Abstract
14-3-3 proteiner er allestedsnærværende uttrykt dimeriske adapter proteiner som har dukket opp som viktige formidlere av mange cellesignalveier i flere celletyper. Effektene er hovedsakelig mediert av binding til selektive fosfoserin- /treonin proteiner. Betydningen av 14-3-3 proteiner i kreft har bare begynte å bli synlig, og den eksakte rolle i progresjon av kreft, så vel som de mekanismer som 14-3-3 proteiner som medierer kreftcellefunksjon er imidlertid ukjent. Mens protein 14-3-3σ er allment akseptert som en tumor suppressor, har 14-3-3ζ, β og y-isoformer vist seg å ha kreftbringende effekt. Til tross for betydningen av 14-3-3 familie i å mediere forskjellige celleprosesser, er den nøyaktige rollen og mekanismen for 14-3-3ζ forbli uoppdaget. I denne studien undersøkte vi rollen som protein 14-3-3ζ i prostatakreft cellemotilitet og transendothelial migrering ved hjelp av biokjemiske, molekylærbiologi og elektrisk celle-substrat impedans sensing tilnærminger samt cellebaserte funksjonelle analyser. Vår studie viste at uttrykk med vill-type protein 14-3-3ζ betydelig forbedret Rac aktivitet i PC3 celler. I motsetning til ekspresjonen av dimer-resistent mutant av protein 14-3-3ζ (DM-14-3-3) inhiberte Rac aktivitet og tilhørende fosforylering av p21-aktivert kinase-1 og 2. Ekspresjon med vill-type 14-3-3ζ eller konstitutivt aktiv Rac1 forbedret ekstracellulære matrise anerkjennelse, lamellipodia formasjon, cellemigrasjon og trans-endotelial migrasjon av PC3 celler. I kontrast, uttrykk med DM 14-3-3ζ eller DN-Rac1 i PC3 cellene hemmes betydelig disse cellefunksjoner. Våre resultater viser for første gang at 14-3-3ζ forbedrer prostata kreft celle-matriks interaksjoner, bevegelighet og transendothelial migrasjon
in vitro
via aktivering av Rac1-GTPase og er et viktig mål for terapeutiske intervensjoner for prostatakreft .
Citation: Goc A, Abdalla M, Al-Azayzih A, Somanath PR (2012) Rac1 Aktivering Drevet av 14-3-3ζ Dimerisasjon Fremmer Prostate Cancer Cell-Matrix interaksjoner, motilitet og Transendothelial Migration. PLoS ONE syv (7): e40594. doi: 10,1371 /journal.pone.0040594
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 14 mars 2012; Godkjent: 11 juni 2012; Publisert: 13.07.2012
Copyright: © 2012 Goc et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funds var gitt av University of Georgia Research Foundation, Wilson Pharmacy Foundation og UGA College of Pharmacy gjennom egenutført tilskudd til PRS, og delvis av National Institutes of Health stipend (R01HL103952) og American Heart Association Scientist Development Grant (0830326N) til PRS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De sju medlemmene av 14-3-3 familien (også kjent som YWHA proteiner) er kjent for å samhandle med mer enn 100 viktige signalmolekyler i normale celler og kreftceller og regulere et variert utvalg av cellulære prosesser [1] [2]. Generelt, 14-3-3 isoformer bindes til to fosforylering avhengig høy affinitetsbinding motiver som RSXpSXP og RXXXpSXP [3], [4]. Siden protein interaksjoner med denne adapteren protein er avhengig av det samme området på protein 14-3-3 [5], hvorfor 14-3-3 er nødvendig i så mange forskjellige isoformer er en lang stående spørsmålet. Mens alle de 14-3-3 isoformene danner homodimerer
in vivo
, en forklaring på kravet om ulike 14-3-3 proteiner er å danne forskjellige heterodimerer med unike anerkjennelse motiver for bestemte ligander. Men mens flere 14-3-3 isoformer kan danne heterodimerer
in vitro
, en kombinasjon av 14-3-3 ε og ζ er den eneste kjente heterodimer som dannes
in vivo product: [ ,,,0],6].
