Abstract
DNA metyltransferase hemmere azacytidin og decitabine representerer arketypiske legemidler for epigenetisk kreftbehandling. For å karakterisere demethylating aktivitet azacytidin og decitabine vi behandlet tykktarmskreft og leukemiceller med både narkotika og brukte matrise-basert DNA metylering analyse av mer enn 14.000 genet arrangører. I tillegg ble legemiddelindusert demetylering forhold til metylering mønstre av isogene tykktarmskreftceller mangler både DNA metyltransferase 1 (DNMT1) og DNMT3B. Vi viser at legemiddelinduserte demetylering mønstre er svært spesifikk, ikke-tilfeldig og reproduserbare, noe som indikerer målrettet remetylering av spesifikk loci etter replikasjon. Tilsvarende fant vi at CG dinukleotider innenfor CG øyene ble fortrinnsvis remethylated, noe som indikerer en rolle for DNA-sekvens sammenheng. Vi identifiserte også en undergruppe av gener som aldri ble metylert ved medikamentell behandling, enten i tykktarm kreft eller i leukemiske cellelinjer. Disse demetylering-resistente gener ble beriket for Polycomb undertrykkende Komplekse 2 komponenter i embryonale stamceller og til transkripsjonsfaktor bindende motiver som ikke finnes i demetylerte gener. Våre resultater gir detaljert innsikt i de DNA metylering mønstre indusert av azacytidin og decitabine og foreslå involvering av komplekse regulatoriske mekanismer i legemiddelindusert DNA demetylering
Citation. Hagemann S, Heil O, Łyko F, Brueckner B ( 2011) azacytidin og Decitabine Frem Gene-spesifikk og ikke-tilfeldig DNA Demety i human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (3): e17388. doi: 10,1371 /journal.pone.0017388
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 23 november 2010; Godkjent: 01.02.2011; Publisert: 07.03.2011
Copyright: © 2011 Hagemann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1463) til Florida (www.dfg.de). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aberrant DNA metylering er en viktig kjennetegn på kreft [1], [2], [3]. I kreftceller, er global hypometylering ledsaget av hypermethylated og transcriptionally silenced tumorsuppressorgener. Disse såkalte epimutations bidra til tap av kontroll i kreftceller proliferasjon [4], [5], [6].
Opprettholdelse av hypermethylation-indusert epimutations krever den kontinuerlige aktiviteten av DNA-metyltransferaser (DNMTs) under celledeling. Inhibering av DNMTs har blitt brukt i epigenetisk kreft terapi for å reversere epimutations og for å reaktivere epigenetiske taushet tumorsuppressorgener [7], [8], [9], [10]. De arketypiske DNMT hemmere 5-azacytidin (azacytidin, AZA) og 2′-deoksy-5-azacytidin (decitabine, DAC) er godkjent for behandling av myelodysplastisk syndrom, en preleukemic benmarg lidelse. Til tross for deres anvendelse i klinikken, og i en rekke prekliniske studier, er kunnskapen om virkningsmåte av disse stoffene fremdeles ufullstendig [11].
En av de store gjennomgående observerte cellulære effekter ved azacytidin og decitabine er DNA-demetylering . Som nukleosidanaloger, blir AZA og DAC inkorporeres i å replikere DNA, hvor de kan danne kovalente bindinger med DNMTs [12], [13], [14]. Dette fangst av DNMTs fører til passive demetylering under DNA replikasjon og celledeling. Inhibering av DNA-metylering av AZA og DAC har blitt demonstrert ved den valgte loci i flere kliniske studier [7], [9], [15].
Nylig har effekten av AZA og DAC har også blitt undersøkt på det genomiske nivå. På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av egnede verktøy for genome-wide metylering analyse, ble disse studiene i utgangspunktet begrenset til analyse av narkotikainduserte transkripsjons endringer. For eksempel ble genekspresjon profilering som brukes til å analysere effektene av DAC på genuttrykksmønstrene av HCT116 tykktarmskreftceller, og resultatene antydet at, i tillegg til genet aktivering av hypermethylated gener, kan transkripsjonen nedregulering være en viktig effekt av DAC [16], [17]. Flere nylig, ble Illumina Golden matriser brukes til direkte karakterisere narkotika-indusert DNA demetylering på 1,505 CG dinukleotider som representerer 807 kreftrelaterte gener i myelogen leukemi celler [11]. Men på grunn av den forholdsvis lave dekning av denne matrisen, de resulterende data ble ikke analysert i detalj og de molekylære egenskaper av DNA-demetylering responser forble som skal undersøkes.
