Abstract
Bakgrunn
neurotrofinreseptorer ble først identifisert i nerveceller. De ble nylig oppdaget i enkelte kreftformer i forbindelse med invasivitet, men funksjonen av disse tyrosin kinase reseptorer som ikke tidligere er undersøkt i tykk- og endetarmskreft (CRC) celler.
Metoder og funn
Vi rapporterer her at menneske CRC cellelinjer syntetisere neural vekstfaktor Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) under stress forhold (serum sult). Parallelt CRC-celler uttrykte høy (TrkB) og lav affinitet (p75
NTR) reseptorer på plasmamembranen, mens TrkA og TrkC, to andre høy affinitetsreseptorer for NGF og NT-3, henholdsvis, var umulig å oppdage. Vi viser at BDNF-indusert celleproliferasjon og hadde en anti-apoptotiske effekt mediert gjennom TrkB, som vurdert av K252a, en Trk farmakologisk inhibitor. Det undertrykkes både celle-proliferasjon og overlevelse av CRC-celler som ikke uttrykker TrkA eller TrkC. Parallelt med økningen i BDNF sekresjon, sortilin, et protein som virker som et neurotrofin transportør, så vel som et co-reseptor for p75
NTR, ble øket i cytoplasmaet av primære og metastatiske CRC-celler, noe som antyder at sortilin kunne regulere neurotrofin transport i disse cellene. Men pro-BDNF, også påvist i CRC celler, ble co-uttrykkes med p75
NTR på cellemembranen og samlokalisert med sortilin. I motsetning til BDNF, eksogent BDNF pro-indusert apoptose CRC, noe som antyder at en motvekt mekanisme er involvert i kontroll av CRC celle overlevelse, gjennom sortilin som co-reseptor for p75
NTR, høyaffinitets-reseptor for pro- neurotrophins. Likeledes viser vi at BDNF og TrkB transkripsjoner (og ikke p75
NTR) er overuttrykt i pasientenes svulster sammenliknet med sine tilstøtende normalt vev, særlig i avanserte stadier av CRC.
Konklusjon
samlet utgjør disse resultatene markere at BDNF og TrkB er avgjørende for CRC cellevekst og overlevelse in vitro og i svulster. Dette autokrin sløyfe kan være av stor betydning for å definere nye målrettet terapi
Citation. Akil H, PERRAUD A, Melin C, Jauberteau MO, Mathonnet M (2011) Finjustering Roller av endogen Brain-nevrotrop Factor , TrkB og Sortilin i Colorectal Cancer Cell Survival. PLoS ONE 6 (9): e25097. doi: 10,1371 /journal.pone.0025097
Redaktør: Mark P. Mattson, National Institute on Aging utført Research Program, USA
mottatt: 6 juli 2011; Godkjent: 23 august 2011; Publisert: 26.09.2011
Copyright: © 2011 Akil et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ligue contre le Cancer og Conseil Regional du Limousin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF), et medlem av neurotrofin familien er kjent for å spille en kritisk rolle i modulering av celle-overlevelse, differensiering og apoptose i nervesystemet [1].
