Abstract
dysfunksjon av Paneth og slimceller i tarmen bidrar til inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og kolitt -associated kolorektal kreft (CAC). Her rapporterer vi en rolle for NAD
+ – avhengig av histon deacetylase SIRT1 ved kontroll av anti-bakterielle forsvar. Mus med en intestinal bestemt
SIRT1
mangel (
SIRT1
int – /-
) har mer Paneth og slimceller med en påfølgende omorganisering av tarmen bakterieflora. Fra et mekanistisk synspunkt, er virkningene på musetarmcellemodning formidlet av SIRT1 avhengige endringer i acetylering status for SPDEF, en mester regulator av Paneth og slimceller. Våre resultater tyder på at målretting SIRT1 kan være av interesse i forvaltningen av IBD og CAC
Citation. Lo Sasso G, Ryu D, Mouchiroud L, Fernando SC, Anderson CL, Katsyuba E et al. (2014) Tap av SIRT1 Function Forbedrer Intestinal Antibakteriell Defense og Beskytter mot kolitt-indusert tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (7): e102495. doi: 10,1371 /journal.pone.0102495
Redaktør: Salvatore Papa, Institutt for Hepatology – Birkbeck, Storbritannia
mottatt: Mai 20, 2014; Godkjent: 19 juni 2014; Publisert: 11.07.2014
Copyright: © 2014 Lo Sasso et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. GLS er støttet av en utgående italiensk Association for Cancer Research (AIRC) /Marie Curie Fellowship. JA KS Laboratoriet er støttet med tilskudd fra École Polytechnique Fédérale de Lausanne, EUs Ideas programmet (PEB-231138), den sveitsiske National Science Foundation (31003A-140780 og 310030-143748), den Krebsforschung Schweiz (KFS-3082-02- 2013 og KFS-2809-08-2011) og NIH (R01AG043930). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Paneth og slimceller er høyt spesialiserte små intestinale epitelceller som syntetiserer og utskiller antimikrobielle peptider og slim. Disse faktorene representerer den første linjen i forsvaret mot patogener og er avgjørende for å opprettholde den hårfine balansen mellom de ulike bakteriearter som koloniserer pattedyr gut [1]. Dysbiotic microbiota innvirkning på helsen til verten og bidrar til patogenesen av flere tarmsykdommer, slik som inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og kolitt-assosiert kolorektal kreft (CAC) [2].
differensiering og modning av Paneth og slimceller er kontrollert av wnt og Notch signalkaskader som samarbeider for å fremme spesifikasjon av de ulike celle linjene [3]. Videre SAM spisse domene som inneholder ETS transkripsjonsfaktor (SPDEF), en nedstrøms effektor av både wnt og Notch baner, er kjent for å øke differensieringen av både Paneth og slimceller fra deres felles stamfar [4]. SPDEF ble først identifisert som en regulator av prostata-spesifikt antigen [5], men senere også forbundet til bryst, lunge, tarm og epitel, med mulig involvering i progresjon av kreft i disse vevene [6], [7].
Sirtuin 1 (SIRT1), en NAD
+ – avhengige deacetylase [8], er involvert i et bredt spekter av cellulære prosesser, inkludert metabolisme, celleproliferasjon og apoptose, og immunrespons [9]. Rollen SIRT1 i reguleringen av intestinal homeostase er bare begynnelsen for å bli belyst. Nylig en involvering av intestinal SIRT1 i systemisk gallesyre og kolesterolmetabolismen har vært foreslått [10]. Videre studier som fokuserer på rollen til SIRT1 i kolorektal kreftutvikling ved hjelp av APC
min /+ mus som modell, viste motstridende resultater som støtter både svulsten fremme [11] og tumor undertrykke [12], [13] funksjoner.
