Abstract
En nylig oppdaget gammaretrovirus, kalt XMRV, ble nylig rapportert å være til stede i prostatakreft cellelinje CWR22Rv1. Ved hjelp av en kombinasjon av både immunhistokjemi med bredt-reaktivt murine leukemi virus (MLV) anti-sera og PCR, bestemt vi om ekstra prostata kreft eller andre cellelinjer inneholde XMRV eller MLV-relaterte virus. Vår studie inkluderte totalt 72 cellelinjer, som omfattet 58 av de 60 humane kreftcellelinjer som brukes i kreft narkotika-skjermer og vedlikeholdes på NCI-Frederick (NCI-60). Vi har identifisert gammaretroviruses i to ekstra prostatakreftcellelinjer: LAPC4 og Vcap, og viser at disse virusene er replikering kompetente. Viral genomsekvensering identifisert viruset i LAPC4 og Vcap som nesten identisk med en annen kjent xenotropisk MLV,
BXV
-1. Vi identifiserte også en gammaretrovirus i den ikke-små-celle lunge karsinom cellelinje EKVX. Prostata kreft cellelinjer synes å ha en tilbøyelighet for infeksjon med murine gammaretroviruses, og vi foreslår at dette kan være delvis på grunn av cellelinje etablering av xenograft passasje hos immunsupprimerte mus. Det er uklart om infeksjon med disse virusene er nødvendig for cellelinje etablering, eller hva confounding rolle de kan spille i eksperimenter utført med disse brukte linjer. Viktigere, tyder våre resultater behov for regelmessig screening av kreft cellelinjer for retroviral «forurensning», omtrent som rutine mycoplasma testing
Citation. Sfanos KS, Aloia AL, Hicks JL, Esopi DM, Steranka JP, Shao W, et al. (2011) Identifisering av replikasjonskompetente Murine Gammaretroviruses i ofte brukte Prostate Cancer Cell Lines. PLoS ONE seks (6): e20874. doi: 10,1371 /journal.pone.0020874
Redaktør: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Frankrike
mottatt: 24 februar 2011; Godkjent: 11 mai 2011; Publisert: 17 juni 2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. K.S.S. ble støttet av en postdoktorstilling pris fra Prevent Cancer Foundation. Denne forskningen ble støttet delvis av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. IHC studier ble støttet av NCI-SPORE i prostatakreft P50CA58236. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
xenotropisk Murine leukemi virus-Related virus (XMRV) ble først rapportert i 2006 som en roman gammaretrovirus funnet i prostata vev fra pasienter med prostatakreft [1]. Senere studier ikke klarte å komme til enighet om utbredelsen av viruset i prostatakreft, med rapporterte tall som varierer fra 0% til ca 27% (anmeldt i [2], [3]). I 2009 ble det rapportert at den brukte prostatakreft cellelinje CWR22Rv1 inneholder replikering kompetente XMRV, og produserer viruset på et høyt nivå i kultur [4].
Det er foreløpig ikke kjent nøyaktig hvordan CWR22Rv1 cellelinje ble smittet med XMRV. En forklaring er at viruset var i prostata svulst fra hvilken cellelinjen ble etablert. Hvis bevist, vil denne oppdagelsen støtter argumentet om at XMRV er tilstede hos mennesker, og kan etablere en infeksjon i den menneskelige prostata. En annen forklaring kan være at cellelinjen ble infisert etter at cellene ble fjernet fra pasienten, for eksempel under xenotransplantasjon inn i immunkompromitterte mus (en vanlig og ofte nødvendig praksis ved etablering av prostatakreft-cellelinjer). Faktisk, nyere data presentert av Pathak
et. al.