BDNF signaler gjennom to typer av celleoverflatereseptorer: høy-affinitet tropomyosin relaterte kinase (Trk) reseptor B (TrkB), en tyrosinkinase-reseptoren og lav affinitet reseptor (p75
NTR), samt en død domene-reseptor som hører til tumor nekrose faktor (TNF) reseptorfamilien, en felles reseptor for alle neurotrofiner nervevekstfaktor (NGF), neurotrofin-3 (NT-3) og neurotrofin-4/5 (NT-4/5 ). Neurotrophins syntetiseres som forløpere (proneurotrophins) som proteolytisk spaltede å modne neurotrophins. Pro-BDNF spalting kan skje enten intracellulært ved innvirkning av furin eller proconvertase, eller ekstracellulært ved virkningen av plasmin, matriksmetalloproteinase 7 (MMP-7) eller MMP-9 [2]. Både modne BDNF og pro-BDNF er biologisk aktive, med avvikende roller som gjenspeiler ulike reseptoraffinitet: pro-BDNF viser høyere affinitet for p75
NTR, mens modent BDNF har større affinitet for TrkB
BDNF binder. 145 TrkB full-lengde-reseptoren og en avkortet gp95TrkB variant som beholder direkte signaleringsaktiviteter [3] og øker spesifisiteten for BDNF [3], [4], [5]. Mens trk-reseptorer er involvert i de fleste av overlevelse og vekstegenskaper av neurotrofiner, funksjonene til p75
NTR, omfattende studert i nerveceller, er avhengig av neurale celletype, tilstedeværelsen av ligand, og dens tilknytning til en ko- reseptoren. Faktisk, p75
NTR forbundet med Trk co-reseptor forsterker [6] eller undertrykke neurotrofin-mediert celle overlevelse [7]. Det ble nylig vist å være i stand til å binde pro-BDNF og indusere celledød når den er assosiert med sortilin (et medlem av Vps10p-domenet reseptorer familie) [8], [9], [10].
Således , regulering av pro-BDNF behandling for økt kontroll over balansen mellom p75
NTR og TrkB engasjement [11], [12]. Den antiapoptotic funksjon av BDNF er mediert skjønt interaksjon med høy-affinitet reseptorer 95 og 145TrkB [5], mens pro-BDNF induserer apoptose via interaksjon med en reseptor sammensatt av p75
NTR og sortilin [10], [13].
Sortilin er uttrykt i flere vev, særlig hjerne, ryggmarg, hjerte, muskler, adipocytter [14] og B-lymfocytter [8]. Sortilin ble først beskrevet i humane nevrale celler som en intracellulær transport protein for neurotrophins og proneurotrophins [15] og nylig, som en transportør av Trk neurotrofin reseptorer i nerveceller [16]. Videre sortilin var også kjent som en ko-reseptor (NTSR3) for en G-protein-koblet reseptor, den neurotensin-reseptor-1 (NTSR1) som aktiveres av neurotensin [17]. Neurotensin ble opprinnelig vist seg å spille en rolle i vekst og overlevelse av tykktarmskreft (CRC) celler, gjennom sin binding til denne sortilin /NTSR1 komplekse [18].
BDNF har vært innblandet i patogenesen og prognose tallrike humane ondartede sykdommer så som neuroblastomer [19], [20], medulloblastom [21], prostatakreft [22], [23], lungecancer [24], pankreatisk karsinom [25], [26], [27], og leverkreft [28]. I CRC, en overekspresjon av BDNF [29] og TrkB [30] ble nylig rapportert i pasientenes vev, men ingen data omhandler funksjon av BDNF som en autokrin sløyfer i CRC celle overlevelse. Siden TrkB uttrykk er knyttet til flere kreftformer; målet med denne studien var å definere vilkårene for endogen utskillelse av BDNF og uttrykk for neurotrofin reseptorer i CRC. Heri viser vi at endogen BDNF blir utskilt av CRC-celler innsendt til serum deprivasjon og induserer celleoverlevelse gjennom TrkB-tyrosinkinase-reseptoren som uttrykkes på membranen av belastede celler. Det er bemerkelsesverdig at TrkB og BDNF uttrykk ble forbedret i pasientenes svulster spesielt i avanserte stadier. Sammen er disse dataene påpeke relevansen av BDNF /TrkB sti i vekst og potensialet invasivitet av CRC.