Ved hjelp av mus med en tarmspesifikk
SIRT1
sletting (
SIRT1
int – /-
), viser vi her at SIRT1 regulerer Paneth og slimcellemodning og produksjon av anti-bakterielle proteiner. Disse effektene avhenger av SIRT1-medierte endringer i acetylering status av SPDEF. Videre intestinal
SIRT1
sletting har en stor innvirkning på tarmen mikrobiomer og beskytter mus fra IBD og CAC. Spesielt virkningene av
SIRT1
mangel på produksjon av anti-bakterielle proteiner er evolusjonære konservert i
C.elegans
fremhever den gamle natur denne funksjonen SIRT1. Til sammen våre resultater tyder på at målretting SIRT1 kan være av interesse for forvaltningen av IBD og CAC
Materialer og metoder
Generering av SIRT1
int -. /- Og SIRT1
int – /- LGR5
EGFP-res-CRE-ert2 mus
for generering av
SIRT1
floxed (
SIRT1
L2 /L2
) mus, genomisk DNA dekker
SIRT1
locus ble forsterket fra 129Sv belastningen ved high-fidelity PCR. De resulterende DNA-fragmenter ble montert i den målsøkende vektor av Institut Clinique de la Souris (Strasbourg, Frankrike). Konstruksjonen hvori eksoner 5, 6 og 7 ble flankert av loxP-seter ble så elektroporert inn i 129Sv embryonale stamceller (ES-celler) (fig S1B). G418-resistente kolonier ble utvalgt og analysert for homolog rekombinasjon ved PCR og positive kloner ble verifisert ved Southern blot hybridisering. Riktig målrettede ES-cellekloner ble injisert inn i blastocyster og overført til pseudopregnant kvinner, noe som resulterer i kimære avkom som ble parret med hunn C57BL /6J-mus som uttrykker FLP rekombinase under kontroll av den allestedsnærværende cytomegalovirus-promoteren [14]. Avkom som overføres det muterte allelet og som tapte Flp transgenet (
SIRT1
L2 /WT
mus) ble deretter valgt, og backcrossed til C57BL /6J mus i ti generasjoner. For tarmen microbiota analyse SIRT1
int – /- og SIRT1
L2 /L2 var co-huset under bestemte patogen frie forhold i samme rom. Mus behandlet med AOM /DSS ble enkeltvis plassert etter avvenning for å unngå forskjeller i DSS inntak. Men SIRT1
int – /- og SIRT1
L2 /L2 ble behandlet under bestemte patogen frie forhold i samme rom. Spesielt SIRT1
int – /- og SIRT1
L2 /L2 mus kommer fra samme foreldre. Alle dyreforsøk ble gjort i henhold til institusjonelle og sveitsiske retningslinjer og godkjent av distriktsmyndighetene i kantonen Vaud. Videre ble alle dyreforsøk dannet den sveitsiske Animal Welfare lovgivning og anmeldt av Statens Etisk styret i Canton de Vaud (Animal Welfare Act 2005, Prosjekt License N ° 2463-2463.1-2605 lisens til professor Johan Auwerx). Til slutt ble alle dyreforsøk godkjent av den uavhengige staten Vaud Veterinær kontor etisk styret, som virker i samsvar med dyrevernloven, AAALAC internasjonale retningslinjer, sveitsiske og EUs lovverk. Mus ble avlivet ved hjelp av en kort eksponering for CO
2. Denne metoden fører til rask kvelning og smertefri i mus. Alle forsøkene ble utført fra oktober 2011 til april 2014.
Plasmider
pattedyr ekspresjonsvektor Puse-SIRT1 ble kjøpt fra Upstate. Den SPDEF kodende sekvens tilhører Mouse transkripsjonsfaktor Resource [15]. Det ble forsterket og ligert til pcDNA3-FLAG eller pGEX-GST. pCruzHA SIRT1G261A (plasmid 10963) [16] og pGL2Basic-EcadK1 (plasmid 19290) [17] ble kjøpt av Addgene. pGEX-GST SPDEFK294Q ble generert ved hjelp av seterettet mutagenese.
C.elegans
analyser
C.elegans
stammer ble dyrket ved 20 ° C på nematode vekstmedier agarskåler (NGM) seeded med
E. coli
belastning OP50 mindre annet er oppgitt. Stammer som ble brukt var vill-type Bristol N2, VC199
sir-2.1 (ok434)
IV, SAL129 [
Pha-en product: (E2123) III;
lys-en
: : GFP +
Pha-en product: (+)], og SAL105 [
Pha-en product: (E2123) III;
lys-7
:: GFP +
pha- 1 product: (+)]. Stammer ble levert av
Caenorhabditis
Genetics Center (University of Minnesota). Bakterielle foring RNAi Forsøkene ble utført som beskrevet [18].
sir-2.1 plakater (R11A8.4) klon ble kjøpt fra GeneService og sekvensert.
