Abstract
Menn som lever i Fiji og drikke kava har lav forekomst av prostatakreft (PCA). Men PCA forekomsten blant fijianske menn som hadde flyttet til Australia, økte med 5,1 ganger. Vi undersøkte derfor de potensielle effektene av kava root ekstrakter og aktive komponenter (kavalactones og flavokawains) på PCa vekst og androgen reseptor (AR) uttrykk. PCA cellelinjer (LNCaP, LAPC-4, 22Rv1, C4-2B, DU145 og PC-3) med forskjellig AR uttrykk, og en transformert prostata myofibroblast cellelinje (WPMY-1), ble behandlet med en kommersiell kava ekstrakt, kavalactones ( kawain, 5’6′-dehydrokawain, yangonin, methysticin) og flavokawain B. Expression of AR og dets mål gener (
PSA Hotell og
TMPRSS2
) ble undersøkt. To nye pasient-avledet PCA-xenograft-modeller fra høy grad av PCA-prøver ble etablert ved implantering av prøvene inn i nakne mus og passerer tumorstykker ved subkutan injeksjon i nakne mus, og deretter behandlet med kava ekstrakt og flavokawain B for å undersøke deres effekt på tumorvekst, AR uttrykk og serum PSA nivåer. Kava ekstrakt og flavokawain B effektivt ned-regulert ekspresjon av både den full-lengde AR og AR spleisevarianter. Kava ekstrakt og kavalactones akselerert AR protein degradering, mens flavokawain B hemmet
AR
mRNA transkripsjon via mink SP1 uttrykk og bindingen av SP1 til AR arrangøren. Kava rot ekstrakt og flavokawain B redusere tumorvekst, AR uttrykk i tumorvev og nivåer av serum PSA i pasient-avledet PCA xenograft modeller. Disse resultatene tyder på en potensiell nytteverdien av et trygt kava produktet eller dets aktive komponenter for forebygging og behandling av avansert PCa ved å målrette AR
Citation. Li X, Liu Z, Xu X, Blair CA, Sun Z, Xie J, et al. (2012) Kava Komponenter nedregulerer Uttrykk for AR og AR Splice Varianter og redusere veksten i Pasient Avledet prostatakreft xenografter i Mus. PLoS ONE 7 (2): e31213. doi: 10,1371 /journal.pone.0031213
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 22 november 2011; Godkjent: 04.01.2012; Publisert: 9. februar 2012 |
Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir CA129793 og CA122558 (https://www.cancer.gov/)and American Institute for Cancer Research gi 41493 (https://www.aicr.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Asia /Pacific menn som spiser en lav fett og plantebasert kosthold har de laveste prisene klinisk PCa i verden [1], [2]. Men når asiatiske menn migrere til USA, priser av klinisk PCa øke [3]. Disse observasjonene implisere både miljøfaktorer og kostvaner (for eksempel forbruk av lav-fett og plantebasert diett) ved PCA utvikling. Derfor er en av strategiene for forebygging og behandling av PCA har fokusert på bruk av naturlige og syntetiske bioaktive mat komponenter.
Kava (
Piper methysticum Forst
) er en flerårig plante innfødt til Stillehavet Islands. Kava rot og rhizome brukes til å forberede en ikke-gjæret og seremonielle drikke med relaxant effekter i Stillehavsøyene for tusenvis av år [4]. Uvanlig lav forekomst av flere kreftformer, blant annet lungekreft og prostatakreft, er rapportert i Pacific Island nasjoner til tross for en høy andel røykere i disse populasjonene [2], [5]. I tillegg Steiner [6] rapporterte at alders-standardiserte kreftforekomst for de tre høyeste kava-drikking land (Vanuatu, Fiji, og Western Samoa) var en fjerdedel eller en tredjedel som av ikke-kava-drikking land, som New Zealand og USA (Hawaii og Los Angeles), og ikke-kava-drikking polynesierne (maoriene). Unikt, i disse tre kava-drikking land flere menn drikke kava og røyk enn kvinner, men det er en lavere forekomst av kreft for menn enn for kvinner [6]. Videre Kreftrådets Kreft i New South Wales (NSW) Migrants 1991-2001 rapport funnet [7] at PCA forekomsten i fijianske menn som innvandret til og var bosatt i NSW, Australia, økte med 5,1 ganger i forhold til de som bor i Fiji . Denne rapporten har bedt oss om å undersøke de potensielle fordelene ved kava ekstrakter og aktive komponenter for PCa forebygging.