Materialer og metoder
celler og kultur
Menneskelig CRC cellelinjer svarende til forskjellige tumorstadier ble kjøpt fra American Type Culture Collection. WiDr [31] og SW480 [32] ble primære CRC-avledede cellelinjer, mens de to andre linjer ble hentet fra CRC metastaser i lymfeknuter (SW620 som stammer fra den samme pasient som SW480 linje) [32] og ascitis (COLO 205) [33]. Under basale betingelser ble WiDr-celler opprettholdt i MEM-medium (Gibco) supplementert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS) (Gibco), 1 mM natriumpyruvat (Gibco), 1% ikke-essensielle aminosyrer (Gibco), 100 IU /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Gibco). SW480, SW620 og COLO 205 linjene ble dyrket i RPMI medium (Gibco) supplementert med 10% FCS, 100 IU /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin ved 37 ° C under fuktet atmosfære og 5% CO2. Dyrkede celler ble understreket av 24-72-h serum sult. Mus antagonistiske anti-BDNF monoklonalt antistoff (mAb) klon 35928,11 (10 ug /ml) ble anskaffet fra Calbiochem. Rekombinant human BDNF (100 ng /ml), rekombinant pro-BDNF (4 ng /ml), og K252a (200 nM) ble kjøpt fra Alomone laboratorier.
Pasienter og vevsprøver
All pasient avledet vev ble samlet og arkivert, på Tumorotheque av Limoges universitetssykehus under protokoller godkjent av Institutional Review Board (AC N 2007-34, DC 2008-604 og 72-2011-18). Skriftlig informert samtykke ble innhentet av alle fag for denne studien. Tumorvev ble oppnådd fra 20 pasienter, som gjennomgikk kirurgisk fjerning av CRC i Limoges universitetssykehus mellom januar 2006 og februar 2007. Fire adenokarsinom pasienter per etappe (i henhold til pTNM klassifiseringen [34]) har blitt valgt for denne studien. Vev fra fire pasienter med kolorektal godartet sykdom, megadolichocolon, ble anvendt som kontroller.
RT-PCR-analyse
CRC-cellelinjer ble dyrket i medium inneholdende eller ikke 10% FCS for 24 til 72 h. SV total RNA isolert system (Promega) ble anvendt for å isolere total RNA fra cellelinjer som beskrevet i produsentens instruksjoner. Mengden av RNA ekstrahert ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 260 nm ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer ND-1000 (Labtech). Renheten av RNA ble kontrollert ved forholdet DO260 /DO280 nm mellom 1,83 og 2,00. Fraværet av RNA-degradering ble bekreftet ved elektroforese på en 1,5% agarosegel inneholdende etidiumbromid. Ekstraksjon av RNA fra pasientens vev ble utført som beskrevet [35]. Første-tråd cDNA-syntese ble generert ved hjelp av Superscript III (Invitrogen). PCR ble utført ved anvendelse av Taq DNA-polymerase (Invitrogen). Total RNA isolert fra humane neuroblastom-cellelinjer (IMR32, SH-SY5Y) og humane erythromyeloblastoid leukemi K562-celler ble anvendt som positive kontroller. Non-reverse-transkribert prøver (produsert ved å utelate revers transkriptase) ble kjørt parallelt med omvendt-transkribert prøver for å utelukke forurensning av genomisk DNA.
Primere ble utformet ved hjelp Primer 3 (forutsatt i det offentlige rom ved Whitehead Institute for Biomedical Research /MIT Senter for Genomisk Research, Cambridge, MA, og er tilgjengelig på https://www.wi.mit.edu). Opprettet primerpar er oppført, sammen med deres forventede produkt størrelse og annealing temperaturer i tabell 1.
Sekvense
Etter ekstraksjon av PCR-produkter med Rapid PCR rensesystemer (Märligen biovitenskap), i henhold til produsentens anvisninger, ble PCR produktene direkte sekvensert med BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) i en GeneAmp® PCRSystem 2700 termo (Applied Biosystems). Fragmentene ble renset ved hjelp av isopropanol utfelling. Sekvenser gel ble kjørt på en automatisert laser fluorescerende DNA-sekvens ABI Prism® 3130 × l Genetisk Analyser (Applied Biosystems) og homologies ble sjekket ved hjelp Finch TV, etter sprengning med BDNF, TrkB145, TrkB95, p75
NTR, og sortilin GenBank sekvenser (NM_001143816, NM_001018064, NM_001007097, NM_002507, og NM_002959, henholdsvis).