Mens den globale nedregulering av ekspresjon 14-3-3 medierer tumor suppresjon, ekspresjon av proteiner 14-3-3 er signifikant forhøyet i flere krefttyper [7], [8], [9] , [10], [11], [12]. Mens overekspresjon av 14-3-3 β og γ i NIH 3T3-celler har vist seg å indusere onkogene transformasjon [10], [13], den β, γ, ε, ζ og θ 14-3-3 genekspresjon er blitt vist å være forhøyet i lungekreft alene [14]. Men av alle de 14-3-3 genene, 14-3-3 σ og ζ er mest direkte knyttet til kreft. Protein 14-3-3 σ og f-framprovosere motsatte effekter i mammary epitelceller [15]. Protein 14-3-3σ er tenkt å fungere som en tumor suppressor via indusering av et G2-M cellesyklusarrest i de fleste kreft [16]. Dets ekspresjon er nedregulert i invasive kreftformer urin som blære [17], prostata [18], og eggstokk [19]. I kontrast, økt uttrykk av 14-3-3ζ har en Drosophila homolog av «Leonardo», vært knyttet til økt tumorigenesis og er anslått som en prognostisk markør og terapeutisk mål for kreft [20].
En korrelasjon mellom økt ekspresjon av 14-3-3ζ og forbedret celle overlevelse er blitt rapportert i prostatakreftceller [21]. To uavhengige studier har også antydet et forhold mellom forhøyet ekspresjon av 14-3-3ζ og forekomsten av prostatacancer hos mennesker [22], [23]. Imidlertid er den nøyaktige rollen til 14-3-3s i prostata cancer progresjon i stor grad ukjent. Selv om effekten av 14-3-3s på spredning, cellesyklus og overlevelse av kreftceller er mye studert, om ikke 14-3-3s er nødvendig for migrering av eventuelle kreftcelletyper, og hvilke mekanismer som fører til 14-3 -3-mediert retnings migrering av kreftceller gjenstår å bli bestemt. Våre tidligere undersøkelser i NIH 3T3-celler har vist at proteinet 14-3-3 over-ekspresjon resulterer i aktiveringen av Rac1 og p21-aktivert kinase (Pak) signalveien mediere cellevandring [24]. I denne studien undersøkte vi den spesifikke rollen 14-3-3ζ og dens dimerization i reguleringen av prostatakreft (PC3) celle-matrise interaksjoner, lamellipodia formasjon, bevegelighet på forskjellige ekstracellulære matriks (ECM) proteiner og transendothelial migrasjon via aktivering av Rac1. Våre resultater viser at hemming av 14-3-3ζ kan være en potensiell terapeutisk strategi i prostatakreft.
Resultater
Protein 14-3-3ζ Expression øker med onkogene Transformasjon i prostata kreft celler
Tidligere studier har etablert en sammenheng mellom forhøyet uttrykk for 14-3-3ζ og økt forekomst av prostatakreft hos mennesker [22], [23]. Derfor søkte vi å sammenligne uttrykk nivåer av 14-3-3ζ mellom ulike murine (TRAMP) og prostata kreft cellelinjer. Våre data tyder på at selv om 14-3-3ζ er uttrykt i ikke-tumorigen (TR-C2D) TRAMP (transgene Adenokarsinom i Mouse prostata) cellelinje, er vesentlig høyere i tumorigent (TR-C2) og metastatisk sitt uttrykk (TR- C2N) TRAMP cellelinjer (
p
0,05) (figur 1A og B). Men en betydelig forskjell i 14-3-3ζ uttrykk mellom ikke-metastatisk LNCaP og metastatisk LNCaP c4-2 eller PC3 celler ble ikke observert.
ζ uttrykk øker med onkogene transformasjon i prostatakreftceller. (A) Murine TRAMP (TR-C2D, TR-C2 og TR-C2N), menneskelig hormon responsiv LNCaP samt hormon ufølsomme LNCaP c4-2 og PC3 prostatakreftcellelysatene ble utsatt for western blot komparativ analyse for 14-3- 3ζ uttrykk. (B) Kvantifisering av de ovennevnte data ved bandet densitometry analyse viser økt uttrykk av 14-3-3ζ i prostatakreftceller sammenlignet med ikke-tumorigene murine TRC2D celler. (C-E) PC3-celler ble transfektert med kontroll vektor, WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ og ble utsatt for levedyktigheten (trypan blå-analyse), Proliferation (MTT-analyse) og kolonidannelsesbestemmelsen, respektivt. (*
p
0,001; Δ
p
0,01; #
p
0,05, n = 3).
