Abstract
Angiogenese og kreft invasivitet stor grad bidra til kreft
Arf6. og dens effektor, AMAP1, er ofte overuttrykt i brystkreft, og utgjør en sentral vei å indusere invasjon og metastasering. I denne veien, er Arf6 aktiveres av EGFR via GEP100. Arf6 er sterkt uttrykt også i menneske navleveneendotel celler (HUVECs) og er innblandet i angiogenese. Her fant vi at HUVECs også svært express AMAP1, og at vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor-2 (VEGFR2) rekrutterer GEP100 å aktivere Arf6. AMAP1 fungerer ved å binde seg til cortactin i kreft invasjon og metastasering. Vi viser at den samme GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin veien er vesentlig for angiogenese aktiviteter, inkludert cellemigrering og rørformet formasjon, samt for forbedring av celle-permeabilitet og VE-cadherin endocytose av VEGF-stimulert HUVECs. Komponenter i denne veien blir sterkt uttrykt i patologisk angiogenese, og blokkering av denne reaksjonsvei hemmer effektivt VEGF- eller tumor-indusert angiogenese og koroidal neovaskularisering. Den GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vei, aktiveres av reseptor tyrosin kinaser, ser ut til å være vanlig i angiogenese og kreft invasjon og metastasering, og gir sine nye terapeutiske mål
Citation. Hashimoto A, Hashimoto S, Ando R, Noda K, Ogawa E, Kotani H, et al. (2011) GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin Pathway hyppig brukt i Cancer Invasion aktiveres ved VEGFR2 å fremme angiogenese. PLoS ONE 6 (8): e23359. doi: 10,1371 /journal.pone.0023359
Redaktør: Toru Ouchi, University of Chicago, USA
mottatt: 25 april 2011; Godkjent: 13 juli 2011; Publisert: 15 august 2011
Copyright: © 2011 Hashimoto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-in-bistand fra departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur fra Japan (MESSC), Takeda Science Foundation, og Mitsubishi Foundation. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
vaskulær endotelial vekstfaktorer (VEGFs) er viktige faktorer involvert i angiogenese [1] – [4]. Et familiemedlem av VEGFs, nemlig VEGF-A, ble opprinnelig oppdaget som en vaskulær permeabilitet faktor [5]; og den primære funksjon av VEGF-signalisering innebærer forsterkning av endotelial-celle-permeabilitet og vaskulær lekkasje [6]. En liten GTPase, Arf6, har vært innblandet i VEGF-signalisering og angiogenese. Det er blitt vist at ekspresjonen av en dominant-negativ form av Arf6, Arf6 (T27N), i humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) hemmer vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor-2 (VEGFR2) -mediert intracellulær signalering, for eksempel Rac1 aktivering [ ,,,0],7]. Konsekvent, undertrykkelse av Arf6 aktivitet via Slit2-Robo4 kjeden blokkerer angiogenese og fremmer vaskulær stabilitet [8]. Imidlertid er mekanismen for hvordan VEGFR2 regulerer Arf6 aktivitet, samt mekanismer som Arf6 funksjoner på angiogenese, og også i andre aspekter av VEGF-signalisering, fremdeles i stor grad forblir unnvikende.
En liten GTPase, Arf6, først og fremst regulerer resirkulering av plasmamembrankomponenter og spiller pleiotrope roller, inkludert membran protrusion og ombygging [9], [10]. Vi har tidligere vist at forskjellige brystcancer-celler som overuttrykker både Arf6 og dens effektor, AMAP1; og at uttrykt Arf6 og AMAP1 da utgjøre en robust signal akse for å indusere invasjon og metastasering [11] – [15]. I invasjon og metastasering, GEP100, en guanin nukleotid leren for ARF GTPases, er hovedansvarlig for Arf6 aktivering, og denne aktivering krever foreningen av GEP100 med ligand-aktivert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) [15]. Patologiske analyser avslørte at komponenter av denne reaksjonsvei er sterkt uttrykt i 40-80% av primære svulster i human bryst [12], [15]. AMAP1 fungerer ved å binde seg til cortactin i kreft invasjon og metastasering. Blokkering av GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin veien ved sirnas eller hemmer effektivt blokkerer brystkreft invasjon og metastase [11] – [13], [15]. Les-outs av denne Arf6 pathway omfatter forstyrrelse av E-cadherin-baserte celle-celle adhesjon [15], ved å fremkalle E-cadherin endocytose (våre upubliserte resultater).
