Abstract
Bakgrunn
Mange pasienter diagnostisert med eggstokkreft erfaring tilbakefall og metastasering, to aspekter som ofte vil føre til sin død. Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er en viktig prosess som er involvert i kreft progresjon. Med økende bevis knytter Cisplatin og EMT, ønsket vi å identifisere et sammensatt stand til å møte EMT progresjon når kreftcellene blir behandlet med cisplatin.
metodikk /hovedfunnene
Celledød ble evaluert av cytometri med Annexin V /PI flekker i A2780 og A2780CP celler. Eggstokkreft cellelinjer ble behandlet med cisplatin (24 timer, 10 mm) og forskjellige konsentrasjoner av Resveratrol å evaluere dens effekt på Cisplatin-indusert EMT bruker Western Blot og RT-PCR-analyse. Morfologiske studier og sårtilheling analyse for å vurdere cellemotilitet ble utført med 72 h Cisplatin behandling med A2780 og A2780CP celler. Densitometry ble gjort på Western Blot og PCR-resultater, og statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av One-Way ANOVA etterfulgt av Tukey post-hoc test. Våre resultater viser at cisplatin-indusert EMT-assosierte morfologiske forandringer i A2780 ovarian cancer cellelinje, og i mindre grad i sin Cisplatin-resistente motstykke A2780CP. Resveratrol forårsaket celledød i A2780 og A2780CP cellelinjer i en apoptotisk uavhengig. Resveratrol hemmet Cisplatin-indusert Snail uttrykk ved å redusere Erk pathway aktivering, falt morfologiske endringer indusert av Cisplatin og redusert celle migrasjon.
Konklusjoner
Disse resultatene indikerer at Resveratrol har interessant potensial til å hindre Cisplatin- indusert EMT i eggstokkreft celler. Ved å øke celledød, representerer den også en innbydende måte som adjuvansterapi for å brukes sammen med kjemoterapi. Ved hjelp av ERK pathway hemmere kan også vise seg nyttig i eggstokkreft behandling for å redusere risikoen for metastase
Citation. Baribeau S, Chaudhry P, Parent S, Asselin É (2014) Resveratrol hemmer Cisplatin-Induced Epitelial-til- mesenchymale Overgang i eggstokkreft cellelinjer. PLoS ONE 9 (1): e86987. doi: 10,1371 /journal.pone.0086987
Redaktør: Goli Samimi, Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, Australia
mottatt: 04.10.2013; Godkjent: 19 desember 2013; Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Baribeau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av et stipend fra det kanadiske Institutes for Health Research (MOP-66987). EA har en kanadisk Research Chair i molekylær-Gyneco-Oncology. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den syvende vanligste kreftformen og den tredje vanligste blant gynekologisk kreft i kanadiske kvinner. Eggstokkreft er også gynekologisk kreft med høyest dødelighet og en 5-års overlevelse anslått til bare 15-25% [1]. Dette kan forklares ved det faktum at pasienter som er rammet av kreft i eggstokkene ofte allerede har en høy-trinns sykdom ved tidspunktet for diagnose [2], [3]. Vanlig behandling for eggstokkreft består av kirurgisk cytoreduksjon fulgt av platina-basert kjemoterapi [4]. Til tross for innledende respons på behandlingen, vil mange pasienter tilbakefall og til slutt bli påvirket av metastaser og til slutt møte sin død.
epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er en fysiologisk prosess som oppstår under embryonal utvikling og noen ganger i voksne, for eksempel under sårheling [5]. EMT er et fenomen hvor cellene vil gjennomgå en overgang fra en epitelial fenotype til en mer bevegelig og invasive fenotype mesenchymale, gjør dem i stand til å invadere vev og danne metastaser. Den viktigste kjennetegn på EMT er tapet av E-cadherin, et knutepunkt protein uttrykkes vanligvis i epitelceller. I de fleste tilfeller, blir E-cadherin tap mediert av transkripsjonelle repressorer, og mutasjoner i genet eller proteinet er ikke vanlige arrangementer [6]. Den hyppigst involvert repressors inkluderer sneglen, Slug, og ZEB1 som direkte binder til E-cadherin arrangøren å undertrykke sin transkripsjon [7], [8]. Mange faktorer som er kjent for å indusere EMT, inkludert cytokiner, slik som TGF-β [9] eller MAPK-reaksjonsveien Erk [10]. En fersk studie på eggstokkreft rapportert Cisplatin som induserer EMT [11].