på 17
th Conference on Retrovirus og opportunistiske infeksjoner (Croi) gir et overbevisende argument at XMRV sannsynlig stammer fra rekombinasjon mellom to separate og defekte endogene MLV som infiserte de CWR22 humane kreftceller på et tidspunkt i løpet av fremgangsmåte ifølge seriell passasje av cellene ved xenograft (se [5] for gjennomgang). Denne xenograft ble senere brukt til å produsere en cellelinje, CWR22Rv1, som er dyrket i mange laboratorier over hele verden som studerer prostatakreft. Rapporter om infeksjon av humane cellelinjer med animalske retrovirus er ganske vanlig i litteraturen [6], [7], [8], (oversikt i [9]), og det er godt dokumentert for å forekomme etter xenotransplantasjon av celler og vev hos immunkompromitterte mus (anmeldt i [10]). Det er også rapportert om retroviral infeksjon av cellelinjer som klart oppstått under passasje i kultur, som linjene aldri ble passert i mus [9], [11]. Andre potensielle kilder til cellelinjen infeksjon med retroviruser omfatte laboratorie forurensning og bruk av retrovirale vektorer i forskning [9]. Viktigere er det bare sjelden eksempler hvor retrovirale nærvær i dyrkede humane celler kan spores tilbake til en sann infeksjon hos pasienten. En veletablert eksempel på dette er oppdagelsen av menneskelig T-lymfotropt virus type 1 (HTLV-1) i dyrkede celler fra pasienter med T-cellelymfom [12].
Oppdagelsen av XMRV i CWR22Rv1 cellelinje bedt oss om å avhøre flere prostatakreft cellelinjer for tilstedeværelsen av XMRV eller andre mus gammaretroviruses. Dersom kilden til retroviral infeksjon er ikke fra prostata kreftpasient, men innført ved passering gjennom dyr eller laboratorieforurensning, da tilstedeværelse av replikering kompetente retrovirus i vanlig brukte prostata kreft cellelinjer for forskning potensielt kan ha konfunderende effekter på eksperimentelle resultater.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Kilde av cellelinjer og beskrivelse av cellelinje vev microarray (TMA) bygging er gitt i tekst S1. Alle cellelinjene som ble brukt var autentisert via kort tandem repeat (STR) profilering av 9 genomisk loci med Powerplex 1.2 system (Promega) før inkludering i TMA.
XMRV /MLV Immunohistochemistry (IHC)
Lysbilder som inneholder deler av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) kontrollceller eller TMA ble deparaffinized og dampet i 25 min. i citrate-baserte avsløring løsning for antigen gjenfinning (Vector Laboratories). IHC (inkludert positive og negative kontroller) med enten anti-p30 (MLV30) eller anti-gp70 (MLV70) sera ble utført som tidligere beskrevet [3].
XMRV og MLV PCR
Genomisk DNA (gDNA) ble utvunnet fra dyrkede celle pellets fra hver av cellelinjene anvendt i TMA ved hjelp av DNeasy blod og vev Kit (Qiagen). All DNA ble først amplifisert med genomiske GAPDH PCR-primere (GAPgen-F 5′-GGGCTCTCCAGAACATCATCC-3 «og GAPgen-R 5′-GTCCACCACTGACACGTTGG-3′) for å kontrollere kvaliteten av DNA-templat. MLV-spesifikk primer (In-For) samt XMRV-spesifikke revers primer (slette-Rev) var som tidligere beskrevet [13] med en forventet produkt størrelse på 104 bp. Den degenererte Pan-MLV-primer-sekvenser var som følger: Pan-MLV-F 5»-GCARCCCWGGGAGACGTC-3 «og Pan-MLV-R 5′-AGACRCGCRGCGCGGYT-3» med en forventet produkt størrelse på omtrent 206 bp (181 bp for XMRV ). PCR ble utført i et totalvolum på 25 ul (som inneholdt 1 x PCR-buffer, 1,5 mM MgCl
2, 200 uM dNTP, 400 nM F og R primer, 1U AmpliTaq Gold, Applied Biosystems) under anvendelse av ca. 100 ng av gDNA for maler og de følgende parametre: sykling 95 ° C i 2 min .; 40 sykluser av 95 ° C i 30 sek., 54 ° C i 1 min. (Pan-MLV-primere) eller 64 ° C i 30 sek. (XMRV-spesifikke primere), 72 ° C i 30 sek .; endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. Seriefortynning tester av CWR22Rv1 gDNA indikerte at den degenererte Pan-MLV PCR-analyse hadde en sensitivitet av påvisning av virus i ned til 0,1 ng av CWR22Rv1 gDNA (tilsvarende ~100-200 virale genomer eller ~10-20 infiserte celler [3], [ ,,,0],4]) og den XMRV-spesifikke PCR-analysen var i stand til å påvise ned til 1-2 virale genomer (figur S1). Forskjellen i følsomhet kan sannsynligvis forklares delvis ved bruk av degenererte primere for Pan-MLV PCR.