Protein uttrykk for Arf6 er markert utvidet i HUVECs når de dyrkes sammen med VEGF, og i en mus bakben ischemia modell hvor angiogenese er primært avhengig av VEGF [7], [16]. Her fant vi at HUVECs også sterkt uttrykt AMAP1, kan sammenlignes med nivåene observert i svært invasiv brystkreft celler. Vi fant også at GEP100 fysisk forbinder med ligand-aktivert VEGFR2 å aktivere Arf6, og at Arf6 rekrutterer deretter AMAP1. Som kreft invasjon og metastasering, AMAP1 funksjoner ved å binde seg til cortactin i angiogenese. Dette GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reaksjonsvei er viktig ikke bare for VEGF-indusert endotel-cellemigrasjon og rørformet formasjon, men også for VEGF-indusert økning av VE-cadherin endocytose og celle permeabilitet. Komponenter i denne veien blir sterkt uttrykt i CD31-positive fartøy med patologisk angiogenese, og blokkering av denne veien hemmer effektivt patologisk angiogenese. Våre resultater viser at GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin vei, aktiveres av vekstfaktor reseptor tyrosin kinaser, er vanlig i angiogenese og invasjon og metastasering av enkelte brystkreftceller, og dermed gir nye terapeutiske mål for menneskelige lidelser kjennetegnet ved hyper-angiogenese og ondartet kreft utvikling
Materialer og metoder
Cells
HUVECs ble kjøpt fra Iwaki og dyrket i endotelial vekstmedium-2 (EGM2; Lonza)., i henhold til produsentens instruksjon. Merk at EGM2 inneholder en lav konsentrasjon av VEGF, en konsentrasjon som ikke er åpen for publikum. MDA-MB-231 og MCF7 celler, oppnådd fra American Type Culture Collection, ble dyrket som tidligere beskrevet [15]. Cos-7-celler ble dyrket i DMEM med 10% føtalt kalveserum (FCS, Hyclone).
Angiogenese
Kvantifisering av angiogene responser ble utført av den rettede
in vivo
angiogenese analysen (DIVAA, Trevigen), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble 20 ul av VEGF (500 ng ml
-1) eller MDA-MB-231-celler (5 x 10
6 ml
-1) ble injisert i angioreactor rør, som var fylt med basalmembran ekstrakter; og rørene ble deretter implantert subkutant inn i de dorsale deler av nakne mus. Ni dager senere ble rørene samlet og mengdene av Isolectin B4 akkumulert i løpet av basalmembranen ekstraktene ble målt ved anvendelse av en multiplate fluorescens-leser (ARVO, Perkin Eimer), etter proteolytisk fordøyelse av basalmembranen. For siRNA behandling, ble RNA tomannsboliger blandet med AteloGene (Koken), i henhold til produsentens anvisninger; og 200 ul av blandingen ble injisert inn i undersiden av angioreactor rør implantert hos mus, på dag 0 og dag 4. P4-TAT peptid og styre SC peptid ble tilsatt i de angioreactor rørene før implantasjon. Disse studiene ble utført ved Osaka Biovitenskap Institute, og protokollene som brukes for dyreforsøk i denne studien ble godkjent av forsøksdyrutvalget Komiteen Osaka Biovitenskap Institute (Permit nummer: 07-103).