Kvantifisering av GFP
uttrykk ble utført i henhold til beskrevne protokoller [19]. For bilde oppkjøpet av
lys-7
:: GFP uttrykk, dyrene ble montert på 2% agarose pads i 10 mM tetramisol (Sigma) og undersøkt ved hjelp av en Zeiss Axioplan-2 mikroskop (Carl Zeiss).
mRNA utvinning og RT-qPCR analyse
RNA ble isolert fra vev ved hjelp av TriPure reagens (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert fra en mikrogram total RNA ved hjelp QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). QRT-PCR ble utført ved hjelp av LightCycler 480 SYBR Grønn Jeg Master Mix (Roche) og analysert gjennom ΔΔCT beregning. Verdier ble normalisert til cyklofilin uttrykk. Grunning er oppført i tabell S1 i File S1.
Luciferase assay
PC3 celler (ATCC) i 96 /wells plater ble ko-transfektert med en reporter som inneholder SPDEF respons element av menneskelig E -cadherin promoter, pGL2Basic-EcadK1 og pcDNA3, pCDA3-FLAG-SPDEF eller pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q med eller uten Puse-SIRT1 ekspresjonsvektorer (jetPEI transfeksjon, Polyplus). Media ble fjernet etter 24 timer ble cellene vasket med kald PBS, og Luciferase Substrat (Lys-Glo Luciferase Assay System, Promega) ble tilsatt før Luciferase måling av Victor x 3. β-galaktosidase ble brukt for normalisering.
In vitro acetylering og deacetylering analyser
In vitro acetylering og deacetylering analysene ble utført som opprinnelig beskrevet [20]. I korthet ble 1 pg rekombinant SPDEF protein, oppnådd fra BL21-stamme, ble inkubert med 500 ng av rekombinant p300 i acetylering buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 ug /ml bepstatin, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin, 1 mM natriumbutyrat og 150 mM acetyl-CoA) i 1 time ved 30 ° C. Etter inkubering ble prøvene løst på SDS-PAGE og analysert ved western blot, eller anvendt for in vitro-deacetylering analyser. For deacetylering assays, ble 1 pg av acetylert SPDEF inkubert med 500 ng rekombinant SIRT1 protein i deacetylering buffer (50 mM Tris-HCl, pH 9, 4 mM MgCl2, 0,2 mM DTT, 1 ug /ml bepstatin, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin, og 1 mM NAD
+) i 30 minutter med konstant omrøring. De inkuberte prøvene ble løst i SDS-PAGE og analysert ved western blot eller brukes til å kartlegge et acetylert rest med nano-LC-MS /MS. Rekombinante P300, SIRT1, SIRT6 og SIRT7 proteiner ble gjort av Dr. Michael O. Hottiger (University of Zurich). Cell basert deacetylering ble analysert i Hek293T celler transfektert med pCDA3-FLAG-SPDEF eller pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q med eller uten Puse-SIRT1 eller pCruzHA-SIRT1G261A ekspresjonsvektorer av jetPEI Transfeksjon kit (Polyplus). 22 timer senere ble mediet erstattet med friskt medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 4,5 g /l glukose, 10% føtalt kalveserum, 0,1 mM NEAA, 50 ug /ml gentamicin og 1 mM natrium-butyrat). Etter 2 timer ble hele cellelysatene fremstilt ved bruk av IP-lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM natriumbutyrat og 10 mM nikotinamid) supplert med Complete proteasehemmer Cocktail tabletter (Roche). 0,5 mg til 1 mg av hele celle-lysatene ble brukt for immunutfelling (IP). IP ble utført med FLAG-Agarose Affinity Gel som beskrevet av leverandøren (A2220, Sigma-Aldrich). Etter IP, ble prøver påført på SDS-PAGE og analysert ved western blotting.