snegle og Slug er transkripsjonsfaktorer hovedsakelig kjent for sitt engasjement i EMT der de undertrykke uttrykket av epiteliale markører, for eksempel E-cadherin og claudin-1, og øke ekspresjonen av mesenchymale markører, slik som ZEB1 og MMP-9 [12] – [16]. De kan også undertrykke ekspresjon og funksjon av p53 tumor suppressor og markeds chemoresistance [17], [18]. Under EMT progresjon, er det antatt at sneglen vil være den første faktor for å bli aktivert for å initiere overgangen, mens Slug ville bli uttrykt i senere stadier for å tillate cellene å beholde sine egenskaper mesenchymale [19]. ZEB1 er en annen viktig formidler av EMT ved å undertrykke ZO-1 og E-cadherin [20], men kan også være involvert i å øke formeringshastigheten av celler [21].
resveratrol (trans-3,4 « 5-trihydroxystilbene) er et naturlig stoff produsert i mange planter, inkludert røde druer [22], og senere til stede i vin, kjent for sin antioksidant og dens beskyttende effekt på det kardiovaskulære systemet og mot kreft som det kan hemme flere stadier av sykdom [23]. I løpet av de siste årene, i så mange effekter plassert Resveratrol i søkelyset for forskning.
I denne studien undersøkte vi effekten av Resveratrol på Cisplatin-indusert EMT i eggstokkreft. Vi fant ut at cellene co-behandlet med Resveratrol og Cisplatin ikke viser karakteristiske trekk ved EMT, som Resveratrol behandling avskaffet cisplatin-indusert Snail protein og mRNA uttrykk på en doseavhengig måte. Dette innebar Erk sti, som ble hemmet av Resveratrol og engasjementet ble bekreftet via spesifikk MEK1 /2 hemming med U0126. Resveratrol også blokkert morfologiske endringer i A2780 og A2780CP celler og redusert migrasjon evne A2780 og A2780CP celler under en sårtilheling analysen. Lignende inhibering av migrering ble observert i OVCAR-3 og SKOV-3-celler. Vi foreslår også β-catenin som en markør av motstand mot Cisplatin-indusert apoptose som det var bare spaltet i Cisplatin-sensitive cellelinjer.
Metoder
Reagenser
Dulbeccos modifiserte Eagle medium-F12 (DMEM-F12), og bovin vekst serum (BGS) ble kjøpt fra HyClone (South Logan, Utah). Gentamycin, Cisplatin, og Resveratrol ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Den MEK1 /2-inhibitor og den Senescence β-galaktosidase-farging sett ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Død celle apoptose kit med annexin-V /PI, Trizol reagent og Moloney murine leukemia virus (M-MLV) revers transkriptase ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California).
Cellekultur og behandling
menneske~~POS=TRUNC eggstokkreft cellelinjer A2780 og A2780CP (motstandsdyktig mot cisplatin) celler var en slags gave fra Dr G. Peter Raaphorst (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, Canada) og ble opprinnelig beskrevet i [24]. Ovčar-3 og Skov-tre cellelinjer ble kjøpt fra ATCC. A2780 og A2780CP celler ble dyrket i DMEM-F12-medium supplert med 2% BGS. OVCAR-3-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium og SKOV-3-celler ble dyrket i McCoys medium begge supplert med 10% FBS. Gentamycin (50 mikrogram /ml) ble tilsatt til alle kulturmedier.
For å studere effekten av Resveratrol på Cisplatin-indusert EMT, A2780 og A2780CP celler ble samtidig behandling med Resveratrol og 10 mm Cisplatin i 24 timer. For å studere virkningen av Erk veien på cisplatin-indusert EMT, ble ovarie cancer-cellelinjer forbehandlet med 20 uM U0126 i 1 time, deretter Cisplatin ble tilsatt til kulturmediet i 24 timer ved en sluttkonsentrasjon på 10 uM. DMSO ble anvendt som kontroll for U0126 og resveratrol.