Laser-indusert CNV
CNV ble utført som beskrevet tidligere [17], [18]. En dag før laseren administrasjon, 5 mg kg
-1 P4-TAT eller SC peptid ble injisert intraperitonealt i to måneder gammel mannlig C57BL /6 mus (CLEA Japan). Neste dag Musene ble bedøvet med pentobarbital (0,05 mg g
-1 kroppsvekt) og deres utvidede pupiller med 0,5% fenylefrin og 0,5% tropikamid (Santen). CNV ble indusert med en 532 nm laser (Lumenis Novus Spectra). Fire laserpunkter (200 mW strøm, 75 um punktstørrelse, 100 msek) ble plassert i hvert øye, ved anvendelse av en spalte-lampe avgivelsessystem og et dekkglass som en kontaktlinse. Fremstilling av en boble på tidspunktet for laserbehandling, noe som indikerer brudd på Bruch membran, er en viktig faktor for å oppnå CNV; Derfor, brenner bare i hvilken en boble ble produsert ble inkludert i denne studien. Umiddelbart etter laserbehandling, 5 mg kg
-1 P4-TAT eller kontroll egge peptid ble injisert intraperitonealt hver dag i 7 dager. På eksperimentell dag 8, ble musene bedøvet og perfusert gjennom den venstre ventrikkel med 5 ml PBS etterfulgt av 2 ml av 0,5% FITC-merket dekstran (Mr 2000 kDa, Sigma) i 1% gelatin. Øynene ble enucleated og fiksert i 2% paraformaldehyde i 30 min. Den fremre segment og netthinnen ble deretter fjernet fra eyecup. Om fire til seks avslappende radielle snitt ble gjort, og de resterende retinal pigment epitel (RPE) -choroidal-skleral komplekset ble flatmounted med Vectashield Mounting Medium (Dako) og coverslipped. Flatmounts ble undersøkt med et mikroskop (BIOREVO, Keyence) og bilder av hver CNV ble digitalt lagret. Eyes med blødningskomplikasjoner som glasslegemet blødning eller subretinal blødning forårsaket av laserbestråling ble ekskludert fra evalueringen. Den gjennomsnittlige størrelsen av de lesjoner ble deretter målt, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. med
n
som angitt. De dyreforsøk ble utført i samsvar med Foreningen for forskning i Vision og Ophthalmology erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Visjon Forskning og komiteen for Animal bruk og vedlikehold av Hokkaido University.
VE-cadherin endocytose
VE-cadherin endocytose ble analysert ved VE-cadherin antistoff-bindingsmetode, som beskrevet [19]. I korthet, HUVECs, utplatet med en tetthet konfluent, ble prestarved med EGM2 uten serum i 4 timer, og deretter inkubere med et monoklonalt antistoff BV6 (10 mg ml
-1), som er mot det ekstracellulære domene av VE-cadherin, ved 4 ° C i 1 time. Etter vasking av ubundet antistoff ved å skylle cellene med iskald EGM2, ble cellene deretter inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i nærvær eller fravær av VEGF (50 ng ml
-1). Cellene ble deretter vasket med 25 mM glycin (pH 2,5) inneholdende 3% bovint serumalbumin i 15 min ved omgivelsestemperatur for å fjerne overflate-bundne antistoffer, og fiksert i 4% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,5% Triton X-100 og underkastet til merking av internalisert BV6 molekyler ved anvendelse av et antistoff mot mus IgG konjugert med Alexa Fluor 546 (Molecular Probes). For siRNA behandling, ble cellene preinkubert med RNA tomannsboliger i 48 timer, før plating. For TAT peptid behandling, ble celler inkubert med TAT peptider i 30 minutter ved 37 ° C mellom 4 h sult og merking med BV6. Antall celler som oppviser i det minste en gruppe av fem eller flere syrefast VE-cadherin-positive vesikkel-lignende strukturer ble tellet (n 300). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige forsøk, og statisk analyse ble utført ved hjelp av ANOVA.
Andre metoder
GST-GGA pulldown, immunoprecipitation, immunoblotting, antistoffer og kjemikalier, cDNA, sirnas, transfections, rørformet formasjon, kjemotaktisk transwell migrasjon, to-dimensjonal cellemigrasjon aktivitet immunhistokjemisk farging, celle permeabilitet, immuno-mikroskopi, GST-PH-binding, levedyktighet og RT-PCR er beskrevet i bære Materialer og metoder S1.
Resultatene
VEGF aktiverer Arf6 via GEP100 i endotelceller
Selv om Arf6 aktivitet er innblandet i VEGF signalering og angiogenese, det er ennå ikke vist om VEGF aktiverer Arf6. Vi fant at stimulering av primær kultur av HUVECs ved VEGF faktisk indusert aktivering av endogen Arf6 (figur 1A). Denne aktiveringen var forbigående, nådde 1 min og deretter falt, som observert med andre små GTPases [20]. HUVECs uttrykke overveiende VEGFR2 blant VEGFR-familiemedlemmer. Tyrosinfosforylering av VEGFR2 skjedd innen 1 min, nådde 3 min og gikk ned med 10 minutter etter stimulering (figur 1A).