Vi rapporterer for første gang at en kommersiell kava ekstrakt og dets aktive komponenter (kavalactones og flavokawain B) ned- regulere AR uttrykk. Nedbryting av AR protein skjedd gjennom to ulike mekanismer: 1) forbedret AR protein degradering, og 2) redusert spesifisitet protein 1 (SP1) -mediert AR transkripsjon. Kava ekstrakt og flavokawain B behandling av mus med pasient avledet xenografter reduserte tumorvekst og uttrykk av AR og dens målgener i tumorvev, og senket serum PSA nivåer.
Metoder
Etikk uttalelse
bruk av mus og deres omsorg for denne studien ble spesielt godkjent av University of California, Irvine Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, protokollnummer 2007-2741).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP, forbindelser og reagenser
LNCaP, LAPC4, 22Rv1, PC3, DU145 og WPMY-1 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA), og C4-2B cellelinjen var fra Urocor Inc. (Oklahoma City, OK). Disse cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS). Alle cellelinjene anvendt i denne studien var i løpet av 20 passeringer etter mottak. Cellelinjene ble testet og godkjent av ATCC eller Urocor Inc. Alle celler linjer ble også testet for kjente arter av mycoplasma forurensning ved hjelp av et kit fra Lonza Inc. (Walkersville, MD). Pure kawain, 5 «, 6»-dehydrokawain, yangonin, methysticin, og flavokawain B (99%) ble isolert fra kava ekstrakter av LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Kava root extract i en konsentrasjon på 150 mg /ml kavalactones i 50% etanol ble hentet fra Gaia Urter (Brevard, NC). Antistoffer mot AR og tubulin var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California). PSA og SP1 antistoffer ble kjøpt fra Thermo Scientific (Fremont, California). 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) var fra Sigma. RNAzol B ble kjøpt fra Tel-Test (Friendswood, TX.). Reverse Transcription System kit og var fra Promega (Mandison, WI). En kvantitativ RT-PCR kit var fra Bio-Rad (Hercules, CA).
Måling av kavalactones og flavokawains i kava rot ekstrakt
kava ekstrakt ble fortynnet 400 ganger av acetonitril, og deretter filtrert med 0,45 um løsemiddelbestandig filtre og lagret ved -80 ° C inntil videre analyse. Kromatografi ble utført på en Acquity Ultra væskekromatografi (UPLC) system (Waters Corp., Milford, MA, USA) med en auto-sampler ved 8 ° C. Separering av forbindelsene ble utført ved 50 ° C ved anvendelse av en Waters Acquity UPLC ®BEH C18 1,7 um (2,1 x 50 mm) kolonne med en gradienteluering: (A) vann: acetonitril: eddiksyre (97.8:2:0.2 vol /vol /v), og (B) Acetonitril:. eddiksyre 99.8:0.2 (v /v) som den mobile fase
elueringen programmet var som følger: 10% B (initial), 90% B (1,0 min), 90% B (2,0 min), 10% B (2,05 min), og 10% (3 min). Strømningshastigheten var 0,3 ml /minutt og injeksjonsvolumet var 10 ul. Den UPLC ble koblet til Micromass Quattro Micro Væske-kromatografi-massespektrometri (LC /MS /MS) trippel kvadrupol massespektrometer (Masseområde: 2~2000 m /z) med elektrospray ionisering (ESI) grensesnitt i positiv modus. Instrumentet ble kjørt i en positiv ion-modus med en ESI spenning på 3,8 kV, og en desolvation gass-strøm på 700 l /time. Argon ble benyttet som en kollisjon indusert dissosiasjon gass ved et trykk på 7,1
e-3 mbar med en valgt reaksjonsovervåknings overgang for flavokawain A fra m /z 315 m /z 181, flavokawain B av 284 181, kawain av 231 115, 5 «, 6»-dehydrokawain av 229 131, mythysticin av 275 159, Yangonin av 259 . 161
MTT-analysen
Celler ble sådd ut i en tetthet på 2 x 10
4 per brønn i 24-brønners kulturplater i 24 timer, og ble deretter behandlet som angitt i figurene. Etter behandling i 72 timer, 1 mg /ml MTT ble tilsatt til hver brønn i 2 timer, og absorbansen ble bestemt ved 570 nm. Dose-responskurver for veksthemming ble generert i prosent av kjøretøybehandlede kontroller.