Western blot
mus anti-BDNF (1 pg /ml) og muse anti-TrkB (1 pg /ml) antistoff (Abs) ble innkjøpt fra R Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-pro-BDNF Ab (8 ug /ml; Alomone Labs), muse-anti-TrkB Ab (2,5 ug /ml; R Santa Cruz Biotechnology) og geit anti-sortilin Ab (1 pg /ml; Santa Cruz Biotechnology). Cellene ble vasket 3 ganger i PBS, og inkubert i 2 timer ved romtemperatur med Alexa Fluor-konjugert sekundært Abs (Invitrogen) fortynnet 1:5000 i PBS. Etter 3 vaskinger i PBS ble kjerner farget i 5 minutter med DAPI. Etter intensive vasker, ble dekk invertert på lysbilder og montert med Dako Fluorescent Mounting Medium (Dakocytomation). Negative kontroller var celler inkubert med irrelevant normal kanin, mus eller geit IgG (Sigma). Bildene ble tatt med et konfokal mikroskop (Carl Zeiss, LSM 510); overflate plott av fluorescens data ble generert med ImageJ programmet.
ELISA
Etter en 24-timers, 48-timers og 72-timers kultur, prøver av supernatant fra cellelinjer ble samlet og lagret ved -80 ° C inntil dagen for analysen. Immunoanalyser Systems (Promega), spesifikke for BDNF ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (pg /ml). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført for hver eksperimentell betingelse, hver med målinger i tre eksemplarer.
celleproliferasjon analyser
Celleproliferering ble målt ved hjelp av klikke-det Edu Alexa Fluor 488 Flowcytometri analyse ( Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble celler (2 x 10
5 per brønn) inkubert over natten i tolv-brønners plater før behandling, og deretter dyrket i 24 timer i serumfritt medium med eller uten eksogent BDNF, K252a eller både BDNF og K252a tilsatt samtidig . Spredningsverdier ble målt ved hjelp av en BD LSRFortessa flowcytometri (BD Biosciences). Forsøk ble utført in triplo, og tre sett med 50.000 celler ble oppsamlet for hver betingelse. Dataene ble kjøpt og analysert av BD FACSDiva 6.0-programvare (BD Biosciences). Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.
Apoptose assay
Apoptose ble målt ved påvisning av cytoplasmiske oppløselige nukleosomer ved hjelp av en kalorimetrisk analyse, celledød Detection ELISAPLUS sett (Roche Molecular Diagnostic) ifølge produsentens instruksjoner. Absorbans verdier ble målt ved 405-490 nm to bølgelengder. Den oppnådde kontroller absorbans var normalisert til en verdi på 1, som tidligere beskrevet [7]. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer og gjentas minst tre ganger.
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble bestemt av en enveis analyse av avvik (ANOVA) med Statview 5.0-programvaren (Abacus Concepts ).
P
verdier 0,05 ble betraktet som signifikant. Mean og SEM verdiene ble hentet fra minst 3 uavhengige eksperimenter.
