]. Den siste observasjon at TR-Trx modulerer aktiviteten av caspase-3 i en nitrosylation avhengig måte [27] antyder en viktig rolle for den TR-Trx-systemet i NO-mediert apoptose aktivitet. I dette arbeidet, vi ser også at INGEN prodrug, JS-K, øker apoptose når TR1 er slått ned med siRNA (figur 4 og 6). Denne mekanismen er i samsvar med tidligere mekanistisk data demonstrere øket kaspase-aktivitet i akutt myelogen leukemi-celler [42]. I tillegg, NO-donerer aspirin viste synergistisk aktivitet i kombinasjon med gullholdige forbindelser som er antatt å hovedsakelig være rettet mot den TR-Trx system [43].
rolle TR1 i apoptose har vært gjenstand for undersøkelser siden det ble identifisert som en «Grim»-genet (dvs. gener assosiert med retinoid-IFN-indusert dødelighet, GRIM 12) i en skjerm for gener relatert til retinoid-IFN-indusert apoptose [17]. Mer nylig har det blitt demonstrert at TR1 protein uten en funksjonell Sec rest på grunn av alkylering eller trunkering, når de innføres i celler ved hjelp av
BioPORTER
, apoptose [16], [44]. Men mekanismene for TR-mediert apoptose av TR1 SecTRAPs forbli ukjent. Mutanten TR1 vi utnyttet, med den C-terminale Gly-Ser-Ser-Gly, var ikke en funksjonell tioredoksinreduktase som målt ved NADPH-oksydasjon /reduksjon insulin samt liponsyre reduksjon (figur 1); men det heller ikke ut til å fungere som en SecTRAP apoptotisk initiator som beskrevet av Arner og kolleger [16]. I likhet med en tidligere rapport [45], var vi ikke i stand til å identifisere basale endringer i Trx eller mobilnettet redoks status når TR1 ble slått ned med siRNA (figur 2, tabell 1), men gjorde observere endret Trx redox status følgende JS-K behandling ( tabell 2). I tillegg, ekspresjon av dette Sec-manglende mutant TR1 endret ikke den oksidative status av Trx. Derfor ser det ut til at ikke alle Sec-manglende TR proteiner fremme oksidativt stress og apoptose.
Målretting TR1 for cancerterapi er ikke uten uønskede uheldige effekter hvis det ikke er rettet mot tumoren. For eksempel, tumor suppressor, p53, er en viktig regulator av cellevekst og apoptose, og TR1 forbedrer p53-funksjon, antagelig ved å bidra reduserende ekvivalenter gjennom Trx på atom redoks regulator Ref-1 [12], [13], [46 ], [47]. Flere vanlige terapeutiske midler, slik som cisplatin, cyklofosfamid, og doxorubicin synes å målrette TR1, så vel som DNA [35] – [39], men kanskje, en årsak til noen av de uønskede bivirkninger som observeres med disse vanlige terapeutika, kan være » off-target «hemming av TR1. En annen redox modulerende stoff som har blitt evaluert hos kreft kliniske studier, motexafin gadolinium, var tenkt å spesifikt mot TR1 [7]. Imidlertid synes motexafin gadolinium for å være et substrat for TR1 og genererer reaktive oksygenforbindelser gjennom denne interaksjonen, så vel som å være en inhibitor av ribonukleotid-reduktase [48]. Hvis denne forbindelses kliniske aktivitet virkelig er på grunn av dens interaksjon med TR1, er det fortsatt uklart hvilke tumorer skal være målrettet, da denne forbindelse har vist blandede resultater i kliniske forsøk til nå [49] – [51], men det ser ut til å holde spesielt lovende som bestrålingssensibilisator [52], [53].
Selv med potensielle komplikasjoner av målretting TR1 i kreft, resultatene her tyder på at stoffet kombinasjon tilnærminger, som NO-donor, JS-K, kan være mest effektiv hvis den kombineres med legemidler som er rettet mot TR1.