Western blot analyse
avklart proteinlysatene (20-100 mikrogram) ble denaturert og løst ved 8-16 % SDS-PAGE. Proteiner ble overført til nitrocellulosemembraner, og analysert med angitte antistoffer og visualisert ved en forsterket kjemiluminescens deteksjon system.
Kvantitativ RT-PCR
Sanntids kvantitative PCR forsterkning reaksjoner for
AR
, prostata spesifikt antigen (
PSA
) og transmembran protease, serin 2 (
TMPRSS2
) mRNA-nivåer ble utført ved anvendelse av MyiQ system (Bio-Rad), som beskrevet tidligere [8], [9]. Sekvensene av primere for
AR
,
PSA Hotell og
TMPRSS2
er tilgjengelig på forespørsel. Data ble analysert ved hjelp av sammenlignende Ct-metoden, hvor Ct er syklusen nummeret som fluorescens første overskrider terskelverdien. De Ct-verdier fra hver prøve ble erholdt ved å subtrahere verdiene for beta-aktin Ct fra målgenet Ct verdi. Variasjonen av
beta aktin
Ct-verdiene er 0,5 mellom ulike prøver. En syklus en forskjell av Ct-verdien representerer en 2-ganger forskjell i nivået av mRNA. Spesifisitet av resulterende PCR-produkter ble bekreftet ved å smelte kurver og agarosegel.
Transfeksjon, arrangøren aktivitet og luciferase analysen
PSA-Luc og Plars-Luc plasmider er en vennlig gave fra Dr. Wang Longgui (New York University Cancer Institute). Menneskelig SP1-HA merket plasmid ble vennlig levert av Macus Tien Kuo (The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). C4-2B og LNCaP-celler ble ko-transfektert med PSA-Luc eller Plars-Luc og Renilla luciferase plasmid PGL 4,71 (Promega) eller med Sp1-HA plasmidet ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Etter 48 timer ble flavokawain B tilsatt som indikert med trippel kjøringer. Deretter ble cellene høstet og luciferaseaktivitet ble målt med Dual-Glo Luiferase analysesystem (Promega). Renilla luminescens ble anvendt som en indre kontroll for celletall og transfeksjonseffektiviteten. Den relative forholdet mellom luminescens fra interesserte genet arrangøren til Renilla luminescens ble vist i figurene som promoter aktivitet. For SP1 transfeksjon ble cellene høst for en immunoblotting analysen.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) [10]
LNCaP og C4-2B celler ble tverrbundet av formaldehyd. The protein /DNA-komplekset ble skåret til 500-1500 bp fragmenter av lydbehandling. Like mengder protein (4 mg) ble inkubert med Sp1-antistoff, eller med et mus-anti-GFP-antistoff. Protein G sepharosekuler (Sigma) ble anvendt til å trekke ned komplekset, etterfulgt av vasking med høy saltvaskebuffer, LiCl, og TE-buffer). DNA-protein-immunopresipitatene ble eluert fra kulene og DNA ble ekstrahert og renset. Expand High Fidelity-PCR System (Roche) ble anvendt for å amplifisere sekvensen fra 248 til 487 nukleotider i AR 5′-UTR regionen, inneholdende to SP1 bindingsseter. Primer sekvenser er tilgjengelig på forespørsel.
Behandling av pasient avledet PCA svulst xenograft modeller
prostatektomi vev ble oppnådd gjennom en IRB-godkjent protokoll på UCI Medical Center. Små fragmenter av histologisk utprøvd tumor ble implantert i 8-ukers gamle mannlige Alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus bruker en subrenal xeongraft teknikk [11]. Svulster utpekt som GM0308 og RC0309 3 og 13 murine passasjer henholdsvis ble gjen implantert i subkutane lommer av SCID-mus. En uke senere, når tumorene vokste til omtrent 100 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i behandlingsgrupper. For kava ekstrakt behandling ble musene foret med en standard diett supplert med enten bærer kontroll eller 6 g /kg kava ekstrakt i dietten. For flavokawain B-behandling, ble mus injisert intraperitonealt hver dag med vehikkel-kontroll (10% DMSO, 20% etanol og 70% Cremophor) eller 200 mg flavokawain B /kg musekroppsvekt. Behandlingen ble videreført fra dag 0 til dag 17 for kava ekstrakt og til dag 27 for flavokawain B. Tumorvekst ble overvåket av både serum PSA og skyvelære måling av tumorstørrelse ukentlig. Kroppsvekt og matinntak ble målt under forsøkene. På slutten av forsøkene ble tumorvev veid og halvert for mRNA-isolering og immunhistokjemi flekker, respektivt. Tumorvolumet ble beregnet ved formelen: 0,5236 x L
1 x (L
2)
2, hvor L
en er den lange akse og L
2 er den korte akse svulsten. Serum PSA konsentrasjon ble bestemt av PSA Enzyme-linked immunosorbent assay kit (Bio-Quant, San Diego, California) følgende kit instruksjon.