Påvisning av celledød ved strømningscytometri
A2780 og A2780CP celler ble behandlet med resveratrol og cisplatin i 24 timer. Ved høsting ble cellene sentrifugert ved 500 rpm i 5 minutter, vasket med PBS og deretter sentrifugert 300 rpm i 5 minutter. Celledød ble evaluert med Annexin V-FITC-og propidiumjodid (PI) dobbeltfarging ved hjelp av død celle apoptose kit ifølge produsentens protokoll. Fluorescens ble lest ved hjelp av en Cytomics FC 500 MPL flowcytometeret (Beckman Coulter). Positive celler for Annexin-V og /eller PI ble betraktet som døde celler.
MTT analyse
Spredning av A2780 og A2780CP celler ble evaluert av MTT-analyse. Celler ble sådd ut i duplikat i 96-brønners plater og igjen å følge natten over. Den følgende dag ble cellene i vekstfase behandles med 0-60 uM resveratrol med eller uten 10 mM Cisplatin i 24 timer i 100 ul kulturmedium. 4 timer før slutten av behandlingen, ble 10 ul av MTT-løsning tilsatt til hver brønn og platene ble plassert i inkubatoren. 4 timer senere ble 100 ul oppløseliggjøring-løsning (10% SDS i 0,01 M HCl) tilsatt til hver brønn og platene ble igjen i inkubatoren natten over. Dagen etter absorbansen ble avlest ved A
595nm med en Fluostar Optima plateleser.
Western Blot
Cellene ble høstet etter 24 timer Resveratrol-Cisplatin eller U0126-Cisplatin behandling og vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS). Cellene ble deretter lysert i RIPA lysebuffer inneholdende komp protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science) og underkastet tre fryse /tine sykluser ved -20 ° C. Cellene ble deretter sentrifugert, og supernatanten ble oppsamlet. Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved bruk av BioRad DC-proteinanalyse. Lik mengde av proteiner (20-40 ug) ble deretter separert på SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (BioRad, Hercules, CA). Membranene ble blokkert i 5% fettfri skummet melk i PBS-Tween 20 0,05% (PBS-T) i 1 time før inkubering med primært antistoff (fortynnet 1:1000 i PBS-T /melk) over natten ved 4 ° C (alle antistoffer er fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA, bortsett GAPDH fra Abcam (Cambridge, MA)). Primært antistoff rettet mot sneglen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og HRP-konjugert-GAPDH ble inkubert i 45 minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjon ble membranene vasket fire ganger i PBS-T før inkubasjon med pepperrot-peroksidase konjugert sekundært antistoff (BioRad, Hercules, CA) fortynnet 1:3000 i PBS-T /melk. Membranene ble vasket fire ganger i PBS-T, og antistoffene ble avslørt ved hjelp av SuperSignal West Femto substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL), som beskrevet av produsenten, ved hjelp av UVP Bio-Imaging System. GAPDH ble brukt som lasting kontroll.
Cell morfologi
Celler ble dyrket i 6-brønners plater og deretter behandlet med 2,5 mikrometer Cisplatin og /eller 60 mikrometer Resveratrol i 72 timer i A2780 og A2780CP celler å gi nok tid for EMT morfologiske endringer å skje. Etter behandling ble cellene vasket med friskt medium for å fjerne døde celler. Til slutt ble cellene observert under et Carl Zeiss Axio observerZ1 mikroskop for å fastslå deres morfologi og bilde ble tatt i fasekontrastmikroskop hjelp 20X forstørrelse. Celler presentere mesenchymale egenskaper, med en mer fibroblast-lignende morfologi og cellulære fremspring, ble ansett å ha gjennomgått EMT.