Det er tidligere blitt vist at 14-3-3ζ dimeriseringen er nødvendig for dets aktivitet i celler [26]. Derfor vi neste undersøkt om uttrykk og /eller dimerisering av protein 14-3-3ζ kan megle prostatakreftcellefunksjoner som spredning, levedyktighet og kolonidannelse. Vår studie viste at overuttrykk av vill type protein 14-3-3ζ (WT-14-3-3ζ) i PC3 cellene betydelig forbedret spredning (
p
0,001), levedyktighet (
p
0,01) og kolonidannelse (
p
0,05), sammenlignet med dem som uttrykker styrevektor bare (figur 1C-E). I kontrast, celler som uttrykker dimer-resistent mutant 14-3-3ζ protein (DM-14-3-3ζ), som hindrer dens dimerisering i PC3 * celler resulterte i signifikant reduksjon i proliferasjon (
p
0,01 ), levedyktighet (
p
0,01) og kolonidannelse (
p
0,01), sammenlignet med de PC3-celler som uttrykker kontroll-vektor (figur 1C-E). Samlet er disse resultatene indikerer at uttrykk og dimerization av 14-3-3ζ er nødvendig for prostatakreft cellefunksjon
in vitro
.
Protein 14-3-3ζ Dimerisasjon Drives Rac1 GTPase Aktivitet i PC3 Cells
Vår forrige undersøkelse i NIH3T3 fibroblaster viste at protein 14-3-3 er nødvendig for aktivering av Rac1 og p21 aktivert kinaser 1 og 2 (Pak 1/2) [24]. I denne studien, bestemt vi om over-uttrykk og dimerisering av protein 14-3-3ζ fører til Rac1-mediert aktivering av Pak1 /2 i prostatakreftceller. Vår studie viste at over-uttrykk for PC3 celler med WT-14-3-3ζ betydelig forbedret Rac1 aktivering som gjenspeiles av den økte nivåer av GTP-bundet Rac1, sammenlignet med kontrollvektor uttrykke celler (
p
0,01) (figur 2A og B). Men uttrykket med DM-14-3-3ζ i PC3 cellene betydelig hemmet GTP-bundet Rac1 nivåer sammenlignet med kontrollgruppen (
p
0,05) (figur 2A og B). Deretter fant vi ut om 14-3-3ζ uttrykk og dimerization er nødvendig for dets interaksjon med Rac1. Våre data tyder på at mens immunoprecipitation av 14-3-3ζ fra PC3 celler uttrykker WT-14-3-3ζ co-utfelt Rac1 (
p
0,01), dette samspillet ble avskaffet ved ekspresjon av PC3 celler med DM-14-3-3ζ (figur 2C og D). Interaksjon mellom 14-3-3ζ og Rac1 i PC3 cellene ble også oppnådd med EGF (
p
0,05). (Figur 2E og F)
ζ uttrykk og dimerization fører til aktivering av Rac1 i prostatakreftceller. (A) WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ ekspresjonsplasmider sammen med styre vektor ble transfektert til PC3-celler og cellelysatene ble underkastet Rac1 aktivitetsanalyse ved hjelp av Pak-PBD-glutation Sepharose-kuler. (B) Kvantifisering av de ovennevnte data ved bandet densitometry analyse som viser en positiv sammenheng mellom 14-3-3ζ uttrykk, dimerisering og Rac1 aktivitet. Barer skildre Rac1 aktivitet målt ved GTP bundet Rac1 nivåer. (C) WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ ekspresjonsplasmider sammen med styre vektor ble transfektert til PC3-celler og cellelysatene ble underkastet immunoutfelling av 14-3-3ζ og ko-utfelling av Rac1 ble analysert . (D) Kvantifisering av de ovennevnte data ved bånd densitometri analyse. Barer skildre Rac1 aktivitet målt ved GTP bundet Rac1 nivåer. (E) serumsultede PC3-celler ble behandlet med 50 pM av EGF i 12 timer, og lysatene ble underkastet immunoutfelling av 14-3-3ζ og ko-utfelling av Rac1 ble analysert. (F) Kvantifisering av de ovennevnte data ved bånd densitometri analyse. Barer skildre Rac1 aktivitet målt ved GTP bundet Rac1 nivåer. (*
p
0,001; Δ
p
0,01; #
p
0,05, n = 3).