Immunohistochemistry
Antigen ble hentet inn ved hjelp 0,05 M Glycine-HCL buffer, pH 3,5, inneholdende 0,01% (vekt /volum) EDTA, ved 95 ° C i 20 minutter og farget med anti-humant AR (1:100). Farging ble visualisert med diaminobenzadine hjelp av celler og vev farging kit (R barer, SD. Hver prøve ble tellet i duplikat. IC
50 s ble estimert ved dose-responskurver.
Kava rot ekstrakt og kavalactones redusere uttrykket av PSA og TMPRSS2 gjennom akselerasjon av AR protein degradering
Figur 3A viser at kava ekstrakt og kavalactones (dvs. kawain, 5’6′-dehydrokawain, yangonin, og methysticin) markert ned-regulere mRNA uttrykk for AR målgener (
PSA Hotell og
TMRSS2
), men ikke mRNA uttrykk for AR i C4-2B celler. Figur 3B og C viser at både kava ekstrakt og individuelle kavalactones redusere AR og PSA-protein ekspresjon i tillegg. Den veksthemmende virkning av de kavalactones korrelerte dårlig med deres virkninger på AR-protein nedregulering. C4-2B celler, en androgen-uavhengig LNCaP-derivat, var mer følsomme overfor AR ned regulerende virkning av kavalactones og kava ekstrakt enn det som var LNCaP-celler.
(A). C4-2B celler ble behandlet med 0,1% DMSO, kava rot ekstrakt, dehydrokawain, kawain, yangonin og methysticin i 8 timer. mRNA nivåer av AR og AR målgener (
PSA Hotell og
TMPRSS2
) ble bestemt ved real-time RT-PCR. Barer er midler ± SD av tre uavhengige kvantitative tiltak. Kava rot ekstrakt og kavalactones betydelig redusere mRNA uttrykk for AR målgener (Student
t
test, P 0,01), men ikke av AR (P 0,05). (B) og (C). Proteinet ekspresjon av AR og PSA i LNCaP og C4-2B celler etter behandling indikert ved en konsentrasjon på sin IC
50 s i 16 timer ble analysert ved hjelp av Western blot. a-Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. En representant blot ble vist fra tre uavhengige forsøk. Y = yangonin; M = methysticin; D = 5’6; -dehydrokawain; K = kawain, KRE = kava rot ekstrakt. (D). C4-2B-celler ble forbehandlet med 10 pg /ml cykloheksimid i 2 timer og deretter supplert med kava rot ekstrakt eller 5’6; -dehydrokawain ved en konsentrasjon på deres IC
50 s for forskjellige tidsperioder. Etter behandling, ble AR proteinnivåer analysert ved Western blotting og semi-kvantifisert ved densitometri måling. En representativ blot ble vist fra tre uavhengige eksperimenter.
neste undersøkt stabiliteten av AR-protein ved å behandle cellene med cykloheksimid for å inhibere ny proteinsyntese. Figur 3D viser at AR-protein oppviser en akselerert degradering i C4-2B celler behandlet med enten kava ekstrakt eller 5’6′-dehydrokawain, sammenlignet med dens stabilitet i vehikkelbehandlede celler. På 16 og 24 timer etter behandling, kava ekstrakt og 5’6′-dehydrokawain behandlinger redusere AR protein nivåer med ca 80% og 70%, henholdsvis, mens AR proteinnivået i kjøretøykontroll bare reduseres med ca 20% og 37% henholdsvis (figur 3D).