I den foreliggende undersøkelse har vi brukt genom-skala infinium analyse å systematisk karakterisere demetylering respons etter AZA og DAC behandling i to humane kreftcellelinjer. For å oppnå dette vi undersøkt metylering nivåer av mer enn 27.000 CG dinukleotider representerer mer enn 14.000 gener [19] i HCT116 tykktarmskreftceller og i HL-60 myeloid leukemi celler. Våre resultater viser at AZA og DAC demethylate CGS i ikke-CG øyer mer effektivt enn de i CG øyer (CGI). Videre behandling med AZA og DAC resultater i ikke-tilfeldige og reproduserbare DNA demetylering mønstre i HCT116 og HL-60-celler. I tillegg har vi identifisert en delmengde av CGS som hverken er demetylert etter medikament-behandling og heller ikke i celler med svært reduserte nivåer av DNMT1 og ingen DNMT3B [20], [21]. Demetylering bestandig CGS er knyttet til gener fortrinnsvis bundet av Polycomb undertrykkende Komplekse 2 (PRC2) komponenter i ES-celler og er beriket for transkripsjonsfaktorer bindende motiver som ikke finnes i demetylerte gener. Disse resultatene avdekke mønstre av DNA demetylering av AZA og DAC og foreslår at legemiddelindusert demetylering er regulert av definerte molekylære mekanismer.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneske HCT116 kolon carcinoma celler og HCT116 dobbel knockout (DKO) celler (DNMT1 – /-; DNMT3B – /-) ble vennligst tilveiebrakt av Bert Vogelstein (juli 2007) og dyrket under standardbetingelser i McCoys 5A medium supplert med 5% L-glutamin og 10% FCS (Invitrogen). Identitet av HCT116-celler ble bekreftet av DMSZ (Braunschweig, Tyskland, januar 2008) ved hjelp av DNA-profilering av åtte korte tandem repetisjoner. HL60-celler ble oppnådd fra ATCC og dyrket under standard betingelser i RPMI medium (Sigma) supplementert med 5% L-glutamin og 10% FCS (Invitrogen). Friske prøver av alle cellelinjer ble anvendt for forsøkene. For å analysere virkningene av 5-azacytidin (AZA) og 2′-deoksy-5-azacytidin (DAC), ble cellene dyrket i medium supplert med forbindelsene, i de konsentrasjoner som er angitt.
Inhibitorer
5 mM stamløsninger av AZA (Sigma) og DAC (Calbiochem) ble fremstilt ved oppløsning av stoffene i destillert H
2O (GIBCO) og lagret ved -80 ° C. Umiddelbart før behandlingen ble stamløsninger fortynnet i cellekulturmedium til konsentrasjonene angitt.
Genomisk DNA-metylering analyse
medikament-behandlede celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av AZA og DAC etter en 24 h seeding periode, og genomisk DNA ble fremstilt ved bruk av DNeasy blod og vev Kit (Qiagen). Global genomisk DNA metylering nivåer ble bestemt ved kapillær elektroforese som beskrevet tidligere [22].