A, Aktivering av Arf6 og tyrosin fosforylering av VEGFR2 på VEGF stimulering av HUVECs. B, Samutfelling av GEP100 med VEGFR2 på VEGF stimulering av HUVECs, analysert av anti-GEP100 immunoprecipitation (IP) og anti-VEGFR2 immunoblot. PI, pre-immunserum. C-D, Aktiviteter for Arf6 (C), og Erk og Akt (D) i HUVECs transfektert med sirnas for GEP100 eller irrelevante sekvenser (IRR) ved VEGF stimulering. E, Samutfelling av VEGFR2-V5 og dens tyrosinfosforylering mutantene (951F, 1175F og 1214F) med HA-GEP100 uttrykt i Cos-7 celler, analysert av anti-HA (GEP100) immunoprecipitation og anti-V5 (VEGFR2) immunoblot. F, Aktivering av Arf6-HA ved VEGFR2-V5 eller dets mutanter (951F, 1175F og 1214F) ved VEGF stimulering i Cos-7 celler, der ikke-merket GEP100 cDNA ble samtidig transfektert. I A-F, 10 ng ml
-1 VEGF ble benyttet for stimulering i 1 minutt (+) eller i de angitte tidsrom, mens kontroller inkludert celler uten stimulering (0 min eller -). Arf6 virksomhet ble vurdert av GST-GGA nedtrekk metode (A, C, F). Totalt, totalt cellelysatene (20 mikrogram). I A-D, HUVECs ble dyrket i lav serum (0,5% FCS) medium i 16 timer før stimulering. Disse analysene ble utført minst to ganger og representative tall vises.
Selv om signalveier nedstrøms VEGFR2 har blitt grundig studert [21], ingen av dem kunne tolke mekanismene for Arf6 aktivering. Videre, mer enn en enkelt type av GEF kan aktivere Arf6 [22], [23]. Vi søkte å identifisere GEF (e) hovedansvarlig for dette VEGF-indusert Arf6 aktivering. GEP100 binder seg til tyrosin fosforylert EGFR [15]. Vi testet om GEP100 binder seg også til tyrosin fosforylert VEGFR2, og fant at VEGFR2 er kopresipitert med GEP100 i HUVECs endogent, når cellene ble stimulert med VEGF (figur 1B). Vi deretter slått ned GEP100 ved siRNA fremgangsmåten i HUVECs, og fant at dette knockdown i stor grad opphevet VEGF-indusert aktivering av Arf6 (figur 1C og fig S4). Disse resultater antyder at GEP100 er primært ansvarlig for VEGF-indusert aktivering av Arf6 i HUVECs.
VEGF-signalering er kjent for å aktivere Erk og Akt [21]. Stanse av GEP100 påvirker ikke aktivering av Erk og Akt i HUVECs (figur 1D). Disse resultater, sammen med resultatene som er beskrevet ovenfor, bekrefter spesifisiteten av GEP100 i VEGF-signalering, og tyder på at VEGF signalveien som aktiverer Arf6 er uavhengig av det aktiverende Erk og Akt i HUVECs. Videre aktivering av Erk og Akt begge forekommer 10 minutter etter VEGF-stimulering, noe som er mye langsommere enn aktivering av Arf6.
Mode of GEP100 binding til ligand-aktiverte VEGFR2
neste undersøkt den nøyaktige mekanismen som ligand-aktiverte VEGFR2 syssels GEP100. PH domene GEP100 binder seg til visse fosforylerte tyrosinene av EGFR [15]. Vi først undersøkt om dette PH domenet binder også til fosforylerte tyrosinene av VEGFR2. For dette, uttrykte vi V5-merket VEGFR2 i COS-7 celler, og deres lysatene ble revet ned
in vitro
med PH domenet GEP100, smeltet til glutathione-
s
-transferase (GST). Vi fant ut at GST-GEP100 PH domene trekker ned ligand-aktiverte VEGFR2-V5, mens PH domener av ARNO eller fosfolipase Cδ ikke (figur S1). VEGFR2 har 6 store tyrosinene, fosforylerte på VEGF stimulering: Tyr951, Tyr996, Tyr1054, Tyr1059, Tyr1175 og Tyr1214 [21] (se figur S2). Vi syntetiserte disse tyrosin-peptidene i deres fosforylert form, og fant at de GST-GEP100 PH domene bindes til den fosforylerte Tyr951 peptidet, men ikke til de andre fosforylerte peptider (Figur S3). Videre ble det av GST-GEP100 PH domene bindes ikke til den ikke-fosforylerte Tyr951 peptid (figur S3). Vi bekreftet fosforylering av Tyr951 på VEGF stimulering i HUVECs (figur S5).