Resultater
tykktarmskreft cellelinjer uttrykke TrkB og p75
NTR men ikke Trka eller trkC reseptorer
TrkB og p75
NTR uttrykk ble påvist i CRC-cellelinjer i henhold til basal (10% FCS) dyrkningsbetingelser, både på mRNA (figur 1A) og protein (figur 1D) nivåer med noen forskjeller avhengig av cellelinjer. Mens den fulle lengde TrkB (TrkB145) og p75
NTR transkripter var fremherskende i en primær (SW480) og en metastase (SW620) linje (figur 1A) (to cellelinjer isolert fra den samme pasient), den mest sterkt uttrykt transkripsjonene var de av den avkortede isoformen (TrkB95) i alle cellelinjer (figur 1A) med unntak av WiDr-celler som uttrykte TrkB95 og p75
NTR bare etter en 48-timers serum deprivasjon (figur 1B). TrkB og p75
NTR sekvense etter agarose elusjonstester gels validerte disse resultatene. Imidlertid trkA og trkC-transkripter (figur 1C), så vel som proteiner, reseptorer (figur 1D) ble ikke detektert, uansett dyrkningsbetingelser, i motsetning til den erythromyeloblastoid leukemi K562-cellelinjen er kjent for å uttrykke disse neurotrofinreseptorer [36].
(A): RT-PCR av BDNF, den høye (TrkB) og lav (p75
NTR) affinitetsreseptorer, TrkA, og TrkC fra celler dyrket i basal (10% FCS-medium), WiDr (kolonne: 1 ), SW480 (kolonne: 2), SW620 (felt 3), COLO 205 (spor 4). GAPDH mRNA-nivåer ble anvendt som en intern kontroll. Positiv kontroll (felt 5) var det neuroblastom-cellelinje (IMR32) for BDNF, TrkB og p75
NTR; og erythromyeloblastoid leukemi celler (K562) for TrkA og C. Et representativt resultat av i det minste tre til fem uavhengige eksperimenter. (B) Sammenligning av TrkB95 og p75
NTR på total RNA ekstrahert fra WiDr celler dyrket i 10% FCS eller etter 24-72 timer serum deprivasjon (0% FCS). TrkB95 og p75
NTR mRNA /GAPDH mRNA kvantifisering av band intensiteter evaluert av densitometry er vist ovenfor baner og uttrykt i vilkårlige enheter (gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk). (C) Samme eksperiment: RT-PCR av TrkA og TrkC på total-RNA ekstrahert fra WiDr-celler dyrket under basaldyrkningsbetingelser (10% FCS), og etter 24-72 timer fra serum sult i forhold til positiv kontroll (K562) (D) uttrykk for pro-BDNF og BDNF, full lengde TrkB 145 og avkortet TrkB 95 og p75
NTR proteiner i CRC cellelinjer dyrket i 10% FCS. TrkA og TrkC ble ikke oppdaget. Actin ble brukt som lasting protein kontroll. WiDr (kolonne: 1), SW480 (kolonne: 2), SW620 (felt 3), COLO 205 (spor 4). Positiv kontroll (felt: 5) var IMR32 celler for BDNF, pro-BDNF, TrkB og p75
NTR og K562 celler eller TrkA og TrkC. Et representativt resultat på minst tre uavhengige eksperimenter.
CRC cellene produserer endogen BDNF
Siden CRC uttrykt TrkB reseptorer, søkte vi etter en endogen produksjon av BDNF, en TrkB ligand. BDNF mRNA ble påvist i alle undersøkte celle linjer under basal (10% FCS) forhold, hovedsakelig i de to viktigste CRC linjer (WiDr og SW480). Det er interessant å følge serum sult i 24 til 72 timer, BDNF mRNA-nivåer (figur 2A), i tillegg til moden BDNF-protein (17 kDa) som detekteres ved Western blot i cellelysatene, ble forbedret i de fire CRC-celler (figur 2B), så vist ved densitometri verdier (BDNF /GAPDH forholdstall for mRNA og BDNF /Actin forhold for proteiner) (figur 2A, B). I tillegg ble BDNF sekresjon påvist ved ELISA i kultursupernatanten av CRC-cellelinjer. BDNF frigivelse ble signifikant øket ved serum sult i de to primære WiDr og SW480 CRC-cellelinjer (figur 2C og tabell 2), mens det var ingen betydelig forbedret i metastatisk SW620 og COLO 205 CRC-cellelinjer (tabell 3). Serum deprivasjon førte til en økning av BDNF nivåer i cytoplasmaet til disse fire cellelinjer som vist for SW480 i figur 2D. Kvantifisering av grønn fluorescens intensitet i hver kulturbetingelser bekreftet resultatene fra fluorescens-bilder (figur 2D) og forsterket resultatene oppnådd ved Western blotting.