cellekultur, transfeksjon, og antistoffer
HEK293 og PC3-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium inkludert 4,5 g /l glukose, 10% føtalt kalveserum, 0,1 mM NEAA og 50 ug /ml gentamycin ved 37 ° C under en 5% CO
2 atmosfære. HEK293T og PC3 cellene ble transfektert hjelp JetPei reagens (
Polyplus transfections
, Illkirch, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner. Antistoffer: Lysozym (Abcam, Ab36362), Chra (Santa Cruz, sc-13090), acetylert lysin (Cell signalering, 9441L), SIRT1 (Abcam, ab12193), β-catenin (Sigma, A5441), L-FABP (Santa Cruz sc-50380), PCNA (Santa Cruz, sc-56), HSP90 (BD Transduction Laboratories, 610418), anti-FLAG (Sigma, F1804), Tubulin (Santa Cruz, sc-5286), SPDEF for western blot (Sigma , AV32533), SPDEF for IHC var vennlig levert av Prof. J. Whitsett.
subcellulære fraksjone
cytoplasma og nukleoplasma fraksjoner ble hentet fra
SIRT1
L2 /L2
og
SIRT1
int – /-
isolert krypten. Krypter ble isolert etter en publisert protokoll [21]. Enkelt krypten-avledede celler ble til slutt vasket med iskald PBS, og inkubert i buffer A (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT10 mM, 10 HEPES-KOH, pH 7,4) inkludert en proteinase-inhibitor cocktail (Roche) i 5 min. Etter 50 slag i en Dounce-homogenisator, ble cytoplasma fraksjon oppsamlet ved sentrifugering (1,4 k x g i 5 min, 4 ° C). Pelletene ble vasket to ganger med buffer A. Kjerner ble inkubert i buffer B (150 mM NaCl, 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4) inneholdende en protease inhibitor cocktail i 30 minutter på is. Nukleoplasma ble oppsamlet ved sentrifugering (2-k x g i 5 min, 4 ° C). Proteiner ble kvantifisert ved hjelp av Lowry-metoden og behandlet for western blot analyse.
GFP
+ celler analyse
krypter fra
SIRT1
L2 /L2- Hotell og
SIRT1
int – /- LGR5
EGFP-res-CRE-ert2
tarmen ble isolert som tidligere beskrevet (se
subcellulære fraksjone
ledd) [22]. Enkeltceller ble analysert ved FACS å oppdage GFP
+ celler.
Fraksjonering av celler langs krypten-Haug aksen
Den sekvensielle isolering av mus tynntarms epitelceller langs crypt- villus-aksen ble utført som beskrevet tidligere [23] med noen modifikasjoner. I korthet, ble hele tynntarmen (tolvfingertarmen til terminal ileum) fjernet, skylt, og kuttet i små biter (2-5 mm) og inkubert ved 37 ° C i 15 min i 15 ml buffer A (96 mM NaCl, 1,5 mM KCl, 27 mM Na-citrat, 8 mM KH
2PO
4, og 5,6 mM Na
2HPO
4, pH 7,3). Deretter ble det inkubert i 10 minutter i 15 ml av buffer B (PBS pluss 1,5 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitol, og 1 mg /ml bovint serumalbumin) i en riste 37 ° C inkubator. Ved fullførelsen av den 15-minutters inkubasjon, ble frittliggende enterocytter oppsamlet (fraksjon 1) og 15 ml frisk buffer B lagt til i vev. Denne prosedyren ble gjentatt fire ganger, er fremgangsmåten som varer 25, 25, 25 og 30 min, henholdsvis (fraksjoner 2, 3, 4 og 5), for en total av 120 min inkubasjonstid. Ved fullførelsen av den endelige inkubasjonsperioden ble cellene samlet opp fra hver av de 5 fraksjoner ble høstet ved sentrifugering ved 1500 rpm ved 4 ° C i 5 minutter. Cellepelletene ble vasket to ganger og lysert i RIPA buffer. Alkalisk fosfatase aktivitet ble analysert ved alkalisk fosfatase analyse kit (BioVision).
Massespektrometri analyse
Gel baner ble skåret i stykker og utsatt for i-gel fordøyelse med endoproteinase Glu-C eller trypsin. Peptide fordøyer ble resuspendert og analysert av nano-LC-MS /MS ved hjelp av en Orbitrap Elite massespektrometer (Thermo Fischer Scientific) koblet til en ultraperformance LC (UPLC) system (Thermo Fischer Scientific Ultimate 3000 RSLC). Dataanalyse ble utført med Proteome Discoverer (v. 1.3) og søk ble utført med Mascot og Sequest mot en mus database (Uniprot slipper 2013_01). Data ble videre bearbeidet, inspisert og visualisert ved hjelp Stillas 3 programvare.