Materialer og metoder
Material
Avansert DMEM, Glutamax, 5,5 «, 6,6»-tetraklor-en, 1 «, 3,3»-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine jodid (JC-1, MitoProbe JC-1-analysesett), 3- (4,5-dimethylthiaxol-2-yl) -2,5-diphenyltretraxolium-bromid (MTT), Hanks balanserte saltløsning med Ca og Mg (HBSS) ble Tris-glysin 8% geler og bovint serumalbumin innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Føtalt bovint serum ble kjøpt fra Hyclone (Logan, UT). Den RKO cellelinjen ble kjøpt fra American Tissue Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Monoklonale antistoffer rettet mot tioredoksinreduktase (B-2, SC-28321, lot # J1304); polyklonale antistoffer rettet mot thioredoxin (FL-105, sc-20146, vare # A1907), og GAPDH (FL-335, sc-25778); esel polyklonale anti-mus og anti-kanin-antistoffer konjugert med pepperrot-peroksydase ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ytterligere polyklonale antistoffer rettet mot kaspase 3 (9661), spaltet caspase 3 (9662), og PARP (9532) ble anskaffet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Bovine serum albumin standard og Coomassie Plus Protein Reagens var fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL). Proteasehemmer cocktail tabletter (COMPLETE®) ble kjøpt fra Roche (Indianapolis, IN). PVDF membran ble kjøpt fra Millipore (Burlington, MA). Den caspase inhibitor, Z-Asp-CH
2-DCB, var fra Peptider International (Louisville, KY). Vestlige Lighting Chemiluminescence reagenser var fra PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). JS-K ble syntetisert som tidligere beskrevet [54]. Dimetylsulfoksid (DMSO) og vanlige buffere og salter ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cell kultur
RKO tykktarm kreft celler ble brukt som en representant kolon cellelinje og ble opprettholdt i Advanced DMEM supplementert med 1% Glutamax og 2% føtalt bovint serum. Tidligere beskrev vi seterettet mutagenese av C-terminale ende av TR1 fra Gly-Cys-Sec-Gly å Gly-Ser-Ser-Gly pluss en taus mutasjon inn i siRNA identitet stedet for å gjøre dette konstrukt motstandsdyktig mot siRNA rettet mot endogen TR1. Vi subklonet dette muterte TR1 bygge inn pcDNA5 /FRT /TO og deretter settes inn i RKO celler med stabilt integrert pcDNA6 /TR og pFRT /
lac
Zeo, gjengi en tetracyklin induserbar mutant TR1 cellelinje. Disse mutasjonene til TR1 samt siRNA som brukes til å modulere endogen TR1 er tidligere beskrevet [13]. Eksperimentelt ble cellene sådd ut på 2-3 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plate og transfektert med siRNA rettet mot TR1 (Si-TR1) eller kontroll genereres av scrambling Si-TR1 sekvens (si-scramble) for 72 timer. Deretter ble cellene behandlet eller stimulert med tetracyklin i 24 timer som indikert.
immunoblotanalyse
Celler i 6-brønns plater ble plassert på is. Media ble aspirert, og cellene ble deretter vasket med 1 ml kald 1 x PBS og PBS aspirert. Cellelysater ble samlet som tidligere beskrevet [13]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med Coomassie Plus Protein Reagens (Pierce). Absorbans ved 595 nm ble målt ved anvendelse av en Perkin-Elmer Victor
3V plateleser. Ti til 15 ug protein ble separert på enten 8% Tris-glysingeler (for TR1) eller 10% opprinnelige urea-geler (for Trx), overført til PVDF-membran, blokkert med 10% ikke-fett tørrmelk, inkubert med primært antistoff (1:200 for TR, 1:250 for Trx, 1:1000 for både caspase 3 og spaltet caspase 3, 1:1000 til PARP, og 1:500 for GAPDH) over natten ved 4 ° C, vasket 3 x, inkubert med sekundært antistoff (1:5000) i 45 minutter ved 22 ° C, vasket 3 ×, inkuberes med chemiluminesence reagenser, og utsatt for røntgenfilm.