Deretter analyserte vi enten 14-3-3ζ-Rac1 interaksjon kan resultere i modulering av Rac1-GTPase aktivitet. I vår studie, over-uttrykk for konstitutivt aktiv Rac1 resultert i forbedret migrasjon av PC3 celler på ulike matrix proteiner. Tilsvarende uttrykk med WT-14-3-3ζ også ført til økt fosforylering av Pak1 /2 (
p
0,001) (figur 3A og B). Siden basale nivåer av fosforylert Pak1 /2 i kontroll vektor transfekterte PC3 celler var for lavt, over-uttrykk med en DN-Rac1 eller DM-14-3-3ζ viste ingen signifikante endringer i Pak1 /2 fosforylering (figur 3A og B ). Mens co-uttrykk for DM-14-3-3ζ med CA-Rac1 i PC3 cellene viste signifikant økning i Pak1 /2 fosforylering sammenlignet med kontrollvektor uttrykke celler (
p
0,001), co-uttrykk av DN-Rac1 med WT-14-3-3ζ betydelig svekket Pak1 /2 fosforylering (
p
0,001). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at aktivering av Rac1 er nedstrøms 14-3-3ζ dimerization.
(A) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L
61) og DN-Rac1 (N
17) ekspresjonsplasmider og vektor, alene eller i kombinasjoner, ble transfektert til PC3-celler og cellelysatene ble underkastet Western-analyse av fosforylert Pak1. (B) Kvantifisering av de ovennevnte data ved bånd densitometri analyse. Barer skildre Pak1 aktivitet som målt ved nivåene av fosforylering. (*
p
0,001; Δ
p
0,01; #
p
0,05, n = 3).
Samspill mellom Protein 14-3-3ζ og Rac1 Forbedrer Matrix Anerkjennelse av PC3 celler
Siden RAC-GTPases er master regulatorer av cytoskeletal ombygging som svar på signaler fra den ekstra-cellulær mikromiljø, studerte vi om modulering av protein 14-3-3ζ-Rac1 signalisering i prostatakreftceller vil ha noen effekt på deres evne til å gjenkjenne og binde seg til ECM proteiner som fibronektin (FN), vitronectin (VN), kollagen i (COLL-i) og laminin (LN ), som er rikelig uttrykt i forskjellige vev som bærer prostatakreftceller. Vår studie viste at mens uttrykk med WT-14-3-3ζ og CA-Rac1 forbedret PC3 celler vedheft til disse ECM proteiner, uttrykk med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 betydelig svekket denne prosessen (figur 4A-D) . Mens nedsatt adhesjon av DM-14-3-3ζ uttrykk ble reddet av co-uttrykk med CA-Rac1, co-uttrykk for WT-14-3-3ζ i DN-Rac1 uttrykker PC3 cellene ikke redde svekket celle adhesjon (figur 4A-D), noe som indikerer at 14-3-3ζ opptrer oppstrøms for Rac1 aktivering i reguleringen av PC3 celle-matriks-vekselvirkninger.
(AD) WT-14-3-3ζ, DM-14-3- 3ζ, CA-Rac1 (L
61) og DN-Rac1 (N
17) ekspresjonsplasmider og vektor, alene eller i kombinasjoner, ble transfektert til PC3-celler og serum-sultet celler ble underkastet celleadhesjon assay på ekstracellulære matriks-proteiner som fibronektin (FN), kollagen type i (COLL-1), Laminin (LN) og vitronectin (VN), henholdsvis, med en celletetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i nærvær av 10 % FBS. Barer skildre antall PC3 celler følges bestemte ECM proteiner. (*
p
0,001; Δ
p
0,01; #
p
0,05, n = 3 av quadruplicates).
Protein 14-3-3ζ-Rac1 Signa Regulerer lamellipodia Dannelse i PC3 celler
Vår videre analyse ved hjelp phalloidin farging av PC3 celler som spesifikt flekker nylig polymerisert aktin cytoskjelettet indikerte at over-uttrykk med WT-14- 3-3ζ eller CA-Rac1 resulterte i forbedret lamellipodia formasjon i nylig spre celler sammenlignet med kontroll vektor som uttrykker ubehandlede PC3-celler i nærvær av 10% FBS (figur 5A). I motsetning til dette uttrykk med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 resulterte i redusert lamellipodia formasjon sammenlignet med kontrollceller (figur 5A). Lignende effekter ble også observert i migrere PC3 celler analysert for phalloidin farging. PC3 celler som uttrykker WT-14-3-3 eller CA-Rac1exhibited forbedret lamellipodia formasjon i forhold til vektor uttrykke celler (figur 5B). Sammen utgjør disse resultatene indikerer at 14-3-3ζ-Rac1 foreningen er involvert i lamellipodia formasjonen i prostatakreftceller.