Basert på disse resultatene, vi da generert en mutant form av VEGFR2-V5, der Tyr951 ble endret til fenylalanin (951F) og uttrykte det i Cos-7-celler sammen med hemagglutinin (HA) -tagged GEP100, og fant at denne mutanten ikke er kopresipitert med HA-GEP100 (figur 1E). Som en kontroll ble bekreftet vi at villtype-VEGFR2-V5 er kopresipitert med HA-GEP100 (figur 1E). Videre mutasjoner av de andre tyrosiner, slik som (henholdsvis 1175F og 1214F,) Tyr1175 og Tyr1214, inn fenylalanin påvirket ikke den ko-utfelling (figur 1E). Vi uttrykte VEGFR2-V5 eller dets mutanter sammen med Arf6-HA og GEP100 i COS7-celler, og målte aktivitetene til Arf6-HA ved bruk av den GST-GGA nedtrekk metoden [24]. Vi fant at 951F mutant av VEGFR2-V5 ikke induserer aktivering av Arf6-HA som respons på VEGF, mens den 1175F og 1214F mutanter, samt villtype VEGFR2-V5, indusere Arf6-HA-aktivering (figur 1F). Disse resultatene indikerer at VEGFR2 fysisk assosierer med GEP100 å aktivere Arf6 på VEGF-stimulering: en assosiasjon som krever bindingen av fosforylert Tyr951 av VEGFR2 og PH domene av GEP100. Vi bekreftet også at Tyr951-fosforylert form av VEGFR2 blir ko med GEP100 fra HUVECs endogent, etter VEGF stimulering (figur S2).
Krav for Arf6 i VEGF-indusert rørformet dannelse og migrasjon
Tubular (eller kapillær-aktig) nettverk dannelsen av HUVECs dyrket
in vitro
er en av kjennemerket prosesser som er nødvendige for angiogenese [1], [2]. For å undersøke involvering av Arf6 i VEGF-indusert angiogenese, vi deretter testet effekten av Arf6 siRNA. Knockdown av Arf6 betydelig svekket VEGF-indusert rørformet formasjon, sammenlignet med kontroll irrelevante RNA-duplekser (IRR) (Figur 2A og figur S4), uten å påvirke cellenes levedyktighet (figur 2B). VEGF-indusert celle trekkfugl aktivitet er et annet kjennetegn på angiogen aktivitet [25]. Arf6 siRNA behandling avskaffet VEGF-indusert trans-migreringsaktiviteter nesten helt, som ble vurdert ved hjelp av modifiserte Boyden kammer [26] (se Figur 2C). VEGF-indusert todimensjonale migreringsaktiviteter, vurdert av sårheling analyse [27], var også nesten helt blokkert av Arf6 siRNA behandling (figur 2D).
HUVECs, behandlet med sirnas for Arf6 eller irrelevante sekvenser ( IRR), ble underkastet den rørformede nettverkdannelse assay i nærvær av 10 ng ml
-1 VEGF (A), til en levedyktighet assay (B), og til en migrering analyse ved bruk av et modifisert Boyden kammer (C) eller ved hjelp av en sårtilheling assay (D) i nærvær og fravær av VEGF (10 ng ml
-1). I A og D, ble analysene utført mer enn to ganger, og representative tall vises. I B, ble mer enn 1 x 10
4 celler scoret i hver analyse. I C, blir data presentert som antall celler observert pr mikroskopisk felt (x 20) som transmigrated Boyden kammer-filter. Seks felt ble telt i hver analyse. Feilsøylene viser gjennomsnitt ± SEM, n = 3. * p. 0,05
Høye nivåer av AMAP1 uttrykk i HUVECs og involvering av GEP100 og AMAP1 i VEGF-indusert angiogene aktiviteter
AMAP1 er et nedstrøms effektor for Arf6, og funksjoner i kreftinvasjon og metastase [12]. De fleste ondartede brystkreftceller med høye invasiv aktiviteter unormalt overuttrykke både Arf6 og AMAP1 proteiner, mens weakly- eller ikke-invasiv brystkreft celler uttrykker kun marginale nivåer av disse to proteiner [11], [12]. HUVECs er kjent for å uttrykke Arf6 på et høyt nivå [7], som vi har funnet å være nesten tilsvarende den som ble observert med sterkt invasive MDA-MB-231 brystkreftceller (figur 3A). HUVECs uttrykker også AMAP1 på et meget høyt nivå, som også kan sammenlignes med MDA-MB-231-celler (figur 3A).