In situ
hybridisering
in situ
prober brukt i denne studien samsvarer med uttrykte sekvens koder eller fullt sekvensert cDNA hentet fra åpne Biosystems. Tiltredelses tallene for disse probene er som følger: mus
Olfm4
BC141127 (9.055.739), mus
Defa4
BC134360 (40134597). For å sikre spesifisiteten av sondene, genererte vi både fornuft og antisense sonder av
in vitro
transkripsjon hjelp DIG RNA merking mix (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner og publiserte metoder [24]. ISH ble gjort ved hjelp av helautomatisk instrument Ventana XT (Roche). Kjemikalier var fra Roche Diagnostics. Kort sagt ble formalin faste parafininnstøpte seksjoner de-paraffinized og rehydratisert og forbehandlet ved enzymatisk fordøyelse (protease1, 4 minutter ved 37 ° C). Hybridisering ble utført tilsetning til hvert lysbilde 50 eller 100 ng av sonden fortynnet i Ribohybe ved 65 ° C i 6 timer.
baktericide assay
Bakteriedrepende analyser ble utført som beskrevet [25] med noen modifikasjoner. I korthet, ble tynntarmen hos voksne mus skyllet med iskald PBS og segmentene inkubert i 30 mM EDTA for å eluere epitelceller. Totale proteiner fra epitelceller ble ekstrahert ved bruk av NP40 lyseringsbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM EDTA, 5% [volum /volum] glycerol, 1% [volum /volum] NP40) supplert med fullstendig protease inhibitor. 100 ug protein ble inkubert i 60 minutter ved 37 ° C i 10 mM iPIPES buffer inneholdende eksponentielt voksende
E.coli
K12 (ATCC, 10
6 CFU /ml). 20 ul av prøven ble fortynnet og sådd ut på LB-agar fast medium. Overlevende bakterier ble kvantifisert som CFU på platene etter inkubering over natten ved 37 ° C. Bakterier ruges i iPIPES uten tilsatt proteiner ble ansett som kontroller.
kolitt og kolitt-assosiert kolorektal kreft modeller
DSS-indusert kolitt ble indusert som tidligere beskrevet [26]. Daglige endringer i kroppsvekt ble vurdert. Rektal blødning ble scoret på en skala fra 0 til 5, som indikerer ingen (0) eller svært alvorlig (5) rektal blødning. Ilea og kolon var snap-frosset eller fast med 4% Forma-Fixx (Thermo Scientific) og innebygd i parafin.
In vivo
intestinal permeabilitet ble undersøkt i mus som beskrevet [27]. Kolitt-indusert kolorektal kreft (AOM /DSS modell) ble fremkalt som tidligere beskrevet [28]. Etter offer, ble mus kolon åpnet i lengderetningen, og etter 2 timer fiksering i 4% Formell-Fixx, kort farget med Coomassie Blå å visualisere svulster. Svulster ble talt på en blindet måte av en patolog. Svulster størrelse ble analysert ved måleren. Små biter av terminal ILEA og proksimale kolon var snap-frosset og resten festes med 4% Forma-Fixx (Thermo Scientific) og innebygd i parafin.
Statistisk analyse
Data ble sjekket med Shapiro-Wilk test for normalitet i R før du utfører signifikanstester. Variabler med en W verdi ≥0.80 ble ansett som tilnærmet normalfordelt. To variable sammenligninger ble beregnet ved hjelp av Welch to-tailed
t
-test. For flere sammenligninger, ble Bartletts test utført for å se etter lik varians (p 0,10) og deretter enveis ANOVA ble utført med Bonferroni post-hoc test. Variabler med Shapiro-Wilk W verdi 0,80 ble betraktet som ikke-normal og sammenligninger ble beregnet ved bruk av Wilcoxon signed-rank test. Kaplan-Meier-metoden ble brukt for overlevelsesanalyse i ormer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, og for alle sammenligninger betydning,
p
-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
* p 0,05;
** p 0,01;
*** p 0,001. Denne studien hadde en utforskende natur og det var ingen pre-spesifisert effektstørrelse. Utvalgsstørrelsen ble valgt basert på studier gjennomførbarhet og potensial statistisk styrke. Utvalgsstørrelsene er konsistente med de som er rapportert i lignende studier. Statistisk analyse for tarmen microbiota analysen er rapportert i tilleggsinformasjon.