ζ-Rac1 samarbeid regulerer lamellipodia formasjon i PC3 celler. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L
61) og DN-Rac1 (N
17) ekspresjonsplasmider og vektor, alene eller i kombinasjon, ble transfektert til PC3-celler, sådd ut på cellekulturkamre i nærvær av 10% FBS og låst på 40 minutter (A) eller 16 timer (B) etter plettering. Paraformaldehyde faste celler ble farget med Alexa Fluor (Red) merket phalloidin til å oppdage nylig polymerisert aktin cytoskjelettet og lamellipodia.
Samarbeid mellom Protein 14-3-3ζ og Rac1 Forbedrer EGF-stimulert PC3 Cell Retnings Migrasjon og Transendothelial Migration
Deretter undersøkte vi om 14-3-3ζ spiller en rolle i prostata kreft celle migrasjon. For å gjøre dette transfiserte vi androgen-responsive LNCaP-celler og androgen-insensitive PC3-celler med WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ og underkastet dem for overføring analyse i 24-brønners plater i nærvær og fravær av EGF. Våre resultater viste at ekspresjon av både LNCaP og PC3-celler med WT-14-3-3ζ betydelig forbedret cellevandring i forhold til vektorstyreuttrykkende celler (
p
0,05) i nærvær av EGF, med uttrykk DM-14-3-3ζ medførte redusert cellemigrasjon etter 24 timer (
p
0,01 for PC3 celler og
p
0,05 for LNCaP celler) (Figur 6A og C) . Selv om en tilsvarende trend ble observert i fravær av EGF, dataene var ikke statistisk signifikant (figur 6B og D).
LNCaP og PC3 cellemigrering. (A-D) WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ uttrykk plasmider eller kontroll vektor ble transfektert til LNCaP og PC3 celler. Cellene ble deretter underkastet cellemigrering assay gjennom en ripe laget i monolag av celler. Barer skildre migrasjon av PC3 celler målt ved sin scratch utvinning. (*
p
0,001; Δ
p
0,01; #
p
0,05, n = 4 av quadruplicates).
Neste vi bestemt om 14-3-3ζ-Rac1 samarbeid er nødvendig for transendothelial migrasjon samt retnings migrasjon av PC3 celler som respons på EGF på ulike ECM proteiner som er rikelig i vev huse prostatakreftceller i løpet av de forskjellige stadier av tumorvekst, invasjon, migrering transendothelial og metastasering til vev slik som ben. Vår analyse indikerte at mens uttrykk med WT-14-3-3ζ og CA-Rac1 betydelig forbedret PC3 cellevandring på ECM proteiner som FN, VN, LN, Bone sialoprotein (BSP, osteopontin) og SPARC (Osteonectin), uttrykk med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 betydelig svekket retnings migrasjon av PC3 celler (Figur 7A-F). Tilsvarende, mens uttrykk med WT-14-3-3ζ eller CA-Rac1 betydelig forbedret transendothelial migrasjon av PC3 celler, uttrykk med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 betydelig svekket transendothelial migrasjon av PC3 celler (Figur 8A-C) . Mens svekket PC3 cellemigrasjon av DM-14-3-3ζ uttrykk ble reddet av co-uttrykk med CA-Rac1, nedsatt bevegelighet og transendothelial migrasjon av DN-Rac1 uttrykker PC3 cellene ikke ble reddet av co-uttrykk med WT-14-3 -3ζ (figur 8A-C). Samlet våre resultater viser rolle 14-3-3ζ i formidling Rac1 aktivering nødvendig for PC3 cellemigrasjon og transendothelial migrasjon.
ζ-mediert PC3 cellemigrasjon. (AF) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L
61) og DN-Rac1 (N
17) ekspresjonsplasmider og vektor, alene eller i kombinasjon, ble transfektert til PC3-celler og cellene ble utsatt for cellemigrasjon assay på plast eller ekstracellulære matriseproteiner så som fibronektin (FN), Laminin (LN) og vitronectin (VN), Osteonectin (SPARC-) og Bone sialoprotein (BSP; osteopontin), respektivt . Barer skildre migrasjon av PC3 celler på ulike ECM proteiner målt ved sin scratch utvinning. (*
p
0,001; Δ
p
0,01; #
p
0,05, n = 4 av quadruplicates).