tioredoksinreduktase aktivitetsanalyser
Cellular TrxR1 aktiviteten ble målt som tidligere har blitt beskrevet [13]. I tillegg målte vi liponsyre reduksjon i likhet med en tidligere beskrevet analyse [55]. I korthet ble cellene sådd ut og behandlet som beskrevet. Deretter ble cellene trypsinert, vasket med PBS og resuspendert i en løsning av 1 ml inneholdende 5 mM glukose i PBS, med eller uten 1 mM liponsyre og 0,2 mM DTNB med forsiktig risting ved 37 ° C i 15 min. Cellene ble sentrifugert og supernatanten prøven ble fortynnet 1:01 med vann og absorbansen ble målt ved 412 nm. Den negative kontrollen var medium uten celler. Cellepelleten ble vasket med PBS, lysert celler i lysis buffer og proteinet målt ved anvendelse av Bradford-analysen. Den reduserte lipoate ble normalisert ved den cellulære proteininnholdet.
Redox status av Trx
Redoks status av Trx ble utført som beskrevet [28]. I korthet ble cellene lysert i 8 M urea bufret med Tris pH 8,9 inneholdende 30 mM jodeddiksyre, sonikert, og inkubert i 15 minutter ved 37 ° C. Proteinet ble utfelt med 10 volumer iskald aceton-1N HCI (98:2, vol /vol), sentrifugert ved 11000 x g i 5 min ved 4 ° C, vasket med kald aceton-HCl, resuspendert i 95 pl av bufret urea inneholdende 35 mM DTT, inkubert i 30 minutter ved 37 ° C, 7,5 ul 200 mM jodacetamid ble legge til hver prøve, og inkubert i 15 minutter ved 37 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved bruk av Coomassie Plus-protein-reagens.
MTT-analysen
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av en MTT som tidligere beskrevet [56], som er avhengig av tetrazoliumsalt reduksjon av NADH i levedyktige celler ( Berridge
et al.
, 2005).
glutation kvantifisering
Redusert glutation (GSH) og total GSH ble målt ved hjelp av GSH-GLO reagenser (Promega). Omtrent 2,5 × 10
3 celler som var pre-inkubert med siRNA rettet mot TR1 ble belagt i hvitt sidig 384 brønners plater, lov til å overholde, og deretter behandlet med 0 eller 5 mikrometer JS-K for 24 timer. Media ble fjernet ved sentrifugering, ble den redusert GSH direkte målt i henhold til fremstillings instruksjoner, og den totale GSH ble målt ved å inkubere cellene med 1 mM TCEP for å redusere oksydert GSH. Denne analysen er et glutation-S-transferase-avhengig assay som bruker GSH til å generere luciferin som et substrat for luciferase for å generere lys. Luminescens ble målt ved anvendelse av en Perkin-Elmer Victor
3V-plateleser.
MultiTox assay
levedyktighet og cytotoksiske målinger ble bestemt ved differensial protease-aktivitet ved hjelp av MultiTox-Fluor Multiplex Assay (Promega) . Denne analysen anvender et GF-AFC substrat som er cellepermeabel for å vurdere levedyktige celler, og en bis-AAF-R110 substrat som ikke er cellepermeabel for å vurdere proteaseaktivitet fra døde celler. Fluorescensen fra disse substrater ble målt ved anvendelse av et Perkin-Elmer Victor
3V plateleser; GF-AFC levedyktighet substrat ble målt ved 405 nm eksitasjon, 475 nm stråling; og bis-AAF-R110 cytotoksisitet substrat ble målt ved 485 nm eksitasjon, 535 nm emisjon.
Caspase aktivitetsanalyse
Effector kaspase-aktivitet ble målt ved anvendelse av caspase-GLO 3/7 Assay ( Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Dette er en analyse hvor en DEVD peptidsubstrat spaltes av aktive caspaser å frigi aminoluciferin som et substrat for luciferase for å produsere lys. Luminescens ble målt ved anvendelse av en Perkin-Elmer Victor
3V-plateleser.
Statistisk analyse
en-veis ANOVA ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans mellom prøvene (GraphPad INSTAT versjon 3.06). Bonferroni multiple sammenligninger post hoc testing ble brukt til å etablere betydning mellom behandlingsgruppene med p 0,05 ansett som signifikant
.