Resultater
SIRT1
sletting øker antimikrobiell respons i pattedyr og nematoder
Vi først bestemt lokalisering av SIRT1 protein langs villus /krypten aksen. Siden SIRT1 vises høyanriket i tynntarmen krypter (Figur S1 A), avlet vi Villin-Cre transgene mus med mus der eksoner 5-7
SIRT1
genet ble flankert av loxP-seter (
SIRT1
L2 /L2
) for å generere tarmspesifikke
SIRT1
knockout mus (
SIRT1
int – /-
) (figur S1B-C). I motsetning til en tidligere rapportert sletting av
SIRT1
exon 4 [29], ingen avkortede og potensielt aktive SIRT1 fragmenter ble oppdaget i
SIRT1
int – /-
mus (figur S1C).
SIRT1
int – /-
tarmen viste en betydelig økning i antall Paneth (lysozym
+ og Defa4
+) og beger (PAS
+), men ikke av enteroendocrine (Chra
+) celler (figur 1A, Figur S1D). Følgelig mRNA nivåer av Paneth (
Lys, Crypt1, Crypt4, Defa-Rs
) og beger (
Klf4, Muc2
) cellemarkører, samt lysozym protein overflod og
Defa4
mRNA oppdages gjennom
in situ
hybridisering, ble indusert i proksimale og tarmen av
SIRT1
int – /-
mus (Tall 1B-C, figur S1D-E ).
A, Representative bilder av Paneth (Lysozyme
+ celler), beger (Periodic acid-Shiff
+ celler), og enteroendocrine (Kromogranin A
+ celler) cellefarging. (N = 3 mus, 5-10 felt per mus, 50-100 krypten /villi hvert felt). Bar = 50 mikrometer. B-C, mRNA og proteinnivåer Paneth (
Lys, Mmp7, Crypt1, Crypt4, Defa-Rs
) og beger (
Klf4, Muc2
) markørene er økt i den proksimale og distale tynntarm av
SIRT1
int – /-
mus (N = 6-8). For RTqPCR analyse,
rps12
ble brukt som referanse genet. P-Actin ble brukt som lasting kontroll i western blot. D, økt uttrykk av gener involvert i patogen forsvar i
sir-2,1 product: (
ok434
)
C. elegans
mutant (N = 6; hver N betyr en enkelt populasjon av ca. 500 ormer).
Act1 Hotell og
Y45
ble brukt som referanse. E,
sir-2.1
siRNA induserer
Lys-1 Hotell og
lys-7
drevet GFP uttrykk i
Lys-1 :: GFP Hotell og
lys-7 :: GFP
reporter ormer. I den samme figuren et representativt bilde av
lys-7 :: GFP
før og etter
sir-2.1
siRNA vises (DIC, differensial interferens kontrast). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001
Vi neste vurdert om
SIRT1
er korrelert til de som er involvert i anti-bakterielle forsvar gener bruker BXD mus genetisk referansegruppen (www.genenetwork. org) [30]. Som ingen tarm genuttrykk data er tilgjengelig, analyserte vi hematopoetiske celler, som er en del av arsenalet av celler som beskytter mot patogener. I tråd med våre observasjoner,
SIRT1
uttrykk korrelerer negativt med uttrykket av flere Defensin-relaterte gener (figur S1F).
For å teste om koblingen mellom
SIRT1 Hotell og anti-bakterielle forsvaret ble evolusjonære konservert, vi brukte
C. elegans
. Bemerkelsesverdig, ekspresjonen av et bredt spekter av gener involvert i antimikrobiell i feltet (
lyz-1, lyz-7, 8-lyz
) [31], så vel som av gener indusert av spesifikke patogener ( F01D5.5, F56D6.2, C17H12.8, C29F3.7, K08D8.5) [32] ble forsterket i
sir-2,1 product: [33] mutant orm (figur 1D). Videre i
Lys-1 :: GFP Hotell og
Lys-7 :: GFP
reporter stammer [31], s
ir-2.1
siRNA betydelig fremkalt både
lys-en
– og
lys-7
-avhengig GFP uttrykk (figur 1E). Disse dataene dermed tyde på at effekten av
SIRT1
i anti-mikrobiell respons evolusjonære konservert fra pattedyr til ormer.