Long-range PCR og sekvensering av Viral genomer
Full-lengde eller i nærheten av full- lengde virale genomer ble forsterket fra genomisk DNA preparater av LAPC4, Vcap og EKVX cellelinjer og sekvensert som beskrevet i tekst S1 og Tabell S2.
fylogenetisk analyse
Full-lengde genomer fra kjente endogene MLV sekvenser [14] og virus genomer isolert fra LAPC4, Vcap og EKVX ble justert ved hjelp ClustalW. Basert på justeringen, var en nabo-sammenføyning treet generert ved hjelp av standardinnstillingene for MEGA versjon 5 (MEGA 5) [15].
Infeksjons analysen
Cell linje supernatanter ble samlet etter 24 timer . kultur og filtrert gjennom et 0,45 um filter. Smittsomhet analysen bruker iGLuc-Derse celler, en 293 MCAT basert cellelinje som produserer
Gaussia
Luciferase (Gluc) enzymet bare etter infeksjon med en replikering-kompetent MLV. iGLuc-Derse-celler ble sådd ut på 3,5 x 10∧4 celler /brønn i en 12-brønns plate. Celler ble behandlet med 20 ug /ml DEAE-dekstran i 30 min. DEAE-dekstran ble deretter fjernet og cellene ble vasket med medium. Deretter ble 500 ul av hver supernatant tilsatt til iGLuc-Derse celler i tre eksemplarer. Celler ble inkubert i 3 timer. og 400 mL av ekstra minnekort ble lagt. To og tre dager etter infeksjon, ble 10 mL av mediet fra hver brønn ble analysert for luciferase-aktivitet. Ved 3 dager etter infeksjon, ble cellene passaged. To dager etter celle passasje, ble luciferase aktivitet målt igjen. Celler ble passert i totalt 13 dager. Ytterligere detaljer om cellelinje vil bli gitt i en senere publikasjon.
Vectorette PCR
Vectorette PCR ble utført som tidligere beskrevet [16]. Kort, 2 ug av genomisk DNA ble fordøyd over natten på riktig temperatur med følgende restriksjonsenzymer:
Åse
jeg,
BspH
jeg,
BstY
jeg,
Hind
III,
Nco
jeg, og
Pst
I. Vectorette oligos ble deretter varmebehandlet over natten ved 4 ° C ved en konsentrasjon på 1 um ved å bruke T4 DNA-ligase (New England Biolabs). Vectorette PCR ble utført ved bruk av en virus-spesifikke forover primer (enten Virus-vec-F1 5′-GACTGAGTCGCCCGGGTACC-3 «, eller virus-vec-F2 5′-CGCTTCTCGCTTCTGTAACCGCG-3», begge i 3 «LTR i nukleotid-posisjon 8525 og 8437 av Xmv43, henholdsvis) og en vectorette-spesifikke revers primer (5»-CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA-3 «). PCR-produktene ble gelrenset og klonet inn i pCR®2.1-TOPO vektor (Invitrogen). Transformbakteriekolonier ble valgt tilfeldig for sekvensering.
Resultater
LAPC4 er Vcap og EKVX kreftcellelinjer infisert med en murine leukemi virus som ikke XMRV
Som en første skjermbildet for murine gammaretroviruses i humane cellelinjer, benyttet vi en vev microarray (TMA) som inneholder totalt 72 cellelinjer, som omfattet 58 av de 60 humane kreftcellelinjer som brukes i kreft narkotika-skjermer og vedlikeholdes på NCI-Frederick (NCI -60) (tabell S1). Som vist i figur 1A, IHC med bredt reaktivt antisera for Moloney murin leukemivirus (Mo-MLV) p30
CA (MLV30) eller gp70
SU (MLV70) [3] identifiserte tre prostatakreft-cellelinjer (CWR22Rv1, LAPC4 [17], Vcap [18]) som positivt for viruset. Mens CWR22Rv1 ble tidligere rapportert å være smittet med replikering kompetente XMRV [4], er LAPC4 og Vcap ikke kjent for å inneholde retrovirus. Interessant, i en tidligere studie, cellekultur media fra Vcap ble anekdotisk rapportert å vise viral aktivitet [4]. Vi identifiserte også en ikke-småcellet lungekarsinom cellelinje, EKVX, som positivt for viruset.