Array basert DNA metylering analyse
Array-baserte gen-spesifikke DNA metylering analyse ble utført ved hjelp av infinium HumanMethylation27 perle chip teknologi (Illumina) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort tid, sulfitt behandlet genomisk DNA ble hel-genom forsterkes og hybridisert til HumanMethylation27 BeadChip. Oligomers, festet til to forskjellige kuletyper per avhørt locus, match enten unmethylated eller denaturert tilstand, slik at single-basen forlengelse og gjenkjenning. Den metylering status for en bestemt cytosin er angitt med gjennomsnittlig beta (AVB) verdier hvor en svarer til full metylering og 0 til ingen metylering. Delta-beta (DB) verdier ble beregnet ved å subtrahere AVB verdier av behandlede eller knockout celler fra kontroll AVB-verdier. Biologiske gjentak (se Figur S2) av hvert forsøk ble gruppert og array-prober med
P
≥0.05 ble ekskludert fra analysen. Loci ble bedømt som metylert om AVB var større enn eller lik 0,2 [23]. Den komplette CG metylering data er tilgjengelige i ArrayExpress database (www.ebi.ac.uk/arrayexpress). For en mer detaljert beskrivelse av normalisering og videre beregninger viser til metoder S1. Resultatene ble analysert ved hjelp av Illumina s BeadStudio programvare, versjon 3.1.3.0 og med R, versjon 2.10.0 [24]. Spesielt ble følgende R-pakker brukes for dataanalyse: grafikk (boksplott), statistikk (estimater kernel tetthet og statistiske analyser), den limma pakken [25] for bygging av Venn-diagrammer og gitteret pakken [26] for visning av multivariate data (trellis plots).
454 DNA-sekvensering bisulfitt
Deep DNA-bisulfitt-sekvensering av CGS av 4 gener (PIK3CG, Ells1, Aff2, NTRK3) ble utført som beskrevet tidligere [27], [ ,,,0],28]. For 454 sekvensering, ble sulfitt-behandlet genomisk DNA forsterket ved hjelp av sekvensspesifikke primere som inneholder behandlingsspesifikke strekkoder og 454 linker sekvenser (Figur S7). 454 dyp sekvensering ble utført av DKFZ Genomics og proteomikk Kjerne Facility.
Analyse av transkripsjon faktor bindende motiver
For å identifisere beriket transkripsjonsfaktor bindende motiver vi brukte elektroniske verktøyet PScan [29] og 130 transkripsjonsfaktor-bindende profiler (
H. sapiens
) fra Jaspar databasen [30]. Analysen av gener ble fokusert på området -450 til 50, med hensyn til deres transkripsjonsstartsetet. For å oppsummere resultatene av PScan analyse ble en heatmap viser den naturlige logaritmen av
P
verdier generert.
Resultater
Etablering av behandlingsforhold for aza- og DAC indusert demetylering i HCT116 cellene
Som et første skritt i retning av en systematisk karakterisering av demetylering reaksjoner indusert av azacytidin (AZA) og decitabine (DAC), rettet vi å maksimere demetylering effektivitet, for å minimalisere legemiddeltoksisitet [31], [32] og for å hindre remetylering som observert ved langtidsbehandling [33]. For å oppnå dette, behandlet vi HCT116-celler med økende medikamentkonsentrasjoner (figur 1A) og over forskjellige tidsperioder (figur 1B) for å fastsette den globale genomiske metylering nivåer ved kapillær elektroforese. Resultatene viste klart for begge medikamenter som maksimalt demetylering ble oppnådd med konsentrasjoner på 1 uM etter 24-36 timer med DAC viser en 60% reduksjon og AZA viser en 50% reduksjon av global DNA-metylering.
Siden azanucleosides kreve DNA-replikasjon for sin funksjon, analyserte vi hvorvidt antallet celler i S-fasen kan bli påvirket av medikamentbehandling. HCT116-celler behandlet med 0,1, 1, og 10 uM av AZA eller DAC og cellesyklusfordelingen ble analysert ved hjelp av FACS (fluorescens Acitvated cellesortering). Mens andelen av celler i S-fasen ble økt etter 24 timers behandling med 0,1-10 uM AZA eller DAC, bare lengre inkubasjonstider resulterte i en reduksjon av replikerende celler i flere medikamentkonsentrasjoner (fig S1A). Videre FACS analyser viser også at bare høye medikamentkonsentrasjoner (10 mm) resulterte i en G2 fase arrest, som ble ledsaget av en reduksjon av celler i G1 fasen (figur S1B). Også uttalt celledød ble bare observert med høye medikamentkonsentrasjoner, spesielt etter behandling med 10 uM AZA, noe som indikerer at AZA-behandlede celler stoppet for å replikere og døde. Disse observasjonene bekreftet at demetylering bør analyseres etter 24 timer og ved en mikrometer medikamentkonsentrasjon å ekskludere de konfunderende effekter av legemiddeltoksisitet.