sårtilheling analysen
For å evaluere cellemotilitet, celler ble sådd ut i 24-brønn plater og dyrket til konfluens. En steril piss ble anvendt for å lage en ripe i cellelaget. Cellene ble deretter behandlet med 2,5 mikrometer Cisplatin og 60 mikrometer Resveratrol og bildene ble tatt på riktig tid for å evaluere lukking av sår. Sårene ble vurdert ved bruk av ImageJ programvare for å måle sårområdet ved forskjellige tidspunkter. Prosentandelen av sårheling ble beregnet som sårareal ved en gitt tid i forhold til den opprinnelige såroverflaten. Bildene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter utført i duplikater.
revers transkriptase PCR (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra behandlede celler ved hjelp Trizol Reagens henhold til produsentens instruksjoner. 500 ng av RNA ble revers transkribert ved bruk av M-MLV revers transkriptase og oligo (dT) primere. Den reverstranskribert RNA ble deretter amplifisert ved PCR ved anvendelse av spesifikke primere. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Humant snegle ble amplifisert ved å bruke den forstand primer 5′-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3 «og antisense-primer 5′-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′ (fragment lengde 140 bp). Human TCF8-ZEB1 ble amplifisert ved bruk av primeren 5»-følelse TTACACCTTTGCATACAGAACCC-3 «og antisense-primer 5′-TTTACGATTACACCCAGACTGC-3′ (fragment lengde 100 bp). Humant vimentin ble amplifisert ved hjelp av 5»-følelse CGAAAACACCCTGCAATCTT-3 «og antisense-primer 5′-CTGGATTTCCTCTTCGTGGA-3′ (fragment lengde 133 bp). GAPDH ble amplifisert ved hjelp av 5»-følelse GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3 «og antisense-primer 5′-GACTTGACAAAGTGGTCG-3» (fragment lengde 139 bp). GAPDH ble brukt som kontroll.
Senescence-forbundet β-galaktosidase flekker
Celler ble sådd ut i 6-brønners plater og venstre for å følge over natten. Den følgende dag ble cellene behandlet med 60 uM resveratrol og 2,5 uM cisplatin i 72 timer. Etter behandling ble cellene vasket for å fjerne ikke-adherente celler og farget med den Senescence β-galaktosidase-farging sett i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Cellene ble deretter telles under et lysmikroskop for å vurdere hvor stor prosentandel av senescent celler som dukket opp som blå celler.
densitometry og Statistisk analyse
Densitometrisk analyse ble gjort på Western Blot resultater og PCR-bilder Antall One-programvaren (BioRad) for å bestemme overflod av proteiner eller forsterket mRNA studert. I begge tilfeller ble GAPDH anvendt som kontroll. I sårheling analyser, ble såret området mesured hjelp ImageJ programvare. Sårlukking ble evaluert ved å sammenligne sårområdet ved et gitt tidspunkt til den første sårområdet. Sammenligning mellom behandlingene ble utført ved hjelp GraphPad PRISM programvareversjon 5.00 (San Diego, CA) ved hjelp av enveis ANOVA analyse og
post hoc
Tukey test. Statistisk signifikans ble akseptert når p 0,05. Alle eksperimenter utført i denne studien ble gjentatt tre uavhengige ganger.
Resultater
Resveratrol induserer celledød i eggstokkreft celler
Behandling av A2780 og A2780CP eggstokkreft celler med Resveratrol økt celledød på en dose-avhengig måte som vist ved den andel av PI-positive celler. Den lave andel av Annexin V-farging i resveratrol-behandlede prøvene, men ikke i Cisplatin-behandlede prøver antyder at resveratrol kan indusere celledød gjennom en annen mekanisme eller skje raskere enn cisplatin-indusert celledød (figur 1).