Flavokawain B nedregulerer ekspresjonen av AR og dens målgener (PSA og TMPRSS2)
Flavokawain B er den mest potente middel for å hemme cellevekst blant undersøkt bioaktive komponenter av kava ekstrakt. Vi undersøkte derfor effekten av flavokawain B på AR uttrykk. Figur 4a viser at flavokawain B betydelig redusere AR protein uttrykk i alle ar uttrykker cellelinjer (LAPC4, C4-2B, WPMY-en, LNCaP og 22Rv1). Interessant nok er det AR proteinnivå i WPMY-1-celler de mest følsomme for flavokawain B-behandling. Siden WPMY-en representerer en transformert prostata myofibroblast linjen [12], antyder dette resultatet at flavokawain B kan være en roman middel for målretting PCa stromal AR. Flavokawain B også redusert protein nivåer av PSA (figur 4A). Figur 4B viser at flavokawain B inhiberer ekspresjonen av AR og PSA-proteiner som induseres av en syntetisk analog androgen, R1881. Forbehandling med en proteasominhibitor, MG132, ikke gjenopprette flavokawain B nedregulert-AR proteinnivå (Figur 4C). I motsetning til kava ekstrakt og kavalactones behandlinger, behandling av LNCaP og C4-2B celler med 5 mikrogram /ml flavokawain B for 4 og 8 timer resulterte i en markert nedgang i mRNA nivåer av
AR Hotell og målet gener
(PSA og TMPRSS2) plakater (Figur 4D). Disse resultater antyder at flavokawain B-mediert AR nedreguleringen er gjennom sin transkripsjonsregulering.
(A) sikret protein ekspresjon av AR og PSA etter behandlingene som er angitt i 16 timer og 5 ug /ml FKB for angitte periode ganger ble analysert ved hjelp av Western blot. a-Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. En representant blot ble vist fra tre uavhengige forsøk. (B) .Western blotting analyse viser at FKB reduserer både konstituerende og en syntetisk androgen, R1881, stimulert AR og PSA uttrykk i LNCaP celle. LNCaP-celler ble dyrket på trekull strippet FBS medium. FKB og R1881 ved indikerte konsentrasjoner behandlede celler i 16 timer. α -Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. En representant blot ble vist fra tre uavhengige forsøk. (C). Proteasominhibitor, MG132, ikke påvirker FKB mediert nedregulering av AR protein uttrykk. LNCaP-celler ble behandlet med MG132 i 2 timer og deretter tilsatt FKB i ytterligere 16 timer. a-Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. En representant blot ble vist fra tre uavhengige forsøk. (D). LnCap og C4-2B celler ble behandlet med 5 pg /ml FKB for 4 og 8 timer. Real-time RT-PCR ble utført for å analysere mRNA uttrykk for AR og AR målgener (
PSA Hotell og
TMPRSS2
). Barer er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. FKB reduserer mRNA uttrykk for AR målgener (Student
t
test, P 0,01) betydelig.
Transkripsjons undertrykkelse av AR ved flavokawain B krever uttrykk for Transkripsjonsfaktor SP1
Vi neste undersøkt potensiell mekanisme flavokawain B mediert AR transkripsjon. SP1 er en antatt Transkripsjonsfaktor for AR regulering. Sp1 bindes direkte til GC-boks i AR-promotoren gjennom en sink-finger-protein-motivet [13], [14]. Derfor ble en promoter AR luciferase reporter som inneholder fire SP1 bindingsseter anvendt for å analysere AR promoteraktivitet i PCA-cellelinjer. Figur 5A viser at flavokawain B-behandlinger markert redusere AR promoteraktivitet i en doseavhengig måte. Nedgangen i AR promoter aktivitet ved flavokawain B var assosiert med en reduksjon av SP1 proteinnivå (figur 5B). Derfor ChIP analyse viste at flavokawain B behandling av C4-2B og LNCaP celler markert hemmet bindingen av SP1 til AR promotorsekvenser (figur 5C). For å undersøke hvorvidt Sp1 er nødvendig for flavokawain B-mediert AR nedreguleringen, ble C4-2B-celler transient transfektert med Sp1 og deretter behandlet med flavokawain B. Figur 5D viser at overekspresjon av Sp1 øket AR proteinnivåer og dempes den flavokawain B-indusert AR nedregulering. Til sammen våre resultater viser tydelig at flavokawain B reduserer SP1 protein uttrykk, noe som fører til AR transkripsjonen nedregulering.