(A) Eksempler på MLV-negative (DU145) og positive (CWR22Rv1, LAPC4, Vcap og EKVX) kreft cellelinjer farget med MLV30 og MLV70 sera. (B) Positive flekker i LAPC4, Vcap og EKVX representerer ikke XMRV. Lanes 1-7, PCR med MLV-spesifikke primere (1 = CWR22Rv1, 2 = LAPC4, 3 = Vcap, 4 = DU145, 5 = LNCaP, 6 = PC3, 7 = EKVX), Lanes 8-11, PCR med XMRV- spesifikke primere (8 = CWR22Rv1, 9 = LAPC4, 10 = Vcap, 11 = EKVX). Forskjell i produktstørrelse mellom CWR22Rv1 (kolonne 1) og LAPC4, Vcap eller EKVX (baner 2,3,7) er på grunn av XMRV-spesifikke 24-nt sletting [13]. L = molekylvekt stige.
neste brukte en PCR-basert analyse for å fastslå om LAPC4, Vcap og EKVX er infisert med XMRV. Som vist i figur 1B, PCR med degenererte pan-MLV-primere (som skal bredt forsterke MLV arter) identifisert en positiv produkt som forventet for CWR22Rv1, LAPC4, VCap og EKVX. Også som forventet basert på IHC resultater, PCR med degenererte MLV primere var negativ for prostatakreft cellelinjer DU145, LNCaP og PC3. PCR med primere som spenner over en 24 nukleotid delesjon som finnes i genomet til XMRV, men ikke i noen andre kjente MLV [13] bare var positive for CWR22Rv1 (figur 1B), noe som indikerer at viruset (e) som er tilstede i de gjenværende cellelinjer som var positive med IHC er ikke XMRV. De fullstendige resultater av IHC og PCR på 72 cellelinjene er vist i tabell S1. For å kontrollere for den mulighet at positive PCR-resultater kan ha vært grunnet mus DNA-kontaminering, testet vi alle positive cellelinjer med et PCR-analyse for mus intracisternal En partikkel (IAP) som tidligere beskrevet [19]. Som vist i fig S2, ble ingen av de cellelinjer funnet å være positive for kontaminerende mus DNA. IAP analysen har tidligere vist seg å være meget følsom for mus-DNA, og å ut-utføre PCR-baserte analyser for mus mitokondrie DNA (mtDNA) [19].
viral genomsekvense, fylogenetisk analyse og integreringssete kartlegging
for å kunne fastslå identiteten til de virusene som finnes i LAPC4, Vcap og EKVX, vi utførte langtrekkende PCR og sekvensering som beskrevet i teksten S1. Et 8046 nukleotid-sekvensen (GenBank Accession # JF908817) erholdt fra EKVX gruppert med en xenotropisk MLV gruppe i fylogenetisk analyse, men var ikke identiske med noen MLV som full-lengde genomiske sekvensen er kjent (figur 2, figur Hjelpemiddel S3). Denne sekvensen ble også bestemt i NCBI BLAST søk i databaser for å være 98% lik en retrovirus tidligere isolert fra DG-75 B-lymfoblastoid cellelinje [20], og identisk med delvis
pol Hotell og
env
sekvenser isolert fra EKVX i en annen fersk undersøkelse [8].
fylogenetisk tre representerer kjent xenotropisk MLV sekvenser. Dette treet representerer kun xenotropisk MLV hvor den fulle provirale sekvens er kjent, noe som sannsynligvis bare en liten del av alle endogene xenotropisk MLV som er tilstede i mus.
For LAPC4 og VCap, vectorette PCR ble utført for å bestemme viral integrering områder og den 5 «og 3» ender av virale genomer. Nesten identiske (99% lignende) viral genom 8,657 nukleotider i lengde (GenBank Tiltredelse # JF908815, JF908816) ble sekvensert fra LAPC4 og Vcap cellelinjer. NCBI BLAST og Ensembl databasesøk viste en nesten perfekt match (99%) med en sekvens som finnes på kromosom en av C57BL /6J mus genomsekvensen (nukleotid posisjon 172871652-172880308). Denne plasseringen er tilordnet en kjent muse xenotropisk gammaretroviral provirus betegnes
BXV
-1 (eller XMV43) [21]. Fylogenetisk analyse viser også at LAPC4 og Vcap virus er fylogenetisk identisk med
BXV
-1 (figur 2, Støtte Figur S3).