ζ-mediert Rac1 aktivering regulerer PC3 celle transendothelial migrasjon. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L
61) og DN-Rac1 (N
17) ekspresjonsplasmider, vektor kontroll samt en kombinasjon av DN-Rac1 og WT-14-3-3ζ, ble transfektert til PC3 celler og celler ble utsatt for transendothelial migrasjon analysen
in vitro
hjelp ECIS. (C) Analyse av transendothelial migrasjon av PC3 celler på 1,5 timer etter innføringen av celler til endotelceller enkeltlag i ECIS array-chips som viser hvilken rolle 14-3-3ζ dimerization på aktivering av Rac1 i formidling transendothelial migrering av PC3 celler (Δ
p
0,01; #
p
0,05, n = 5)
Diskusjoner
Den primære observasjon fra vår nåværende studien er det. uttrykk med protein 14-3-3ζ i PC3 cellene resulterer i forbedret celle-ECM interaksjoner, lamellipodia formasjon, cellemigrasjon og transendothelial migrasjon via aktivering av Rac1-GTPase. Vi har tidligere rapportert at over-uttrykk for protein 14-3-3β resulterer i forbedret Rac1 og Pak aktivitet i NIH 3T3 celler, noe som resulterer i forbedret inte aktivering, lamellipodia formasjon, cellemigrasjon og ekstracellulære matrise forsamlingen [24]. Vi har også vist at aktivering av Rac1-Pak1 /2 pathway er involvert i onkogene transformasjon av Rotte-1a-celler [25], noe som tyder på at tilsvarende mekanisme ved 14-3-3ζ i kreftceller kan forsterke tumorvekst, migrasjon transendothelial og metastasering. I denne studien, observerte vi at uttrykket med WT-14-3-3ζ i PC3 cellene resultert i forbedret adhesjon og migrasjon på ulike ECM proteiner, som er rikelig i vev som havn prostatakreftceller under flere stadier av tumorcelle invasjon, trans-vaskulær migrasjon og bein metastasering. Men over-ekspresjon av en mutant av 14-3-3ζ (DM-14-3-3ζ), som tidligere har vist seg å forhindre dens dimerisering [26], i PC3-celler har ikke utviser disse effektene, i stedet resulterte i nedsatt celle adhesjon og migrasjon sammenlignet med kontroll PC3-celler. Mens WT-14-3-3ζ uttrykk resulterte i økt lamellipodia dannelse og økt aktivitet av Rac1-GTPase som dokumentert av den forbedrede fosforylering av Pak1 /2, uttrykk med DM-14-3-3ζ motsetning disse effektene. Videre våre data indikerte at dimerisering av protein 14-3-3ζ er nødvendig for aktivering av Rac1, som i sin tur regulerer motilitet og transendothelial migrering av prostatakreftceller. Til sammen viser vår studie en direkte sammenheng mellom protein 14-3-3ζ og Rac1 i reguleringen av ECM interaksjon med PC3 celler, deres bevegelighet og transendothelial migrasjon, og som hindrer dimerization av 14-3-3ζ kan hemme disse effektene.
Selv om rollen av 14-3-3 proteiner i celleoverlevelse og proliferasjon er blitt grundig undersøkt, den spesifikke rollen til 14-3-3s i regulering av celle-matriks interaksjoner, motilitet og transendothelial invasjon og de molekylære mekanismer regulering av prosessen er ikke klart forstått. Cell-matrix interaksjoner og migrasjon er de viktigste egenskapene til de metastatiske kreftceller, og det første trinnet i denne prosessen innebærer cytoskeletal ombygging, hovedsakelig styrt av små Rho GTPases [27] .To uavhengige studier identifisert protein kinase D (PKD) som kandidat protein forbundet med F-aktin dannelse og samvirker med 14-3-3 i reguleringen av cytoskeletal sammenstillingen [28], [29]. Men PKD var involvert i en negativ regulering av aktiv cytoskeletal ombygging i forkanten med over-uttrykk for konstitutivt aktiv PKD resulterer i nedsatt cellemigrasjon via aktivering av RhoA. Andre mekanismer som har vært innblandet i den 14-3-3-mediert cellemigrasjon inkludere dens involvering i inaktivering av cortactin, en actin-bindende protein, via PKD-mediert fosforylering ved Ser298, som fører til inhibering av cellemigrering [30].