Array-basert genom-wide DNA metylering analyse
For å analysere DNA metylering mønstre av HCT116 cellene på et genom-wide skala vi brukte infinium metylering profilering for å avhøre metylering status for 27,578 CG dinukleotider representerer 14,475 forbundet gener [11], [19]. Metylering av individuelle loci ble bestemt av gjennomsnittlig beta (AVB) verdier som varierte fra 0 (unmethylated) til 1 (helt denaturert). Basert på tidligere studier [19], bare CGS som viste en reduksjon eller økning i deres AVB verdi (delta beta, DB) på minst 0,2 ble anvendt for analyse av metylering endringer. Biologiske replikater av HCT116 kontrollceller og medikamentbehandlede celler viste en svært høy likhet (figur S2A, B, C), bekrefter teknisk robusthet i matrisen og den høye spesifisiteten av narkotikainduserte metylering mønstre.
Påfølgende dataanalyse klart viste en bimodal fordeling av CG-dinukleotid metylering med en lav-metylering peak (13667 i 27571 CGS) som ble funnet ved AVB-verdier mellom 0 og 0,2 og en høy-metylering-toppen (8222 til 27 571) som dekket intervallet 0,8 til 1,0 (figur 1C). Som i ubehandlede celler, er den bimodale fordelingen metylering også observert etter behandling av celler med AZA og DAC (se figur 1C). Men etter rusbehandling high-metylering peak (AVB≥0.8 i kontrollceller) ble flyttet til lavere metylering verdier, noe som indikerer legemiddelindusert demetylering.
En Global metylering analyse (CE) av HCT116-celler behandlet med de angitte konsentrasjoner av AZA og DAC i 24 timer. B, Time-retters CE måling av legemiddelindusert demetylering hjelp 1fiM AZA eller DAC; Co, ubehandlede HCT116-celler. C, estimater Kernel tetthets av infinium metylering data for ubehandlet (Co) og medikamentbehandlede celler. D, Validering av infinium metylering data ved hjelp av 454 bisulfite sekvensering; metylering data av 4 CG loci, målt enten ved infinium analyse eller av 454 sekvensering, korrelerer sterkt (Pearsons korrelasjonskoeffisient r = 0,84); behandling med AZA og DAC er betegnet med A og D, henholdsvis; ulike loci er angitt med farger: PIK3CG (blå), NTRK3 (grønn), Ells1 (rød), og AFF2 (svart)
For å validere metylering matrise resultater, vi brukte svært kvantitativ 454 bisulfit. sekvensering [28] for å analysere fire sterkt denaturert CGS som ble metylert ved legemiddelbehandling i HCT116 cellene. I gjennomsnitt fikk vi ca 300 leser per CG (se figur S7). Korrelasjonsanalyse av bisulfite sekvense data og resultater Array (figur 1D) viste en veldig god generell enighet fra begge metoder (r = 0,84). Disse resultatene viser at infinium metylering rekke genererer en nøyaktig gjengivelse av HCT116 metylering mønster i våre forsøk.
Narkotika indusert demetylering mønstre er ikke-tilfeldig
Videre analyser av Array data viste at behandling med AZA resulterte i demetylering (DB≤-0,2) 6% (852 til 13 911) av CGS metylert i kontrollcellene (figur 2A). Viser en enda høyere effekt, DAC behandling indusert demetylering av 11% (1487 av 13911) av disse CG områdene (figur 2B). En Wilcoxon rank sum test bekreftet betydningen av forskjellen mellom metylering i aza- og DAC-behandlede celler (figur 2C,
P
2 × 10
-16). Jo høyere effektivitet av DAC-mediert demetylering på den genspesifikke nivå er konsistent med den globale metylering analyse i HCT116-celler (figur 1 A, B).
metylering forandringer i HCT116-celler behandlet i 24 timer med AZA (A ) eller DAC (B); blå prikker og tallene representerer demetylert CGS (DB≤-0.2). C, boksplott viser fordelingen av metylerte CGS i HCT116 kontrollprøver og celler behandlet med AZA eller DAC; svarte linjer betegne medianer, hakk standardfeil, esker det interkvartile området, og værhår den 2.5th og 97.5th persentiler. D, Venn-diagrammer indikerer overlapp demetylerte CGS i medikamentbehandlede celler.