(A) BDNF produksjon vurderes ved RT-PCR av total RNA ekstrahert fra celler dyrket i basal tilstand (10% FCS) og for 24 til 72 timer med serum deprivasjon. Kvantifisering av band intensiteter er vist som ovenfor (gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk). (B) BDNF-ekspresjon ved western blotting (i referanse til aktin) totalt cellulært protein ekstrahert fra cellelinjer dyrket under basal tilstand (10% FCS), og etter 24-72 timer fra serum deprivasjon (0% FCS). Ifølge densitometriske analyser, kvantifisering viste en signifikant økt ekspresjon av BDNF i dyrkede celler. Histogrammer er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. **,
p
0,01; ***,
p
0,001, sammenlignet med basale dyrkningsforhold. (C) Sekresjon av BDNF bestemt ved ELISA i supernatanten av de WiDr og SW480-cellelinjer i henhold til basal tilstand (10% FCS), og etter 24-72 timer fra serum deprivasjon (0% FCS). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre paralleller fra tre forskjellige eksperimenter. ***,
p
0,001, sammenlignet med basal kultur tilstand. (D) Sammenligning av BDNF uttrykk ved SW480 celler dyrket i 10% FCS og etter 72-h serum deprivasjon. Konfokalmikroskopi med anti-BDNF Ab og Alexa Fluor-488 konjugat (grønn) og kjerner teller farget med den blå-fluorescerende DNA flekken DAPI. Relativ kvantifisering ble vurdert av grønn fluorescens flate tomten. Bilder var representative for minst tre uavhengige forsøk. Skala barer, 10 mikrometer. Lignende resultater ble observert med de tre andre linjene (data ikke vist).
Serum sult induserer membran uttrykk for TrkB og dens colocalization med BDNF
funn som endogen BDNF er gjemt under serum sult forhold førte oss til å søke etter et uttrykk for sin høye affinitet reseptor. I basal (FCS-inneholdende) kulturer (figur 3A, C), ble høyaffinitetsreseptoren TrkB og dens ligand BDNF sekvestrert i alle CRC-cellelinjer. En 24-timers serum sult induserte en flytting av TrkB til cellemembranen (figur 3B, D). Interessant nok var en colocalization av TrkB og BDNF på membranen påvist i alle undersøkte cellelinjer, og nådde et maksimum på 72 timer med savn, som vist for WiDr og COLO 205-celler (figur 3B, D). Liknende fargemønstre ble erholdt for SW480 og SW620 (data ikke vist). Koekspresjonen på membranen av både TrkB og endogene BDNF tyder på at BDNF og TrkB kan bli innblandet i en autokrin løkke i stressede CRC-celler.
Konfokalmikroskopi av WiDr (A, B) og COLO 205 (C, D ) celler, farget med et anti-BDNF Ab (rød), anti-TrkB mAb (grønn) eller begge deler (overlay) dyrket med 10% FCS (A, C) eller etter 24-timers serum deprivasjon (B, D). Under basaldyrkningsbetingelser (10% FCS), ble TrkB og BDNF deponeres i cytoplasma (piler) i WiDr (A) og COLO 205 (C) celler. De samme fargemønstre ble oppnådd med de andre to cellelinjer (data ikke vist). Etter serum sult flytting til cellemembranen og colocalization av TrkB og BDNF (gul i fusjonerte, piler) ble påvist i WiDr (B) og COLO 205 (D). Bilder var representative for minst tre til fem uavhengige eksperimenter.