celledød nivåer ble evaluert ved flow cytometri med Annexin V-PI og flekker på A2780 og A2780CP celler. Representative flowcytometri Resultatene er vist for A2780 (A) og A2780CP-celler (B) ble behandlet med 10 uM Cisplatin og 40 uM resveratrol. I øvre høyre hjørne, er prosenten av celledød vist, tilsvarende apoptotiske og nekrotiske celledød. Annexin-V og PI-negative celler (B3) er ikke-apoptotiske. Annexin-V positive og PI negative celler (B4) er i de tidlige stadier av apoptose. Annexin-V-positive og PI-positive celler (B2) er i slutten av apoptose. Annexin-V-negative og PI-positive celler (B1) er nekrotiske celler. Celledød i prosent er vist i (C) for begge cellelinjer som ble behandlet med økende doser av resveratrol opp til 60 uM med eller uten Cisplatin 10 uM. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter. I grafer, søyler identifisert med ulike bokstaver er signifikant forskjellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R20: Resveratrol 20 mikrometer, R40: Resveratrol 40 mikrometer, R60: Resveratrol 60 mikrometer, CP: Cisplatin, R20CP: Resv. 20 mikrometer + cisplatin R40CP: Resv. 40 mikrometer + cisplatin R60CP: Resv. 60 mikrometer + Cisplatin.
Vi har undersøkt apoptose og autofagi som potensielle celledødsmekanismer. I A2780-celler, Cisplatin induserte en økning i kaspase-3 og PARP-spaltning, hvilket indikerer induksjonen av celledød ved apoptose. I motsetning til dette, har behandling av A2780 eller A2780CP celler med resveratrol ikke påvirke nivåene av spaltede caspase-3 tross for tilstedeværelsen av døde celler, for å styrke den mulighet at en annen enn apoptose mekanisme er involvert (figur 2). Vi bestemte oss for å studere autofagi induksjon ved å evaluere uttrykket nivåer av LC3B-II og Beclin-en, to proteiner som er kjent for sitt engasjement i autofagi progresjon. Resveratrol medført en økning i LC3B-II i begge cellelinjer, støtter resultatene fra Opipari
et al
. viser autofagi som en potensiell mekanisme ansvarlig for Resveratrol-indusert celledød [25]. I vår modell har vi ikke observere en økning i Beclin-1-nivå, som allerede er uttrykt ved relativt høye nivåer i A2780 og A2780CP cellelinjer.
Mekanismen for celledød ble studert i A2780 og A2780CP celler i respons på Cisplatin og Resveratrol. Fraværet av økningen i spaltede PARP nivåer og caspase-3 cleavage når høyere doser av Resveratrol er brukt antyder Resveratrol ville indusere celledød gjennom en mekanisme uavhengig av apoptose. Den betydelige økningen i LC3BII antyder Resveratrol kan indusere celledød gjennom autofagi. Densitometry analyse fremkommer under Western Blot for hver cellelinje. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter. I grafer, søyler identifisert med ulike bokstaver er signifikant forskjellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R40: Resveratrol 40 mikrometer, CP: Cisplatin, R20CP: resv. 20 mikrometer + cisplatin R40CP: Resv. 40 mikrometer + cisplatin R60CP: Resv. 60 mikrometer + Cisplatin.
Resveratrol forsterker Cisplatin-indusert reduksjon i celleproliferasjon
neste søkt å evaluere effekten av Resveratrol på spredning av A2780 og A2780CP cellelinjer. Som vist i figur 3, lave doser av resveratrol (20-40 pM) øker svakt proliferasjonen av begge cellelinjene til tross for celledød assosiert til denne behandlingen. Ved høyeste dose testet (60 mm) Resveratrol induserte en svak nedgang i spredning i A2780 celler og nesten ingen endring i A2780CP celler. I Cisplatin-sensitive A2780-celler, potenserer resveratrol reduksjon i celleformering observert når Cisplatin er brukt som behandling tyder på en synergistisk virkning mellom disse to forbindelser. Dette ble ikke observert i Cisplatin-resistente A2780CP celler, men den høyeste dosen resveratrol ikke økte proliferasjon når de brukes i kombinasjon med cisplatin.
MTT-analysen ble utført for å evaluere A2780 og A2780 cellelinjer proliferasjon i respons til 10 uM Cisplatin og økende doser opp til 60 mikrometer av Resveratrol. A2780-celler proliferasjon ble øket med resveratrol ved 20 uM og redusert på 60 uM mens alle doser indikerer en økning i proliferasjon i A2780CP celler. Resveratrol forsterker også Cisplatin reduksjon av spredning i A2780 celler. Graf barer med ulike bokstaver er signifikant forskjellig (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R20: Resveratrol 20 mikrometer, R40: Resveratrol 40 mikrometer, R60: Resveratrol 60 mikrometer, CP: Cisplatin, R20CP: Resv. 20 mikrometer + cisplatin R40CP: Resv. 40 mikrometer + cisplatin R60CP: Resv. 60 mikrometer + Cisplatin.