A, Expression of Arf6 og AMAP1 proteiner i HUVECs og dets sammenligning med de i invasiv ( MDA-MB-231) og ikke-invasive (MCF7) brystkreftceller, ved immunoblotting 20 ug av det totale cellelysater ved å bruke antistoffer som angitt. β-aktin ble benyttet som en kontroll. B-E, HUVECs, behandlet med sirnas for GEP100, AMAP1, cortactin eller irrelevante sekvenser (Irr), ble underkastet den rørformede dannelsen assay (B), modifisert Boyden kammer assay (C), sårheling assay (D) eller cellelevedyktighet assay (E), som i figur 2. AMAP2 sirnas ble inkludert som en kontroll (B, E). Disse analyser ble utført minst to ganger, og representative figurer er vist. Feilsøylene viser gjennomsnitt ± standardavvik, n = 3. * p. 0,05
Vi neste undersøkt om GEP100 og AMAP1 er involvert i VEGF-indusert angiogene aktiviteter
in vitro
. Knockdown av GEP100 og AMAP1 hvert betydelig påvirket VEGF-indusert rørformet formasjon, og nesten helt blokkert VEGF-indusert celle trekkende aktiviteter (Figur 3B-3D og figur S4), uten at det påvirker celleviabilitet (Figur 3E). Som en kontroll, vi også slått ned AMAP2 [28] (se figur S4), en nær isoform av AMAP1, og ikke observere en hemmende effekt på rørformet dannelse (Figur 3B).
Krav for cortactin og dens assosiasjon med AMAP1 i VEGF-indusert angiogene aktiviteter
AMAP1 funksjoner ved å danne et kompleks med cortactin i invasiv brystkreft celler [12], [13]. Vi fant at AMAP1 danner et kompleks med cortactin også i HUVECs, og denne kompleksdannelsen signifikant øket når cellene ble dyrket med VEGF (figur 4A). Videre cortactin sirnas effektivt hemmet VEGF-indusert angiogene aktiviteter
in vitro
, uten at det påvirker cellenes levedyktighet (figur 3B og 3E).
A, Samutfelling av cortactin med AMAP1 i HUVECs dyrket i nærvær fra 10 ng ml
-1 VEGF, analysert ved hjelp av anti-AMAP1 immunoutfelling og anti-cortactin immunoblotanalyse, som angitt. PI, pre-immunserum. B-D, HUVECs, dyrket i nærvær av P4-TAT (P4) eller en kryptert celle gjennomtrengelig peptid (SC) ved 10 uM (C, D, F) eller ved konsentrasjoner som indikert (B, E) i 1 time før til analyse, ble underkastet den rørformede dannelsen assay (B), modifisert Boyden kammer assay (C), sårheling assay (D) og celleviabilitet assay (E), som i figur 2, i nærvær av peptidene. Samutfelling av cortactin med AMAP1 i disse cellene ble analysert som ovenfor (F). Totalt, totalt cellelysatene (20 mikrogram). Disse analyser ble utført minst to ganger, og representative figurer er vist. Feilsøylene viser gjennomsnitt ± SEM, n = 3. * p. 0,05
Vi har tidligere utviklet en celle-gjennomtrengelig peptid, nemlig P4-TAT, som blokkerer AMAP1 og cortactin bindende, og dermed hemmer kreft invasjon og metastasering [13]. P4-TAT, men ikke kontrollegge TAT-peptid (SC), blokkert VEGF-indusert angiogene aktiviteter
in vitro
, som rørformet formasjon og cellemigrasjon, på en doseavhengig måte, uten å påvirke cellenes levedyktighet ( Figur 4B-4E). Vi bekreftet at P4-TAT, men ikke SC, endogen blokker binding av AMAP1 med cortactin i HUVECs (figur 4F). Disse resultatene indikerer at AMAP1 funksjoner via sin komplekse dannelse med cortactin i HUVECs, og dette komplekset formasjonen er nødvendig for VEGF-indusert angiogene aktiviteter.