(A) .C4-2B celler ble ko-transfektert med PSA-Luc eller Plars-Luc, sammen med en Renilla luciferase plasmid PGL 4.71 og luciferase aktiviteter ble målt. FKB reduseres betydelig promoter aktivitetene til
AR Hotell og
PSA
gener (Student
t
test, P 0,01). Barer er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. (B) .Western blotting analyse av SP1 protein uttrykk. En representant blot ble vist fra tre uavhengige forsøk. α -Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. (C). ChIP analyse av bindingen av Sp1 til AR-promotersekvensen åpenbarer at 16 timer FKB behandlingen resulterer i en signifikant reduksjon i bindingen av Sp1 til AR promotorsekvens som inneholder to SP1 bindingsseter. Mus IgG ble anvendt som en blank kontroll. (D). Overekspresjon av SP1 i C4-2B celler demper FKB indusert AR protein nedregulering. Etter 48 timers Sp1-HA plasmid transfeksjon ble cellene behandlet med C4-2B FKB i 16 timer. SP1 og AR proteinnivåer ble undersøkt. En representant blot ble vist fra tre uavhengige forsøk. α -Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll.
kavalactones og flavokawain B kombinasjonen resulterer i en forbedret hemmende effekt på veksten av C4-2B celler og på uttrykk for AR protein
Figur 6A og B viser at 7,5 ug /ml yangonin og 1 ug /ml flavokawain B alene hemmet veksten av C4-2B celler med 15% og 20%, henholdsvis, mens kombinasjonen reduserte veksten av mer enn 70%. På samme måte, 5’6′-dehydrokawain i en dose på 7,5 ug /ml reduserte veksten av C4-2B celler med mindre enn 5%, mens dens kombinasjon med 1 ug /ml flavokwain B hemmet veksten av ca 60%. I samsvar med dette resultatet, flavokawain B i kombinasjon med andre kavalactones (dvs. kawain og methysticin) resulterte også i en synergistisk inhiberende virkning på veksten av C4-2B celler (figur 6C og D). Videre er kombinasjonen av 5’6′-dehydrokawain eller yagonin med flavokawain B-behandlinger resulterte i en forbedret nedregulering av AR-protein-ekspresjon i både C4-2B og 22Rv1 celler (figur 6 E og F). Spesielt, havner 22Rv1 en AR skjøte variant med en molekylvekt på omtrent 80 KD [15]. Flavokawain B og 5’6′-dehydrokawain er mer effektive i å redusere ekspresjonen av AR spleisevariant enn den for AR full lengde (figur 6F). Disse resultatene indikerer at kavalactones og flavokawain B virke synergistisk eller additivt for å hemme veksten av PCA-celler og for å ned-regulere protein ekspresjon av AR og AR spleisevariant.
vekstinhibitoriske av FKB og yagonin (A), eller 5’6; -dehydrokawain (B), eller kawain (C), eller methysticin (D) alene og i kombinasjon på C4-2B celler. Hvert punkt er gjennomsnittet av fire uavhengige eksperimenter; barer, SD. Hver prøve ble tellet i duplikat. IC
50 s ble estimert ved dose-responskurver, IC
50 s av kombinasjonene er betydelig lavere enn de av behandlingene alene (Student
t
test, P 0,01). (E) og (F) Western blotting-analyse av ekspresjon av full-lengde AR (110 kDa), henholdsvis AR spleisevariant (83 kd) og PSA i C4-2B og 22Rv1 celler. En representant blot ble vist fra tre uavhengige forsøk. α -Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll.
Kava ekstrakt og flavokawain B redusere veksten av pasient avledet PCA transplantater i SCID-mus, AR uttrykk i tumorvev og serum PSA nivå
for å bestemme
in vivo
anti-PCA effekten av kava ekstrakt og flavokawain B, utviklet vi to mer klinisk relevante, pasient avledet PCA xenograft modeller, GM0308 og RC0309. Den GM0308 pasient avledet PCa xengrafts linjen ble avledet fra et høyverdig (Gleason score sum = 5 + 5) PCA prostatektomi prøven hentet fra en pasient som tidligere var behandlet med androgen deprivasjon (ADT), docetaxel pluss karboplatin og etoposid pluss cisplatin. Xenograft tumorvekst ble opprinnelig etablert ved hjelp av en subrenal xenograft teknikk, og deretter ført gjennom subkutan injeksjon av tumor stykker. Den RC0309 linjen ble avledet fra et høyverdig (Gleason score sum = 5 + 4) PCa prostatektomi prøven hentet fra en pasient som hadde ingen tidligere behandling. Disse humane kreft xenografter trofast bevare histopatologiske egenskapene til den opprinnelige kliniske prøven. Begge linjene skille ut PSA inn i vertsmuseserum (figur 6A). Den GM0308 linjen uttrykker en avkortet AR rundt 80 kDa, uten missense mutasjoner i exon 3, 4, eller 5 (data ikke vist). I motsetning til dette innehar RC0309 den fulle lengde AR (data ikke vist).