Resveratrol hemmer Cisplatin-mediert EMT induksjon i eggstokkkreft cellelinjer
For å vurdere effekten av Resveratrol på Cisplatin-indusert EMT, A2780 og A2780CP celler var co -behandlet med Resveratrol og cisplatin. Som forventet, behandle cellene med Cisplatin økt proteinnivå Snail, vimentin og ZEB1, tre av de viktigste markører for EMT. Behandle cellene med cisplatin og Resveratrol redusert uttrykket nivåer av Snail, men viste ikke denne effekten på vimentin og ZEB1 uttrykk. I motsetning til dette ble disse to proteinene noe øket når cellene ble utsatt for resveratrol alene (figur 4A). Nedgangen i Snail nivåer i A2780 behandlet med Resveratrol og Cisplatin korrelerer med en reduksjon i Snail mRNA levels.However, dette var ikke tilfelle i A2780CP cellene der ingen signifikant endring ble observert i sneglen mRNA nivåer mellom prøvene behandlet med cisplatin og de som ble behandlet med både Cisplatin og Resveratrol, foreslå noen posttranslasjonelle mekanismer kan også være involvert i sneglen downregulation i disse cellene (Figur 4B). ZEB1 og vimentin mRNA nivåer forble stort sett uendret i celler behandlet med enten Resveratrol, Cisplatin eller begge legemidlene. I vår celle modell, kan vi ikke vurdere EMT progresjon basert på nedregulering av E-cadherin fordi A2780 og A2780CP celler ikke uttrykker dette proteinet.
Western Blot analyse av EMT markører Snail, vimentin og ZEB1 i A2780 og A2780CP (a) celler som respons på 10 um cisplatin, med eller uten økende doser av resveratrol. Densitometrisk analyse er vist under hver cellelinje Western blot. Resveratrol hemmer Cisplatin-indusert Snail uttrykk på en doseavhengig måte, men litt øker ZEB1 og vimentin nivåer. Den Resveratrol doseavhengig reduksjon i P-ERK2 nivåer antyder involvering av Erk veien i Resveratrol-indusert Snail downregulation. EMT markører snegle, vimentin og ZEB1 ekspresjon ble analysert ved RT-PCR i A2780 og A2780CP (B) celler behandlet med 10 um cisplatin, med eller uten økende doser av resveratrol. Resveratrol eller Cisplatin behandling hadde ingen effekt på ZEB1 og vimentin mRNA nivåer. Vimentin og ZEB1 densitometry er vist under hver cellelinje. Snail mRNA uttrykk ble kun redusert i A2780 celler, noe som tyder på en annen mekanisme kan være involvert i A2780CP celler. Bilder vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. I grafer, søyler identifisert med ulike bokstaver er signifikant forskjellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, R40: Resveratrol 40 mikrometer, CP: Cisplatin, R20CP: resv. 20 mikrometer + cisplatin R40CP: Resv. 40 mikrometer + cisplatin R60CP: Resv. 60 mikrometer + Cisplatin.
Aktivering av MAPK Erk er assosiert med cisplatin-indusert EMT
Vi neste undersøkte mekanismen som Resveratrol tellere Cisplatin-indusert Snail uttrykk. MAPK /Erk reaksjonsveien er en av de mulige mekanismer som kan være involvert i induksjon EMT i celler. I A2780 og A2780CP celler, ble Erk2 fosforylering stiger som respons på Cisplatin. Aktiveringen av denne reaksjonsveien ble betydelig inhibert av resveratrol, svarende til en reduksjon i snegle nivåer i A2780 og A2780CP cellelinjer (figur 4). For ytterligere å bekrefte involvering av Erk i økningen av snegle nivåer i respons til cisplatin, brukte vi U0126, et MEK1 /2 spesifikk inhibitor (figur 5). Forbehandling av celler med denne inhibitor betydelig redusert aktiveringsnivåer Erk2 på A2780 og A2780CP celler, som også korrelert med en signifikant reduksjon i snegle-protein i begge cellelinjer. Liten økning i proteinnivå vimentin og ZEB1 ble også observert (figur 5A). Snail mRNA nivåer ble redusert når begge cellene linjene ble behandlet med cisplatin og U0126, noe som tyder Cisplatin-indusert Snail uttrykk gjennom Erk sti krever transkripsjon av sneglen genet. ZEB1 og vimentin mRNA nivåer viste ikke signifikante endringer når A2780 og A2780CP celler ble behandlet med cisplatin og U0126 alene eller i kombinasjon (figur 5B). Disse resultatene støtter resveratrol-indusert EMT-inhibering gjennom Erk veien.