Involvering av Arf6 signalveien i angiogenese
deretter undersøkt om GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin veien er involvert i patologisk angiogenese
in vivo
. For dette, må vi først bekreftet at CD31-positive patologiske fartøy [16] er sterkt positivt for GEP100 og AMAP1 (figur 5A). Antistoffer mot Arf6 gjelder for immunhistokjemi ikke var tilgjengelig. Vi testet GEP100 sirnas og P4-TAT. For dette angioreactor rørene [29], lastet med VEGF eller MDA-MB-231-celler, ble implantert i nakne mus, og 9 dager senere ble de mengder av Isolectin B4 akkumulert i rørene ble målt. MDA-MB-231-celler er kjent for å produsere flere angiogene faktorer [30]. Administrasjon av GEP100 sirnas, forblandes med AteloGene [31], i mus implantert med disse angioreactors hemmet sin angiogenese i en doseavhengig måte, mens et irrelevant RNA dupleks ikke (figur 5B og 5D). P4-TAT, men ikke SC, også inhiberte angiogenese dette på en doseavhengig måte (figur 5C og 5E).
A, Immunhistokjemi av granulasjonsvev og seksjoner arrvev ved anvendelse av de angitte antistoffer. Barer, 100 mikrometer. B-E, Effekter av GEP100 sirnas og P4-TAT (P4) på angiogenese ble målt ved hjelp av angioreactors implantert i hårløse mus, som inneholdt basalmembran ekstrakter og VEGF (500 ng ml
-1) eller MDA-MB-231 celler (1 × 10
5 celler); og mengder av Isolectin B4 akkumulert i løpet av basalmembranen ekstraktene ble målt etter inkubering i 9 dager. sirnas, blandet med AteloGene ved konsentrasjoner som angitt, ble injisert i mus ved dag 0 og dag 4. TAT-peptider ble tilsatt til angioreactors før implantering, ved de angitte konsentrasjoner. Et irrelevant RNA dupleks (Irr) eller en kodet peptid (SC) ble anvendt som kontroller. Feilsøylene viser gjennomsnitt ± standardavvik, n = 8. * p 0,05. F-G, Effekt av P4-TAT på CNV formasjonen. Representative mikrografer av lesjoner i koroidal flatmounts fra et dyr behandlet med P4-TAT eller SC. Rød stiplet linje viser omfanget av lesjoner fylt med FITC-dekstran. Scale bar, 100 mikrometer. Kvantitativ analyse av gjennomsnittlig CNV er vist i G. Feilsøylene viser gjennomsnitt ± SEM, n = 70 til 77. * P. 0,05
Videre undersøkte effekten av P4-TAT på choroidal neovaskularisering (CNV), som er den viktigste årsak til alvorlig synstap hos pasienter med aldersrelatert makuladegenerasjon [32], ved bruk av laser-indusert koroidal neovaskularisering hos mus [17], [18]. P4-TAT eller SC peptid ble injisert intra-peritonealt i mus hver dag fra en dag før laserbehandling til slutten av forsøket. Vi valgte intra-peritoneal administrering i stedet for direkte injeksjon inn i øynene, for å forhindre skade øynene ved den sistnevnte metode. P4-TAT var også effektive i å hemme CNV (figur 5F og 5G).
Involvering av Arf6 signalveien i endothelial permeabilitet og VE-cadherin endocytose
Den primære funksjon av VEGF signalering innebærer å fremme endotelceller permeabilitet og vaskulær lekkasje. VEGF signale induserer endocytose av VE-cadherin, og dette endocytose er avgjørende for styrking av endothelial permeabilitet [33], [34].