BXV
-1 er et intakt og smittsom provirus og, selv om det vanligvis brukes prostatakreftcellelinjer ikke er kjent for å være forurenset med dette viruset,
BXV
-1 er kjent for å være i stand til å infisere tumorceller passert gjennom svekket immunforsvar mus [22]. Vi testet Vcap cellelinje direkte fra ATCC og bekreftet at det distribuerte Vcap er positivt for viruset. For å bekrefte at infeksjonen av LAPC4 celler representerer en infeksjon som var til stede i begynnelsen passasje LAPC4 (i motsetning til forurensning fra vårt laboratorium), fikk vi LAPC4 celler frosset ned i 1998 samt celler for tiden dyrket i laboratoriet (dvs. fra 2010 ) fra CL Sawyers lab ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center [17]. Som vist i Figur S4, alle LAPC4 celler testet fra Sawyers lab var positive for viruset.
For å ytterligere bekrefte at LAPC4 og Vcap cellelinjer er infisert med integrert
BXV
-1 provirus, vi kartlagt flere viral integrering områder i hver av disse to linjer ved hjelp vectorette PCR [16]. Interessant nok ble viral integrering områder identifisert i intronic regioner av multiple gener i både LAPC4 og VCap (tabell 1). Ingen felles integrasjons områder ble identifisert mellom de to cellelinjer; Men vi forventer at listen over integrerings områder gitt i tabell 1 er ikke uttømmende. Velg integrasjonssider ble ytterligere bekreftet fra LAPC4 og Vcap bruker langtrekkende PCR og primere som strakte integrerings områder (tabell 1).
Infected kreftcellelinjer produsere replikasjonskompetente virus
For å bekrefte at de oftest brukte prostatakreftcellelinjer LAPC4 og Vcap inneholder integrert og replikering-kompetent virus, vi utførte en viral smittsomhet analysen. Indikatoren cellelinje, iGLuc-Derse celler, vil bare gjemme
Gaussia
luciferase enzymet etter infeksjon med et replikasjonskompetente MLV.
Gaussia
luciferase aktivitet ble registrert 48 timer etter infeksjon av iGLuc-Derse celler med supernatant fra CWR22Rv1, LAPC4 og Vcap cellelinjer (figur 3). Interessant, gjorde en tre eksemplarer infeksjon av iGLuc-Derse celler med supernatant fra EKVX cellelinjen ikke viser
Gaussia
luciferase aktivitet inntil 13 dager (og 3 passasjer) etter infeksjon (figur 3). Videre er bare to av de 3 infeksjoner viste luciferaseaktivitet over bakgrunnen. Således, viruset fra EKVX celler tilsynelatende har meget lav smittsomhet, i det minste for den iGLuc-Derse cellelinje. Nei
Gaussia
luciferaseaktivitet ble detektert fra celler (passaged for totalt 13 dager) utsatt for supernatant fra DU145, MycCaP (en mus prostatakreft-cellelinje oppnådd fra CL Sawyers lab) eller PC3 cellelinjer ( figur 3). CWR22Rv1 ble tidligere rapportert å produsere replikering kompetente XMRV [4], men det har ikke blitt rapportert at LAPC4, Vcap og EKVX produsere replikasjonskompetente virus.
10 mL av media ble analysert 2 dager etter eksponering for 24 timer. cellekultursupernatant fra CWR22Rv1, LAPC4 og VCap, og 13 dager (og 3 passeringer) etter eksponering for supernatant fra EKVX, DU145, MycCaP (murin prostatakreft-cellelinje) og PC3. Rød linje angir bakgrunn luciferaseekspresjon som bestemmes av en mock-infiserte kontroll. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet for 3 forsøk.