BDNF fremmer spredning og overlevelse av CRC cellelinjer gjennom TrkB
For å bestemme funksjonen av denne ligand-reseptor-systemet i spredning og overlevelse av WiDr, SW480, SW620 og COLO 205 CRC celler, spredning og apoptose ble utført med eksogen BDNF enten i FCS-fri eller i 10% FCS-holdige kulturer. Etter en 24-timers kultur i serumfritt medium, eksogent BDNF betydelig økt proliferasjon av alle undersøkte cellelinjer, i motsetning til fravær av effekten i nærvær av 10% FCS (figur 4A og tabell 2, 3). Siden TrkB ble uttrykt på overflaten av belastede celler, hypotese vi dens mulige rolle i celleproliferasjon under slike forhold. Faktisk, tilsetning av K252a, en Trk-inhibitor [37], undertrykkes den proliferative virkningen av eksogent BDNF i serumfrie kulturer i alle undersøkte cellelinjer (figur 4A), som tyder på at endogen BDNF ble innblandet i cellevekst gjennom TrkB (fig. 4A og tabell 2, 3). For ytterligere å vurdere rollen til TrkB og BDNF i stresset CRC celle overlevelse, ble apoptose evaluert av løselige nucleosome cytoplasmatiske nivåer i kulturer med og uten eksogene BDNF eller K252a. Etter en 24-timers serum sult, WiDr, SW480, SW620, og COLO 205-celler stimulert med eksogent BDNF hadde signifikant redusert apoptotiske forhold, mens ingen signifikant effekt ble observert på-celler opprettholdt i normalt medium (figur 4B, C og tabell 2, 3 ). Videre økte 200 nM K252a de apoptotiske prosenter av WiDr, SW480, SW620, og COLO 205 (figur 4B, C og tabell 2, 3). De oppnådde etter 48 og 72-h serum sult Resultatene bekreftet disse dataene (fig. 4B, C), noe som tyder på at spredning av CRC-celler kan bli formidlet av en BDNF /TrkB signalveien.
(A) Role av endogen BDNF og dens reseptor TrkB på CRC celleproliferasjon: effekter av eksogene BDNF og undertrykke endogen TrkB reseptor på cellevekst. De fire cellelinjer ble dyrket i 24 timer i FCS-fritt medium (FCS 10%, -) i nærvær av eksogent BDNF (+), K252a (+) alene eller i kombinasjon. Celleformering ble bestemt ved strømningscytometri-analyse ved bruk av EDU Alexa Fluor 488. De data som er presentert som histogrammer av prolifererende celler i relative enheter ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001, sammenlignet med serumfritt medium. (B, C) Effekter av eksogene BDNF og undertrykke endogen TrkB reseptor på celleoverlevelse. Apoptotiske forhold mellom oppløselige nukleosomer ble påvist ved ELISA celle for WiDr, SW480, SW620, og COLO 205 indusert av serum deprivasjon alene (FCS 10%, -) eller i forbindelse enten med eksogent BDNF (+), eller med K252a (+), i løpet av 24-72 timer etter serum deprivasjon. Histogrammer, betyr forholdet av apoptotiske celler ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***
p
0,001, sammenlignet med serum-fri tilstand alene. (D, E) apoptotisk grad etter 24 timers berøvelse serum alene (0% FCS) eller med kombinasjon med et nøytraliserende anti-BDNF-mAb (0% anti-BDNF). Histogrammer, betyr forholdet av apoptotiske celler ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
. 0,001, sammenlignet med serum-fri tilstand alene
For å definere signaltransduksjonsbane indusert av BDNF /TrkB aktivering, vi søkte etter Akt fosforylering i to CRC cellelinjer følgende BDNF behandling. Faktisk, western blotting viste at eksponering av WiDr eller SW480 til BDNF etter en 16-timers serum deprivasjon, indusert Akt fosforylering (Ser 473) etter 5 minutter, nådde maksimum 30 minutter (7 til 8 ganger økning) og likevel oppdaget etter 24 timer (3-4-dobling) (figur 5).