Basert på observasjonen om at demetylering mønstre syntes å være overraskende bestemt med høy inter-replikere reproduserbarhet, vi lurte på om begge legemidlene har ofte demetylert CG dinukleotider. For å identifisere vanlige demetylerte CGS vi gruppert AZA og DAC gjentak, henholdsvis, og fant en betydelig overlapping av CGS som ble demetylerte av begge legemidler (figur 2D). Denne overlapp var betydelig større enn forventet ved tilfeldig demetylering (
P
2 × 10
-16, Fishers Exact Test), noe som indikerer at bestemte loci er fortrinnsvis demetylert av AZA og DAC. Til tross for den utbredte demethylating aktivitet av AZA og DAC, et betydelig antall CG dinukleotider dukket motstandsdyktig mot legemiddelindusert demetylering i HCT116-celler (figur 2A, B).
Motstand mot legemiddelindusert demetylering er stort sett overvunnet i DNMT1 ; DNMT3B dobbelt knockout celler
For ytterligere karakteriserer CGS motstandsdyktig mot legemiddelindusert demetylering vi hentet metylering profiler fra HCT116-celler med sterkt reduserte nivåer av DNMT1 og fullstendig tap av DNMT3B (DKO celler). Dataanalyse viste markert demetylering i DKO-celler med mer enn 85% av denaturert CGS blir demetylert (figur 3A). DKO-celler viste også den største grad av demetylering representert ved median DB-verdier på mindre enn -0,55 i forhold til kontrollceller (figur 3B). Til sammenligning vi observerte signifikant (
P
mindre enn 2 x 10
-16, Wilcoxon rank sum test). Lavere grader av demetylering for AZA og DAC (figur 3B)
A , DKO celler viser betydelige forskjeller mot HCT116 cellene i deres metylering mønster; blå prikker og tallene representerer demetylert eller hypermethylated CGS (DB≤-0,2 eller ≥0.2). B, boksplott viser demetylering (DB) i medikamentbehandlede HCT16 celler og DKO celler; svarte linjer betegne medianer, hakk standardfeil, esker det interkvartile området, og værhår den 2.5th og 97.5th persentiler. C, Sammenligning av relativ midlere metylering av medikamentbehandlede celler og DKO celler som bestemmes av global genomisk metylering analyse (CE) og infinium metylering analyse. D, Venn-diagrammer indikerer overlapp demetylerte CGS mellom medikamentbehandlede celler og DKO celler.
neste sammenlignet gjennomsnitts metylering nivået av gen-assosiert CGS avledet fra infinium array til global metylering målt ved kapillær elektroforese (CE) (Figur 3C). I tillegg til å infinium metylering analyse, CE utspør også CGS i repeterende elementer som omfatter mesteparten av metylert DNA i det humane genom [34]. Interessant, graden av demetylering av en hel genomisk DNA var alltid høyere enn genspesifikke demetylering. Dette tyder på at CGS i repeterende elementer ble mer effektivt demetylert enn gen-forbundet CGS. Når vi sammenlignet demetylering mønstre av medikamentbehandlede og knockout cellelinjer, fant vi at 92% av CGS demetylerte av AZA og 90% av CGS demetylerte av DAC ble også demetylert i DKO celler (Figur 3D). Men resultatene viser at legemiddelindusert demetylering av spesifikke gener er forholdsvis lite effektiv i forhold til hele genomet, og for å DNMT-manglende celler.