A2780 og A2780CP cellelinjer ble forbehandlet med U0126 å hemme Erk aktivitet og behandlet med cisplatin i 24 timer. Western Blot er vist i (A). Tilsvarende densitometry er vist under hver cellelinje. Erk hemming redusert Cisplatin-indusert Snail uttrykk, men noe økt ZEB1 og vimentin uttrykk i begge cellelinjer. Tilsvarende PCR resultatene er vist i (B). Snail mRNA reduksjon i U0126 + Cisplatinbehandlede prøvene tyder Snail regulering av Cisplatin innebærer gentranskripsjon. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter. I grafer, søyler identifisert med ulike bokstaver er signifikant forskjellige (p 0,05). I grafer, mock: ubehandlede celler, CP: Cisplatine, U + CP. U0126 + Cisplatin
Resveratrol blokker Cisplatin-indusert morfologiske endringer
For å unngå overdreven Cisplatin-indusert cytotoksisitet i A2780 celler, bestemte vi oss for å bruke 2,5 mikrometer Cisplatin å vurdere morfologiske endringer i A2780 og A2780CP celler for en 72 timers behandling. Behandling av eggstokkreft celler med Cisplatin indusert morfologiske endringer som minner om EMT som cellene mistet sin epitel brostein lignende morfologi å få en mer langstrakt fibroblast-lignende form. Cellular fremspring også dukket opp i Cisplatin-behandlede celler sammenlignet med kontrollprøver. Begge A2780 og A2780CP celler viste disse modifikasjonene som indikerer deres progresjon gjennom EMT. For å teste effekten av resveratrol på dette fenomenet, anvendte vi 60 uM, den konsentrasjon ved hvilken snegle nedregulering var det mest tydelig. Tilsetning av resveratrol for å Cisplatin behandling blokkert disse morfologiske endringer som cellene ikke overta noen av de karakteristiske mesenchymale morfologiske egenskaper (figur 6). Det er også interessant å merke seg at resveratrol-behandlede celler ble større og får en uregelmessig utseende tyder på en annen cellulær transformasjon, for eksempel en senescence program, ha oppstått [26].
A2780 (A) og A2780CP (B ) cellelinjer ble behandlet i 72 timer med 2,5 uM cisplatin, med eller uten 60 um resveratrol for å tillate EMT morfologiske endringer for å bli klart. Cisplatin induserte cellulære morfologiske endringer som minner om EMT i A2780-celler tydelig etter 72 timer, som ble avskaffet da resveratrol ble tilsatt til behandling. Resveratrol utøvet den samme virkning på A2780CP celler, selv om de morfologiske endringer indusert av cisplatin var mindre uttalt. Celler ble observert etter 20X forstørrelse, skala bar i øverste venstre hjørne av bildene representerer 20 mikrometer. Pilene viser eksempler på celler som har gjennomgått en EMT. Bilder vist er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Resveratrol induserer senescence
Vi har evaluert senescence induksjon i våre cellelinjer etter Cisplatin og Resveratrol behandling og observert en betydelig økning i Resveratrol-indusert senescence i begge cellelinjer etter 72 timer, med en mer uttalt effekt på A2780-celler (figur 7). Vi har også observert høyere senescence nivåer i A2780 celler behandlet med cisplatin og foreslå at kontinuerlig eksponering for Cisplatin kan indusere en oksidativt stress fører til alderdom i disse Cisplatin-sensitive celler. Senescens induksjon i A2780 og A2780CP celler kan være en annen mekanisme som er involvert ved inhibering av cisplatin-indusert EMT av resveratrol.