studier i løpet av det siste tiåret har avdekket viktigheten av 14-3-3 proteiner i positiv regulering av cellemigrasjon involverer Rac1-GTPases. Initial bevis på 14-3-3 og Rac1 Foreningen ble først rapportert i en CHO cellemodell [31]. Vårt laboratorium har tidligere vist at 14-3-3β aktiverer Rac1 og Pak1 signalering i reguleringen av NIH 3T3 celle-matrix samhandling, migrasjon og ekstracellulære matrix montering via affinitet moduler av integrin α
5β
1 [24]. Vi viste også at uttrykket med 14-3-3β resultater i translokasjon av Rac1 til membran ruffles styrke Pak1 aktivitet og lamellipodia formasjon i NIH3T3. Etter dette, en nyere studie indikerer at 14-3-3 styrer celle mekanikk og cytokinese i
Dictyostelium
via samordning av Rac1 aktivitet, myosin II og mikrotubuli [32]. Men det er ingen andre rapporter om foreningen av 14-3-3 og Rac1-GTPases i regulering av cellevandring av eventuelle kreftceller. I denne studien, våre resultater viser at over-uttrykk for WT-14-3-3ζ resultater i lamellipodia dannelse i spredning og migrere PC3 celler som ligner på konstitutivt aktiv Rac1 uttrykker celler. I motsetning til dette, DM-14-3-3ζ inhiberte lamelipodia formasjon. Våre resultater fra Rac1 aktivitetsanalyse og fosforylering av Pak1 /2, en nedstrøms substrat av RAC-GTPases, både indikerte at 14-3-3ζ aktiverer Rac1. Videre er det faktum at ko-ekspresjon med DM-14-3-3ζ ikke hemme fosforyleringen av Pak1 /2 mediert av ekspresjon med CA-Rac1 indikerer at 14-3-3ζ dimerisering er oppstrøms Rac1 aktivering. Selv om den eksakte mekanismen som 14-3-3ζ regulerer Rac1 aktivitet i prostatakreftceller er ikke klart fra våre resultater, vil en mulig mekanisme være samspillet av 14-3-3ζ med en av sine guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEF) og sin leveranse til Rac1 resulterer i sin aktivering.
blant de 14-3-3 isoformene, forbedret uttrykk for 14-3-3ζ har vært innblandet å utvikle svulst resistens mot kjemoterapi narkotika, inkludert prostata kreft [21], [33]. I motsetning til dette, nedregulering av ekspresjon 14-3-3 sensitizes kreftceller overfor kjemoterapeutiske medikamenter [2], [20], inkludert prostata kreft [21], impliserer det terapeutiske potensialet av 14-3-3ζ for kreftterapi. Nylige fremskritt innen siRNA basert knockdown av 14-3-3 proteiner samt peptid-inhibitorer forhindrer dimerisering av 14-3-3 for eksempel R18 (difopein, en dimer av R18) [34] eller lavmolekylære forbindelser slik som FOBISIN 101 [35 ] viser løfte om å utvikle anti-14-3-3 behandling for kreft.
i konklusjonen, identifiserer vi 14-3-3ζ og Rac1 som nye partnere i veien regulerer prostatakreft celle-matriks interaksjoner, motilitet i respons til invasive og metastatiske stimuli, så vel som for intravasation av prostatakreftceller. Våre resultater indikerer at 14-3-3 er et potensielt mål for terapeutiske intervensjoner i prostatakreft.