Vi deretter undersøkt om GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin veien er også involvert i endothelial permeabilitet og VE-cadherin endocytose. VEGF forbedrer permeabiliteten av intakte HUVECs ved to ganger, målt ved paracellulære bevegelse av dekstran-molekyler [19], [35] (se også figur 6A). Vi undersøkte effekten av sirnas for GEP100, Arf6 og AMAP1 på permeabilitet. For sirnas å være effektive i denne analyse må siRNA behandling startes 36 timer før cellene er re-platet på kamrene for å danne konfluent monolag. Vi fant ut at HUVECs, behandlet med disse sirnas allerede har høye nivåer av permeabilitet selv uten VEGF, og ikke svare på VEGF stimulering til å endre sin permeabilitet, (figur 6A). Deretter ble satsene for endocytose av VE-cadherin, fra plasmamembranen inn i cytoplasma. VEGF akselererer VE-cadherin endocytose av flere folder i intakte HUVECs [19] (se figur 6B og 6C). Som i tilfellet med permeabilitet, HUVECs behandlet med GEP100, Arf6 eller AMAP1 sirnas, alle utstilt høy forekomst av VE-cadherin opptak selv uten VEGF, og ikke svare på VEGF (figur 6B og 6C). Intakte HUVECs utviser VE-cadherin-baserte celle-celle veikryss med høy integritet, mens VEGF stimulering fremkaller deres uregelmessig, uorganisert morfologi [19] (se også figur 6B). Vi fant at VE-cadherin-baserte celle-celle kryss komme i uorden, selv uten VEGF-stimulering, når cellene behandles med disse sirnas (figur 6B). I disse eksperimentene, ble irrelevante og AMAP2 sirnas anvendt som negative kontroller. Disse resultatene tyder på at tapet av disse proteinene forstyrrer cellene for å danne sine intakte celle-celle-adhesjon, og celler med slike uorganisert celle-celle adhesjon er ikke lenger følsom for VEGF regulering.
HUVECs, behandlet med sirnas for Arf6, GEP100, AMAP1 eller et irrelevant sekvens (Irr) (A-C), eller ved P4-TAT (P4) eller SC peptid (D-F), ble underkastet en permeabilitet assay ved å måle paracellulære bevegelse av FITC-dekstran (Mr 40 kDa) (A, D), og til en VE cadherin-opptaksanalyse ved å spore endocytose av celleoverflate-VE cadherin-molekyler (B, C, E, F). I A-C, ble celler forbehandlet med sirnas i 36 timer før utplating. I D-F, ble TAT peptider tilsatt til den konfluente kulturen og inkubert i 30 minutter før analyse. VE-cad, grønn; kjerner, blå. De skala barer representerer 10 mikrometer. Feilsøylene viser gjennomsnitt ± standardavvik, n = 3. * P. 0,05
Vi testet P4-TAT. I motsetning til de siRNA-behandlingene som er beskrevet ovenfor, kan P4-TAT tilsettes direkte til cellekulturer som er sammenflytende og allerede danner normale, intakte celle-celle adhesjon. Vi har funnet at tilsetning av 10 uM P4-TAT til de konfluente kultur blokkerer VEGF-mediert økning av cellen permeabilitet, mens det ikke påvirker permeabiliteten i fravær av VEGF (figur 6D). Likeledes, P4-TAT blokkert VEGF-indusert endocytose av VE-cadherin, mens det ikke føre til internalisering av VE-cadherin i celler dyrket i fravær av VEGF (figur 6E og 6F). VEGF-indusert morfologiske endringer av celle-celle veikryss ble også blokkert av P4-TAT (figur 6E). Disse effektene av P4-TAT var doseavhengig, og styre SC peptidet ikke oppviser slike inhiberende virkninger (fig 6D-6F). Tatt sammen, konkluderer vi at GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin veien er viktig for VEGF regulering av endotelceller permeabilitet og VE-cadherin endocytose. Våre resultater tyder også på at komponenter av denne reaksjonsveien kan i det vesentlige være involvert i dannelsen av intakt endotel-celle-celle-adhesjon, som cellekulturmediet allerede inneholder en lav konsentrasjon av VEGF.
diskusjon
angiogenese og kreft invasjon aksje flere felles egenskaper [36]. Vi har tidligere vist at den GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin veien benyttes for invasjon og metastasering av mange brystkreftceller; og i dette papir, viser vi at denne veien også brukes i angiogenese, inkludert brystkreft-indusert angiogenese og koroidal neovaskularisering. Overekspresjon av Arf6 og AMAP1 proteiner som er nødvendig for effektiv funksjon av denne reaksjonsvei i invasjon og metastase [11], [12]. Både Arf6 og AMAP1 er også uttrykt i høye nivåer i endotelceller, som sett med høyt invasiv brystkreft celler.