Mus som bærer GM0308 tumorer ved passasje 3 ble behandlet med bærerkontrollgruppen, eller 200 mg /kg flavokawain B daglig ved intraperitoneal injeksjon i 28 dager. Figur 6A viser en progressiv svulst xenograft vekst og serum PSA stigning gjennom hele studiet i bilen kontrollgruppen. Den flavokawain B behandling, men resulterte i en redusert rate av tumorvekst sammenlignet med kontrollgruppen gjennom hele studien (figur 7A). De våte tumor vekter eller serum PSA i kontroll og flavokawain B-behandlede gruppen registrert på slutten av behandlingen er henholdsvis 0,43 ± 0,27 g og 0,097 ± 0,048 g, eller 66,6 ± 12,8 ng /ml og 18,4 ± 4,8 ng /ml, ( gjennomsnitt ± SD, n = 13 for kontroll og n = 6 for FKB behandlingsgrupper; P 0,001, Student t-test). Flavokawain B behandling dempes tumorvekst med 77,3%, og reduserte serum PSA nivå med 68% ved slutten av behandlingen.
(A) og (B). De mus som bærer pasientavledet PCA tumorer ble tilfeldig oppdelt i behandlings- og kontrollgrupper med lignende før behandling serum PSA-nivå i hver gruppe. Tumorvolumer og serum PSA ble registrert, og presentert som gjennomsnitt ± SD. Våtvekt av tumorer er representert som gjennomsnittet av svulster fra individuelle mus i hver gruppe. Barer, betyr ± SD. Tumorvolum (gjentatt tiltak variansanalyse (ANOVA), p 0,01) og tumor vekter (Student
t
test, P 0,01) av FKB og KRE behandlede mus var betydelig lavere enn de av kjøretøy kontroll behandlede mus. (C). Immunohistologi farging av AR uttrykk i tumorvev. Kontroll farging ble utført med IgG isotype alene; Lysbilder ble kontra med hematoksylin og fotografert ved hjelp av et lysmikroskop. Original forstørrelse: × 200. (D). AR positive celler ble talt i 12 felt i hver gruppe. Prosentandelen av AR positive celler ble beregnet og presentert som gjennomsnitt ± SD (til venstre to paneler). De mRNA nivåer av
AR
,
PSA Hotell og
TMPRSS2
i tumorvev behandlet med kjøretøy eller FKB ble analysert ved RT real-time PCR (høyre panel). Barer, betyr ± SD. Prosentene av AR positive celler er betydelig lavere i KRE og FKB behandlet grupper enn de i kjøretøykontroll behandlet grupper (Student
t
test, P 0,01). De mRNA nivåer av
AR
,
PSA Hotell og
TMPRSS2
er lavere i KRE og FKB behandlet grupper enn de i kontrollgruppene (Student
t
test, P . 0,01)
Mus som bærer RC0309 svulster ved passering 13 ble fôret med mat supplert med kjøretøy kontroll eller 6 g /kg kava ekstrakt i 18 dager. Tilsvarende kava rot ekstrakter resulterte i en signifikant reduksjon i vekst av tumorer sammenlignet med bærerkontroll (figur 7B, ANOVA, P 0,01). De våte tumorvekt var 1,83 ± 0,79 g i kontrollgruppen og 0,73 ± 0,34 g i kava rotekstrakt gruppe (figur 7B; n = 5, middelverdi ± SD; p 0,05, Student t-test). Kava Ekstraktet dempes tumorvekst ved ca. 60,1%, og reduserte serum PSA-nivå på 42% ved slutten av behandlingen.
Immunhistokjemisk analyse viser at tumorsnitt fra kava ekstrakt eller flavokawain B behandlet PCA xenotransplantater viste en (B). (C).