Metoder
reagenser, cellelinjer og antistoffer
Menneskelig PC3, LNCaP og LNCaP c4-2-celler (ATCC, Manassas, VA) ble anvendt og opprettholdt i DMEM-høy glukose (HyClone, Thermo Scientific, Logan, UT) med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Murine TRAMP (TR-C2D, TR-C2 og TR-C2N) celler ble begavet av Dr. Barabara Foster, Baylor College of Medicine, TX. Primære antistoffer mot fosfor-Pak1 /2 Ser144 /142, 14-3-3ζ og pan-protein-14-3-3 ble kjøpt fra Cell Signaling (Boston, MA). Anti-Rac1 antistoffer, fibronektin og laminin ble oppnådd fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Primære antistoffer mot β-actin ble innkjøpt fra Sigma, St. Louis, MO. Alle sekundære antistoffer ble oppnådd fra Bio-Rad (Hercules, CA). Alexa Fluor555-merket phalloidin ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Osteopontin (Bone sialoprotein), osteonectin (SPARC) og vitronectin ble kjøpt fra R . D Systems (Minneapolis, MN)
Transient transfections
Menneskelige PC3 celler ble transient transfektert med pEBG plasmider WT 14-3-3ζ (GST tagget), DM-14-3-3ζ (dimerization bestandig 14-3-3ζ-GST tagget, 14-3-3 E5K, L12AE til Q12QR, Y82Q, K85N og E87Q), CA -Rac1 (Rac1-L
61), og DN-Rac1 (Rac1-N
17) konstruerer, henholdsvis, eller i kombinasjoner av WT-14-3-3ζ med DN-Rac1 (Rac1-N
17) konstruerer og DM-14-3-3ζ med CA-Rac1 (Rac1-L
61), ved hjelp av lipofektamin 2000 Invitrogen (Carlsbad, California) transfeksjon reagens i henhold til produsentens protokoll. Protein 14-3-3 konstruksjoner, opprinnelig generert av Joseph Avruch lab, ble Massachusetts General Hospital i Boston hentet fra Addgene, Cambridge, MA. Kontrollceller ble transient transfektert med tom vektor pBabe-puromycin. Omtrent 70-80% transfeksjon effektivitet ble oppnådd.
Rac1 Aktivering analysen
Rac1 aktivitet ble målt ved hjelp av en Rac aktivitetsanalyse kit fra Cytoskjelett (Denver, Colorado) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, den PBD domene av PAK sammensmeltet til glutation
S
-transferase (GST) og konjugert med glutation-Sepharose 4B kuler ble blandet med 1 mg av totalt protein i lysat fra PC3-celler transient transfektert med WT-14- 3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1, eller DN-Rac1 plasmider eller i kombinasjoner av CA-14-3-3ζ med DN-Rac1 og DM-14-3-3ζ med CA-Rac1, etterfulgt ved inkubering ved 4 ° C i 1 time. Perlene ble oppsamlet ved sentrifugering og ble vasket tre ganger med vaskebuffer med 1X Complete proteasehemmere (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) og to ganger med 1 x PBS. Proteiner ble eluert ved koking perler i 2X Laemmli prøvebuffer (BioRad, Hercules, CA) i 5 minutter, separert på en 12% SDS-polyakrylamidgel og blottet med antistoffer Rac1.
trypanblått Levedyktighet Assessment
Celler ble dyrket til konfluens i DMEM med 10% FBS. Cellene ble sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 5 x 10
3 celler /100 ul i DMEM og tillates å følge natten over. Etter dette ble cellene transfektert med respektive plasmider og dyrket i 48 timer. Celler ble deretter dyrket i ytterligere 24 timer i serumfrie forhold. Cellene ble så høstet ved trypsinering, farget med en trypan blått-oppløsning (0,04% vekt /volum, Invitrogen, Carlsbad, CA) og tellet ved bruk av hemocytometer. Totale celler og trypan blue-farget (dvs. ikke-levedyktige) ble cellene tellet, og prosentandelen av ikke-levedyktige celler ble beregnet.
Cell Proliferation Assay
spredning av PC3 cellelinjer ble bestemt ved anvendelse av ikke-radioaktivt BrdU-baserte analysen celleproliferasjon (Roche Applied Science) i henhold til produsentens protokoll. Kort sagt ble transfekterte PC3-celler sådd ut i 96-brønners flatbunnede plater ved en tetthet på 5 x 10
3 celler pr 100 ul og tillatt å vokse i 48 timer. Celler ble deretter dyrket i ytterligere 24 timer i serumfrie forhold. PC3 Cellene ble deretter utsatt for en 5-brom-2-deoksyuridin-analyse ved hjelp av BrdU-merking og Detection Kit III (Roche Applied Science) i henhold til produsentens protokoll. BrdU-inkorporering i DNA ble bestemt ved å måle absorbansen ved både 450 og 690 nm på en ELISA-plateleser. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik
Colony Forming Assay
kolonidannelse analysen ble utført ved anvendelse av standardprotokollen [36].