evnen BDNF å aktivere PI3-kinase /Akt signalveien i CRC-celler ble vurdert ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for Akt og fosfor-Akt (Pakt ). WiDr og SW480-celler ble serum-sultet i 16 timer. Cellene ble deretter eksponert for BDNF (100 ng /ml) og høstet ved forskjellige tidspunkter, i 5 minutter (min) til 24 timer (h). Tretti pg av protein lysatene ble analysert for pakt (Ser473) og total Akt ved western blot-analyse. Tettheten av hver pakt bånd ble korrigert for variasjoner i belastning, ved hjelp av tettheten av den tilsvarende totale Akt. Folden induksjon ble evaluert som forholdet mellom fosforylerte Akt protein tettheter mellom kontrollen (0 min) og behandlede celler. Et representativt resultat av minst tre uavhengige eksperimenter.
Vi bestemte derfor apoptotiske nivåene for de fire cellelinjene i nærvær av en nøytraliserende anti-BDNF mAb [38]. Dette mAb faktisk økt apoptose av primære CRC linjer: WiDr (figur 4D, venstre og tabell 2), SW480 (figur 4D, rett og tabell 2) og metastatisk linjer, SW620 (figur 4E, venstre og tabell 3) og COLO 205 ( Figur 4E, rett og tabell 3).
Til sammen disse data tyder på at endogen BDNF er innblandet i CRC celle overlevelse i serumfritt kulturer via TrkB gjennom en autokrin loop. Dette førte til studere rollen til sortilin i BDNF trafikk.
Sortilin, en BDNF menneskehandel protein, uttrykkes ved CRC cellelinjer
Primere som brukes i studiet av sortilin transkripsjoner anerkjent den intracellulære delen av proteinet (sortilin IC involvert i neurotrofinproduksjons trafficking) og ekstracellulære delen (sortilin EC involvert i sin reseptor egenskaper). Sortilin transkripsjon (Figur 6A) og protein (figur 6B) ble påvist i alle undersøkte cellelinjer. Ved sammenligning med celler dyrket i 10% FCS, en 24 til 72-timers serum deprivasjon forsterket sortilin uttrykk som detekteres på immunoblot av WiDr, SW480, SW620 og COLO 205-ekstrakter (figur 6B). Sortilin er kjent for å eksistere under to forskjellige tilstander av glykosylering i CRC celler. Faktisk ble det oppdaget som en dublett i SW480 cellelinje (figur 6B), men knapt i andre (WiDr, Colo205) med et uttrykk variabel mellom cellelinjer og kulturer (Figur 6b). Sortilin ble påvist i alle CRC-cellelinjer ved konfokal mikroskopi også, som vist for SW620 (figur 6C). Dobbelt farging for sortilin og BDNF viste en slående colocalization med økt fluorescensstyrkene etter 24-h serum sult (figur 6C). Kvantifisere den grønne (BDNF) og røde (sortilin) fluorescensstyrkene i dyrkningsforhold hvert bekreftet funnene fra de fluorescens bilder (figur 6C). Liknende fargemønstre ble observert med WiDr, SW620, og COLO 205-cellelinjer under de samme betingelser (data ikke vist). Til sammen våre resultater er i samsvar med hypotesen om at sortilin kunne utøve funksjonen av transportør for BDNF.
(A) Sortilin deteksjon av RT-PCR av total RNA ekstrahert fra celler dyrket i 10% FCS og etter 24 -72 h serum sult. Expression ble kontrollert med spesifikke primere for sin ekstracellulære (Sortilin EF) og intracellulær (Sortilin IC) deler. En representant resultat fra minst tre uavhengige forsøk. (B) taksering ved western-blotting av sortilin uttrykket (i referanse til aktin) totalt cellulært protein ekstrahert fra undersøkte cellelinjer dyrket under basal tilstand, og etter 24-72 timer fra serum mangel.