Legemiddelindusert demetylering av kreft-relaterte og bona fide tumorsuppressorgener
Vi neste analysert legemiddelindusert demetylering i et panel av kreftrelatert gener (tilpasset fra Golden Metylering Cancer Panel i, Illumina). Ut av 807 kreftassosierte gener i dette panelet, 784 (representert ved 2,125 CGS) var også til stede på infinium metylering chip. Analysen av de metylering data viste at kreftrelaterte gener var mer sterkt metylert enn ikke-kreft-relaterte gener som er til stede på den infinium plattformen, men ikke på Golden (figur 4A). Videre kreft-relaterte metylering ble sterkt redusert i DKO celler (figur 4A).
a, Median metylering nivåer av kreftrelaterte og ikke-kreftrelaterte CGS i ubehandlede celler (Co), medikamentbehandlede celler (AZA, DAC) og DKO celler. B, Heatmap av CG metylering i kreftassosierte gener. C, Heatmap av hypermethylated bona fide tumorsupressorproteinene-gener i medikamentbehandlede og DNMT knockout celler.
En detaljert analyse viste at av 2125 kreft-assosiert CGS, et sett med 906 CGS ble hypermethylated ( AVB≥0.8) i HCT116 kontrollceller. DAC demetylert disse hypermethylated cancer-assosierte gener med en tilsvarende effektivitet som AZA (figur 4B). Interessant, observerte vi at nesten alle gener ble sterkt demetylert i DKO celler. Lignende resultater ble også oppnådd for et sett av hypermethylated bona fide tumorsuppressorgener (figur 4C). Disse data illustrerer videre evnen til DAC og AZA til demethylate tumorsuppressorgener, og antyder at medikament-indusert generelle genspesifikke demetylering er forholdsvis svak.
Ikke-CG øyer og sterkt metylerte CGS er fortrinnsvis demetylerte
For å begrense vår analyse, vi skilt mellom CGI og ikke-CGI-assosiert CGS. Som forventet [35], [36], CGS i ikke-CGIer var overveiende metylert (3667 av 7513, AVB≥0.8), mens de i CGIer var for det meste unmethylated (12782 av 20002, AVB≤0.2) (figur 5A). I tillegg har vi også observert en fremtredende brøkdel av svært denaturert CGS som var assosiert med CGIer (4527 av 20002, AVB≥0.8), som er konsistent med CGI hypermethylation i kreft [6]. Interessant, våre resultater viser at både AZA og DAC, demetylert en høyere andel av denaturert CGS ikke ligger i CGIer. Nærmere bestemt i HCT116 cellene, AZA demetylert 3,0% (219 av 7224) av denaturert CG dinukleotider i CGIer men 9,5% (633 av 6687) denaturert CGS i ikke-CGIer (figur 5B); DAC demetylert 6,6% (474 av 7224) av CG dinukleotider i CGIer men 15,2% (1013 av 6687) CGS i ikke-CGIer (figur 5C). Vi konkluderer derfor med at CG dinukleotider innenfor CGIer ble fortrinnsvis remethylated etter legemiddelindusert passiv demetylering (
P
2 × 10
-16, Fishers eksakte test).
A, boksplott indikerer forskjeller i metylering mellom CGIer og ikke-CGIer. B, boksplott viser demetylering effektivitet indikert av DB verdier i aza- og DAC-behandlet HCT116-celler er avhengige av CG tilknytning CGIer. For A og B, svarte streker betegne medianer, hakk standardfeil, bokser den interkvartilt rekkevidde, og værhår den 2.5th og 97.5th persentiler. C, boksplott viser demetylering effektivitet som en funksjon av grad av CG-metylering i aza- og DAC-behandlet HCT116-celler. Metylering nivåer ble gruppert i 10% intervaller fra 0 til 100% metylering; svarte merker betegne median, bokser den interkvartilt rekkevidde, og værhår den 2.5th og 97.5th prosentiler.
For å analysere om demetylering effektivitet er en funksjon av graden av CG metylering, gruppert vi CGS av deres metylering nivå i 10 intervaller fra 10% til 100% metylering og bestemt i hvilken grad CGS i ulike intervaller ble demetylert. Våre resultater viser at aza- og DAC-indusert demetylering var mer effektiv for høyt denaturert CGS (metylering intervaller fra 60% til 100% metylering). Betydningen av denne virkning ble videre illustrert ved en analog analyse av demetylering effektivitet i DKO-celler. Her ble CGS av alle metylering nivåer demetylert like godt, som demonstrert av den stadig økende avstand fra sine medianer til grunnlinjen (figur 5D). Vi konkluderer derfor med at AZA og DAC fortrinnsvis føre til demetylering av svært denaturert CG dinukleotider.