Ut av bekymring for at prostatakreft cellelinjer som produserer replikering kompetente virus kunne krysse-forurense andre cellelinjer i vårt laboratorium som er negativ for MLV, vi testet aktuelle kulturer i vårt laboratorium for tilstedeværelsen av MLV. Vi ble overrasket over å finne to tilfeller der MLV-negative cellelinjer opprettholdes i laboratoriet (DU145, LNCaP) har blitt forurenset med MLV (figur S5). For eksempel, når disse cellelinjer ble oppnådd direkte fra ATCC (LNCaP) eller NCI (DU145) de var negative for virus, noe som indikerer at linjene var forurenset på et tidspunkt under kultur i laboratoriet. PCR-analyse med XMRV-spesifikke primere indikerte at kontaminerende virus var sannsynligvis XMRV, eventuelt fra kultur sammen CWR22Rv1 (data ikke vist). Disse resultater antyder at dersom CWR22Rv1 celler blir rutinemessig dyrket i en typisk biomedisinsk forskning laboratorieoppstilling (f.eks ved bruk av standard klasse II biologisk skap og fremgangsmåter for cellekultur hvor to forskjellige cellelinjer er aldri til stede under panseret på samme tid), at XMRV kan infisere og forurense andre cellelinjer. Vår studie
Diskusjoner
viser at prostatakreft cellelinjer synes å ha en tilbøyelighet for smitte av murine gammaretroviruses. Vi foreslår at denne tendensen kan skyldes det faktum at de fleste av de etablerte prostatakreftcellelinjer ble skapt ved passasje gjennom immunkompromitterte mus. Faktisk,
BXV
-1 er til stede i SCID og
nakne
mus og tumorceller passert gjennom disse dyrene kan bli infisert med xenotropisk MLVs [22]. Selv om infeksjon av humane cellelinjer med murine gammaretroviruses er tidligere blitt beskrevet i litteraturen, hva som gjør vår nåværende studium spesielt viktig er at før denne studien var det ikke kjent at multiple vanligvis brukes prostatakreftcellelinjer er forurenset med MLV. Faktisk, vi oppdaget i løpet av vår studie at andre cellelinjer opprettholdes i laboratoriet (DU145, LNCaP) har tilsynelatende blitt infisert med XMRV i laboratoriet.
I samsvar med dataene i denne studien i en fersk undersøkelse utført av Hue
et. al.
, som vist 411 humane tumorcellelinjer fra Felleskatalogen av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) samling, EKVX ble funnet å være positivt for en xenotropisk MLV-relaterte virus ved direkte sekvensering av virus
gag
,
pol Hotell og
env
gener [8]. Videre Hue
et. al.
studien testet alle, men 14 av de cellelinjer undersøkt i denne studien (med unntak av LAPC4, LNCaP, prec, Vcap, CWR22Rv1, RWPE, abl, PRSC, C4-2B, 957 E /t, PacMet UT1, MDA-PAC2b, DLD-en og Hep3B) og likeledes funnet dem til å være negativ for MLV. Selv om forfatterne av studien ikke forsøke å skaffe en full-lengde sekvens av viruset forurensende EKVX eller for å demonstrere at viruset er replikering kompetent, delvis
pol Hotell og
env
sekvenser fra Hue
et. al.
studie (GenBank Tiltredelse # FR670589 og FR670597, henholdsvis) kamp på 100% likhet med nær full-lengde viral sekvens oppnådd i denne studien (GenBank tiltredelse # JF908817). Vi har nå vist at viruset inneholdes i EKVX cellelinjen er replikasjonskompetente (figur 3), klynger i fylogenetisk analyse med kjente xenotropisk MLV (figur 2, Støtte fig S3), og er 99% lik en retrovirus som tidligere isolert fra DG -75 B-lymfoblastoid-cellelinje. Som alle av prostata kreft cellelinjer funnet å inneholde MLVs i denne studien, den EKVX cellelinje ble etablert av xenograft passasje i
nakne
mus [23].
Det er flere rapporterte eksempler av retroviral infeksjon modifisere de biologiske egenskaper av humane cellelinjer. For eksempel,
in vivo
immunogenisiteten av cellelinjer er blitt vist å være sterkt endret ved retroviral infeksjon etter en enkelt passasje i
nakne mus
[24]. Likeledes xenotropisk MLV kjøpt i cellelinjer som brukes i HIV-forskning etter
in vivo
passasje hos immunsupprimerte mus ble vist å påvirke de biologiske egenskapene til HIV-1 [25]. Studier har også vist at MLV tendens til å integrere i nærheten transkripsjon start steder (innen 5 kb oppstrøms eller nedstrøms) av aktivt transkriberte gener [26]. Interessant, to av de sju virusintegrasjons identifisert for Vcap er innenfor 5 kb av en transkripsjon start hotellet (tabell 1). En integrering området ligger på kromosom 1 ligger ca 2 kb nedstrøms transkripsjon start stedet av EFCAB2 (EF-hånd kalsium bindende domene 2) genet. Likeledes er en integrasjon nettstedet identifisert på kromosom 7 ligger ca 1,4 kb oppstrøms LFNG (O-fucosylpeptide 3-beta-N-acetylglucosaminyltransferase), et gen som er involvert i Notch signalering. Det er ikke kjent hva konfunderende effekter infeksjon av brukte prostata kreft cellelinjer med replikering kompetente murine gammaretroviruses kan ha på eksperimentelle resultater. Interessant nok har det blitt rapportert at XMRV proteiner er mer tallrike i cellekulturmedier av CWR22Rv1 celler enn en hvilken som helst humant protein [4]. Av grunner som dette, foreslår vi at kreftcellelinjer bør gjennomgå rutinemessig screening for forurensende MLV, omtrent som dagens praksis med rutinemessig testing av dyrkede celler for mycoplasma.