Tarm
SIRT1
sletting virkninger på gut microbiota
med tanke på grunnleggende rolle som Paneth og slimceller spille i å beskytte pattedyr gut fra avvikende bakteriell kolonisering, vi neste analysert virkningen av en
SIRT1
sletting på gut microbiota.
SIRT1
int – /-
tarmen ikke bare har en større cecum (figur 2A), en indikasjon på en modifisert mikrobiomer [34], de hadde også et høyere bakteriedrepende kapasitet (figur 2B). Ved hjelp av DNA ekstrahert fra enten intraluminal cecum innhold eller tykktarm vev, forsterket vi V3-regionen i det bakterielle 16S rRNA-genet. Etter fjerning av lav kvalitet leser og alle Singleton Drifts Taksonomiske Units (Otus) (tabell S2 i File S1), 98% av den leser falt i Core målbare mikrobiomer (CMM-se metoder). Den mikrobielle samfunnet var dominert av fire phyla,
firmicutes, bacteroidetes, Proteobacteria, og verrucomicrobia spinosum plakater (figur 2C) [35]. For å kartlegge den mikrobielle samfunn sammensetning og struktur på tvers av
SIRT1
mutasjon vi brukte en Otu basert metode. I nettverksbaserte analyser, cecum mikrobielle samfunn av
SIRT1
L2 /L2 Hotell og
SIRT1
int – /-
mus uthevet samfunnet forskjeller mellom genotyper (figur 2D), en observasjon videre støttet av Principal koordinater Analysis (PCA, figur 2E). Indikator mikrobielle arter som bidrar til samfunnet forskjeller mellom
SIRT1
L2 /L2 Hotell og
SIRT1
int – /-
mus ble identifisert og Otus vist i figur 2F og tabell S3 i fil S1. Interessant, et flertall av anriket Otus i
SIRT1
int – /-
mus var av slekten
Barnesiella
,
Bacteroides
, og
Prevotella
(Rekke
bacteroidetes
), som finnes i den normale humane og mus tarmen, som er særlig redusert i IBD [36], [37]. I motsetning til slekten
Clostridium plakater (phylum
firmicutes
) ble utvidet i
SIRT1
L2 /L2
mus (Figur 2F og tabell S3 i File S1). Disse resultatene viser at tarm
SIRT1
sletting og påfølgende endringer i Paneth og slimceller endre gut mikrobiomer.
A, Representant bilde som viser en betydelig økning i cecum størrelse i
SIRT1
int – /-
mus. B, bakteriedrepende kapasitet på tynntarmen (tolvfingertarmen) i
SIRT1
int – /- Hotell og
SIRT1
L2 /L2
mus ble analysert ved kolonidannende enhet analysen. Resultatene er uttrykt som% av kontrollen (ingen proteiner) (N = 7). C, Fordeling av mikrobiell Phyla i tykktarmen vev og cecum innholdet
av SIRT1
L2 /L2 Hotell og
SIRT1
int – /-
mus. D, nettverksbaserte analyser av coecale bakteriesamfunn i
SIRT1
L2 /L2 Hotell og
SIRT1
int – /-
mus. Alle de store sirkelen representerer et dyr, og hvert mindre prikk representerer en Otu;
SIRT1
L2 /L2 plakater (blå) og
SIRT1
int – /- plakater (rød). E, Principal Koordinere Analysis (PCA) (PERMANOVA p = 0,012, og ANOSIM p = 0,007) viser betydelig separasjon av mikrobielle samfunn mellom
SIRT1
L2 /L2 Hotell og
SIRT1
int – /-
mus. F, Heatmap viser de 20 forskjellige Otus mellom
SIRT1
L2 /L2 Hotell og
SIRT1
int – /-
mus. Overflod verdiene ble log transformert og standardiserte og plottet i Matlab. * Viser
Barnesiella
,
Bacteroides
, og
Prevotella
; ° indikerer
Clostridum
slekten (se også tabell S3 i File S1). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001
Tarm
SIRT1
sletting beskytter mot kolitt og kolitt-indusert tykktarmskreft
Gitt disse siste observasjonene, studerte vi effekten av
SIRT1
på patogenesen av både kolitt og CAC.