Siden ikke-CGI-forbundet CGS viser høyere metylering nivåer enn CGI-forbundet CGS (figur 5A), vi videre analysert om differensial metylering av begge gruppene resulterte i den observerte forskjellen i effektivitet mellom demetylering cGI- og ikke-CGI-assosiert CGS (figur 5B, C). For å oppnå dette, gruppert vi CGS, i henhold til deres metylering nivå i ubehandlede celler, i intervaller med lik metylering og bestemmes demetylering av CGS i CGIer og ikke-CGIer (figurer S3, S4). Denne analysen bekreftet at for metylering nivåer høyere enn 50-60% i HCT116-celler (større enn 20-30% for HL60 celler, se nedenfor), CGS i ikke-CGIer blitt betydelig mer demetylert enn CGS i CGIer.
Legemiddelutløst utløst~~POS=HEADCOMP demetylering i myeloide leukemiceller
Vi søkte å bekrefte våre tidligere funn i en modell mer nært knyttet til den godkjente indikasjon på DAC og AZA. For å oppnå dette, behandlet vi HL-60-myeloid leukemi celler i 24 timer med medikamentkonsentrasjoner som induseres i den sterkeste respons demetyleringen (0,5 uM DAC eller AZA), og igjen som oppnås metylering profiler ved infinium analyse. Resultatene viste at behandling med AZA resulterte i sterk demetylering (DB≤-0,2) 16% (1839 til 11 406) av CGS metylert i kontrollcellene (figur 6A). DAC behandling indusert demetylering på 8% (941 av 11 406) av disse CG områdene (Figur 6B). Metylering nivåer mellom medikament-behandlede celler var signifikant forskjellig (
P
mindre enn 2 x 10
-16, Wilcoxon rank sum test), som beskrevet ovenfor for HCT116-celler, og vi igjen observert en sterk overlapping av CGS demetylert av AZA og DAC (figur S5E). Sammenligningen av CGI-forbundet CGS og ikke-CGI-forbundet CGS viste at CGS i CGIer var mindre metylert enn de i ikke-CGIer, som er i overensstemmelse med våre funn i HCT116 cellene. Også, som tidligere observert i HCT116-celler, AZA og DAC demetylert CGS i ikke-CGIer mer effektivt enn de i CGIer i HL60-celler (figur 6C, D) (
P
mindre enn 2 x 10
– 16, Wilcoxon rank sum test). I samsvar med våre funn i HCT116 cellene, legemiddelindusert demetylering var også mer effektiv for høyt denaturert CGS i HL60 celler (figur 6E, F).
metylering endringer i HL60 celler behandlet i 24 timer med AZA (A) eller DAC (B); blå prikker og tallene representerer demetylert CGS (DB≤-0.2). C, D, boksplott viser demetylering effektivitet indikert av DB verdier i aza- og DAC-behandlede HCT116-celler er avhengige av CG tilknytning CGIer; svarte linjer betegne medianer, hakk standardfeil, esker det interkvartile området, og værhår den 2.5th og 97.5th persentiler. Boksplott viser Demetylering effektivitet som en funksjon av grad av CG metylering i E, aza- og F, DAC-behandlede HL60 celler. Metylering nivåer ble gruppert i 10% intervaller fra 0 til 100% metylering; svarte merker betegne median, bokser den interkvartilt rekkevidde, og værhår de 2.5th og 97.5th prosentiler.
Motstand mot demetylering korrelerer med PRC2 belegg og transkripsjon faktor bindende
Vi endelig vurderes potensialet molekylære mekanismer som kan modulerer legemiddelindusert demetylering effektivitet. Tidligere studier har antydet at spesifikk binding av Polycomb komplekser (PRC2) kan indusere hypermethylation av gene arrangører under tumorigenesis [37], [38]. Følgelig kan PRC2-forbundet regioner være disponert for rask remetylering etter replikering. Dermed tildelt vi genom-wide forening data for SUZ12, EED, og H3K27 trimethylation [39] til de tilsvarende CGS på infinium chip. Vår analyse viser at CGS knyttet til forhørt PRC2 komponentene viser høyere median metylering enn CGS ikke forbundet med PRC2 (figur 7A). Interessant, PRC2-assosiert CGS var betydelig mer resistent mot demetylering av AZA og DAC (figur 7B, C).