Hjelpemiddel Informasjon
Tekst S1.
Støtte metoder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s001 plakater (DOC)
Figur S1.
Bestemme følsomheten av Pan-MLV og XMRV-spesifikk PCR-analyser. Serielle fortynninger av CWR22Rv1 genomisk DNA ble tilsatt til 100 ng av LNCaP (MLV-negativ) genomisk DNA og anvendt som et templat for PCR. (A) Pan-MLV primere (B) XMRV-spesifikke primere. Prøvene ble testet i duplikat: 1 ng CWR22Rv1 (felt 1-2), 0,1 ng CWR22Rv1 (felt 3-4), 0,01 ng CWR22Rv1 (felt 5-6), 0,001 ng CWR22Rv1 (felt 7-8), negativ kontroll (spor 9-10). . L = molekylvekt stige
doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s002 plakater (TIF)
Figur S2.
Testing MLV-positive cellelinjer for tilstedeværelsen av forurensende mus-DNA ved hjelp av PCR-analyse for IAP. Lane 1 = C57BL /6J mus genomisk DNA (positiv kontroll), lane 2 = CWR22Rv1, spor 3 = LAPC4, kjørefelt 4 = Vcap, spor 5 = EKVX, spor 6 = negativ kontroll. Alle cellelinjene som ble testet, var negative for kontaminerende mus DNA. . L = molekylvekt stige
doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s003 plakater (TIF)
Figur S3.
fylogenetisk analyse av virus genomer fra LAPC4, Vcap og EKVX cellelinjer. Den fylogenetisk tre representerer kjente endogene MLV sekvenser, inkludert polytropisk (PMV), endret polytropisk (Mpmv) og xenotropisk (EM) virus. Dette treet representerer kun endogene MLV hvor den fulle provirale sekvensen er kjent, som er sannsynlig bare en liten del av alle endogene MLV tilstede i mus. Eksogene MLV (CAS-BR-E, AKV, MLMCG og Friend) er også inkludert for sammenligning
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s004 plakater (TIF)
Figur S4.
Testing tidlig passasje LAPC4 for tilstedeværelse av virus. Pan-MLV-primerene beskrevet i figur 1 ble brukt for å teste LAPC4 celler fra vårt laboratorium (spor 1), tidlig passasje LAPC4 frosset ned i 1998 fra C. Sawyers lab (spor 2), LAPC4 celler frosset ned i 2010 fra C- . Sawyers lab (spor 3), og en uekte DNA-ekstraksjon negativ kontroll (spor 4). Alle LAPC4 celler analysert var positive for viruset
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s005 plakater (TIF)
Figur S5.
Eksempler på MLV-negative prostatakreftcellelinjer som er blitt forurenset med MLV under seriell passasje av cellekultur i laboratoriet. Prostata kreft cellelinjer hentet direkte fra NCI (DU145) eller ATCC (LNCaP) er negative når farget med MLV30 og MLV70 sera. Disse linjene ble uventet funnet å være positivt for viruset etter serie passasje i laboratoriet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s006 plakater (TIF)
Tabell S1.
Fullstendige resultater av IHC og PCR på 72 humane cellelinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s007 plakater (DOC)
Tabell S2.
Primere som brukes til å sekvensere virale genomer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s008 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Dr. John Isaacs ( Johns Hopkins) for å tilveiebringe flere cellelinjer for cellelinjen microarray. Vi ønsker også å erkjenne og takke Dr. Charles Sawyers (MSKCC) for å gi tidlig passasje LAPC4 prøver og Dr. John M. Coffin (Tufts University) for å gi kompetanse og bistand med fylogenetiske analyser.