Behandling av A2780 og A2780CP celler med resveratrol økt betraktelig andelen av senescent celler. Cisplatin induserte en signifikant økning av senescens i A2780 celler. Celler ble farget for β-galaktosidase-aktivitet og tellet under et lysmikroskop for å bedømme andelen av senescent (blå) celler. I grafer, søyler identifisert med ulike bokstaver er signifikant forskjellige (p 0,05). Analysen ble utført med tre uavhengige eksperimenter.
Resveratrol hemmer cellemigrasjon
Med tanke på morfologisk transformasjon skjer i A2780 og A2780CP celler, ved siden vurderte vi migrasjon evne til disse cellene med en sårheling analysen. Celler ble behandlet med 2,5 uM cisplatin, for å unngå overdreven cytotoksisitet i A2780-celler, og 60 uM resveratrol. I begge cellelinjer, ble 72 timer som kreves for at såret helt tett opp i ubehandlede celler, hvilket antyder at disse cellelinjene ikke har en meget mobil fenotype. Resveratrol behandling tydelig hemmet cellemigrering ved hvert tidspunkt hvor sårheling ble evaluert, noe som reduserer lukking av sår til bare 20 til 25% etter 72 timer for begge cellelinjene, mens kontrollcellene hadde nesten fullstendig lukket sår (figur 8A og 8B). Resveratrol handling ville ikke bli påvirket av Cisplatin i A2780CP cellene der denne agenten utøves samme effekt på celler med eller uten cisplatin.
Den vandrende evne A2780 (A), A2780CP (B), OVCAR-3 ( C), og SKOV-3 (D) celler ble evaluert ved sårheling assay. En ripe ble gjort med en steril spiss i et sammenflytende lag av celler og sårheling ble observert etter 24, 48 og 72 timer av Cisplatin og resveratrol behandling for A2780, A2780CP, og OVCAR-3-celler, og 12 og 24 timer for SKOV -3, svarende til det øyeblikk hvor såret ble nesten helt lukket. I begge cellelinjer, redusert resveratrol migrasjon av cellene i såret, og hindrer dens lukking etter 72 timer. Representative Bildene vises ved t = 48 timer. Grafisk representasjon for sårheling etter de forskjellige tidspunkter ble studert, er vist i (E). Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter utført i duplikater. I grafer, er behandlinger i forhold innenfor hvert tidspunkt studert og kolonner identifisert med ulike bokstaver er signifikant forskjellige (p 0,05).
Videre har vi undersøkt muligheten av Resveratrol å hemme migrering evne OVCAR -3-celler, en epitelisk cellelinje som uttrykker E-cadherin og uten basal ekspresjon av ZEB1 eller vimentin som viser liten migrering potensial, og SKOV-3-celler, en cellelinje som viser mesenchymale basal ekspresjon av vimentin og ZEB1 samt en mesenchymale og morfologi høy migrasjon potensial til tross basal E-cadherin uttrykk (Figur S1). I likhet med A2780 og A2780CP celler, OVCAR-3 celler kreves minst 72 timer for å lukke såret. I denne cellelinje, resveratrol betydelig redusert lukking av såret etter 72 timer og ved hvert tidspunkt undersøkt når det brukes i kombinasjon med Cisplatin. I SKOV-3-celler, ble bare 24 timer er nødvendig for å observere 80-85% lukking av sår og resveratrol betydelig redusert migrering av disse cellene når de brukes alene eller i kombinasjon med cisplatin på dette tidspunkt, noe som indikerer at denne phytoalexin besitter evnen til å redusere migrering av celler som innehar en høy basale migrerings potensial samt celler med lav migrasjon potensiale (figur 8C og 8D). Resultater observert i ovčar-3 og Skov-3 celler korrelerer med de som ble observert i A2780 og A2780CP henholdsvis, der følsomhet for cisplatin er også lik.
For å ta opp muligheten for en økning i invasjonen potensialet i cellene,