A, boksplott viser fordelingen av CG metylering i PRC2-assosiert CGS og ikke-PRC2-assosiert CGS i HL60 celler. B, C, boksplott viser demetylering effektivitet indikert av DB verdier i aza- og i DAC-behandlede HL60 celler avhengig av tilknytning PRC2 komponenter. For A, B og C svarte linjer betegne medianer, hakk standardfeil, bokser den interkvartilt rekkevidde, og værhår den 2.5th og 97.5th persentiler. D, Venn-diagrammer indikerer CGS som ikke blir demetylert (AVB≥0.8) i narkotika behandlet HCT116 og HL60 celler og i DKO celler, henholdsvis. E, Andel demetylering bestandig CGS forbundet med PRC2 komponenter i HCT116 og HL60 celler, og for overlapp CGS av begge cellelinjer (HCT116 HL60). F, Betydningen av anriking av transkripsjonsfaktor bindingsseter i gener med demetylering bestandig CGS i HCT116 og HL60 celler og med CGS som ble metylert ved AZA og DAC i HCT116 og HL60 celler (følsomme for demetylering). Heatmap kolonner representerer log (
P
verdier) for anrikning av 130 transkripsjonsfaktorer.
For å avgrense denne analysen vi senere fokusert på demetylering bestandig CGS. Vi identifiserte et sett av 1129 gen-forbundet CGS som var resistent mot demetylering av AZA og DAC i HL60 celler (AVB≥0.8). Interessant, 75% av disse CGS var også motstandsdyktig mot legemiddelindusert demetylering i HCT116-celler (figur 7D). En detaljert analyse viste at PRC2 komponentene var sterkt anriket på promotorområdene av CGS motstandsdyktig mot demetylering i HCT116 og HL60-celler, så vel som i overlappende motstandsdyktig CGS av begge cellelinjer (figur 7E). For å identifisere ytterligere særtrekk ved demetylering-sensitive og -resistente CGS, vi også analysert om gener husing demetylering bestandig CGS er preget av ulike sett av transkripsjonsfaktor bindende motiver i forhold til gener som blir demetylert. Ved hjelp av verktøy Pscan [29], analyserte vi tilstedeværelsen av bindingsseter for 130 transkripsjonsfaktorer i 644 gener (851 CGS) som var resistente mot demetylering i HCT16 og HL-60-celler og 121 gener (128 CGS) som ble demetylerte i begge cellelinjer etter medikamentbehandling. Analysen viste at demetylering-sensitive og -resistente CGS er knyttet til gener som viser en utfyllende anrikning av transkripsjonsfaktorer bindingssteder (figur 7F, Figur S8). Interessant, de tilsvarende transkripsjonsfaktorer også tilhører forskjellige transkripsjonsfaktor familier (se fig S9). For eksempel bindingssteder av gaffelhodeboks (Fox) transkripsjonsfaktorer er anriket i demetylering sensitive gener, mens grunnleggende Helix-Loop-Helix (bHLH) transkripsjonsfaktor bindingsseter er anriket i demetylering resistente gener. Disse resultatene bekrefter forestillingen om at spesifikke molekylære mekanismer, basert på sekvens sammenheng og kromatin konfigurasjonen, er involvert i reguleringen av legemiddelindusert DNA demetylering.
Diskusjoner
Rollen av DNA metylering i tumor cellebiologi har blitt systematisk analysert i HCT116-celler og DNMT knockout-celler i to tidligere studier [16], [17]. Disse studiene benyttes den indirekte tilnærming av farmakologiske avsløring [40] for å identifisere denaturert gener gjennom endringer i deres transkripsjonen profil. Interessant, Nyere data viser at AZA og DAC indusere ulike sett av gener med bare litt overlapping [41].