SIRT1
int – /-
mus eksponert for dekstransulfat natrium (DSS), viste en mildere kolitt preget av lavere kroppsvekt tap, blødning score, en trend mot redusert intestinal permeabilitet, og en redusert uttrykk av inflammatoriske gener (fig S2A-D). Disse resultatene egget oss til å studere hvordan
SIRT1
int – /-
mus reagerer på CAC. Mus ble injisert med derav AOM (azoxymethane) carcinogen før en etterfølgende eksponering for tre sykluser med DSS (figur 3A). Bemerkelsesverdig, antall og størrelse av svulster i
SIRT1
int – /-
tarmene var mindre (3A-B). Jo bedre helsetilstanden for
SIRT1
int – /-
mus ble ytterligere understreket av lengre tykktarm lengde og raskere kroppsvekt gjenoppretting etter siste DSS syklus (Tall 3C-D)
A-B, Skjematisk fremstilling av AOM /DSS protokollen (øverst til venstre panel) og representant bilde av kolon fra
SIRT1
int – /- Kjøpe og kontroll mus etter CAC induksjon (Bar = 200 nm) (nederst til venstre panel).
SIRT1
int – /-
mus viser betydelig mindre svulster (panel høyre). B, representativt bilde av et kolon seksjon fra en
SIRT1
int – /- Hotell og kontroll mus etter CAC induksjon (venstre panel). Tumorstørrelse (høyre panel). C, Colon lengde på tidspunktet for offer (AOM /DSS). D, Prosent av kroppsvektendring. For AOM /DSS eksperiment 8 mus for hver genotype ble anvendt. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. E-F, Principal Koordinere Analysis (PCA) av bakterielle sekvenser fra tykktarmen vev utført ved hjelp av uvektet UniFrac avstand matrise. E,
SIRT1
int – /-
kolon vev før og etter AOM behandling (PERMANOVA p = 0,003, ANOSIM p = 0,016). F,
SIRT1
L2 /L2
tykktarm vev med og uten AOM behandling (PERMANOVA p = 0,067, ANOSIM p = 0,038). G-H, mest statistisk signifikant Otus før og etter AOM både
SIRT1
L2 /L2 plakater (G), og
SIRT1
int – /- product: (H), kolon vev; * Indikerer
Helicobacter Hotell og
Desulfovibrio product: (se også tabell S4 i File S1). Jeg, PCA av bakterielle sekvenser fra tykktarmen vev etter AOM (PERMANOVA p = 0,767, ANOSIM p = 0,167).
Analyse av den mikrobielle samfunnet etter DSS /AOM eksponering viste signifikante endringer i
SIRT1
int – /-
mus (Figur 3E), mens endringen var mindre i
SIRT1
L2 /L2
mus (Figur 3F). Indikator mikrobielle arter, før og etter DSS /AOM, ble identifisert (Tall 3G-H og tabell S4 i File S1). Av notatet, Otus tilhører slekten
Helicobacter Hotell og
Desulfovibrio
ble bare økt etter DSS /AOM i
SIRT1
L2 /L2
mus (Figur 3G og Tabell S4 Fil S1). Interessant, selv om rollen som
Helicobacter
i tykk- og endetarmskreft er fortsatt kontroversielt [38],
Desulfovibrio
anses å delta i patogenesen av ulcerøs kolitt og Crohns sykdom [39]. Mikrobielle samfunn i
SIRT1
L2 /L2 Hotell og
SIRT1
int – /-
mus etter DSS /AOM behandling var ikke signifikant forskjellig (figur 3I). Til sammen hypoteser vi at endringer i det generelle mikrobielle samfunn under normale forhold (figur 2), samt i bestemte slekter etter DSS /AOM, kunne bestemme forskjellig mottakelighet av de to genotypene til kolitt og CAC.
hyper-acetylert SPDEF stasjoner Paneth og slimcellemodning ved tarmspesifikke
SIRT1
sletting
for å forstå de molekylære endringer bak disse fremtredende fenotyper, vi utforsket ulike mulige veier som bidrar til Paneth og slimcelle utvikling og modning.
