Abstract
Bakgrunn
Bukspyttkjertel nevritt er en histopatologisk kjennetegn på bukspyttkjertelen nevropati og relaterer til mage nevropatisk smerte sensasjon i bukspyttkjertelen adenokarsinom (PCA) og kronisk pankreatitt (CP). Men inflammatorisk celleundertyper som komponerer bukspyttkjertelen nevritt og deres korrelasjon til nevropatisk smerte syndrom ved PCA og CP er ennå ukjent.
Metoder
inflammatoriske celler i bukspyttkjertelen nevritt lesjoner hos pasienter med PCa (n = 20) og CP (n = 20) ble immunolabeled og kolorimetrisk kvantifisert med pan-leukocytter markør CD45, med CD68 (makrofager), CD8 (cytotoksiske T-lymfocytter), CD4 (T-hjelpeceller), CD20 (B-lymfocytter ), NCL-PC (plasmaceller), nøytrofil elastase, PRG2 (eosinofile), anti-mast celle (MC) tryptase og korrelert til smerte sensasjon. Perineural mastcelle undergrupper ble analysert ved å dobbelt immunolabeling med MC chymase. Ekspresjon og neural immunoreaktivitet av protease-aktivert reseptor type 1 (PAR-1) og type 2 (PAR-2) ble analysert i PCa og CP og korrelert til smerte status av pasientene.
Resultat
ved PCA og CP, nerver ble hovedsakelig infiltrert av cytotoksiske T-lymfocytter (PCA: 35% av alle perineural betennelsesceller, CP: 33%), makrofager (PCA: 39%, CP: 33%) og MC (PCA: 21%, CP: 27%). I begge enhetene, ble nevropatisk smerte sensasjon forbundet med en bestemt økning på perinevral MC (PCA uten smerter: 14% vs. PCa med smerte: 31%; CP uten smerter: 19% vs. CP med smerte: 34%), ikke påvirker hyppigheten av andre inflammatoriske celle-undertyper. De aller fleste av disse MC inneholdt MC chymase. PAR-en og PAR-2 uttrykk korrelerte ikke til smerten følelsen av PCA og CP-pasienter.
Konklusjon
Bukspyttkjertel nevritt i PC og CP er sammensatt av cytotoksiske T-lymfocytter, makrofager og MC. Den spesifikke anrikning av MC rundt intrapancreatic nerver i nevropatisk smerte på grunn av PCa og CP antyder tilstedeværelsen av MC-indusert visceral hypersensitivitet i bukspyttkjertelen. Derfor bukspyttkjertelen og tarm neuropathies synes å dele en lignende type neuro-immune samhandling i generasjonen av visceral smerte
Citation. Demir IE, Schorn S, Schremmer-Danninger E, Wang K, Kehl T, Giese NA, et al. (2013) perinevral mastceller er spesielt beriket i bukspyttkjertelen nevritt og nevropatiske smerter i bukspyttkjertelkreft og kronisk pankreatitt. PLoS ONE 8 (3): e60529. doi: 10,1371 /journal.pone.0060529
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 15. desember 2012; Godkjent: 27 februar 2013; Publisert: 28 mars 2013
Copyright: © 2013 Demir et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betennelse og kreft henger sammen i den generasjonen, kurs og utfallet av menneskelige kreftformer. En spesiell og unik undergruppe av kreft-relaterte inflammasjon påtreffes rundt nerver i pankreatiske tumorer, spesielt i kreft i bukspyttkjertelen (PCA) og i den inflammatoriske bukspyttkjertelen hodet tumor assosiert med kronisk pankreatitt (CP). Faktisk begge disse tumorer ofte inneholde brenn inflammatoriske cellegrupper i området rundt intrapancreatic nerver [1], [2]. I sin brytende elektronmikroskopstudie på nervene i CP, Dale Bockman rapportert på tilstedeværelsen av alvorlige skader i slike nerver som ble spesifikt infiltrert av inflammatoriske celler [3]. Senere studier gjort den avgjørende bidrag knyttet til viktigheten av denne målrettede neural immuncelleinfiltrasjon betegnes
bukspyttkjertelen nevritt
i PCA og CP pasienter: Økt frekvens og alvorlighetsgrad av bukspyttkjertelen nevritt har vist seg å bære en større sammenheng med alvorlighetsgraden av magesmerter sensasjon og neuroplastic endringer ved PCA og CP pasienter [1], [4], [5].
Mekanismer av bukspyttkjertelen nevritt gjenstår å bli belyst. Når det gjelder de inflammatoriske mediatorer er involvert i bukspyttkjertelen nevritt, interleukin-8 (IL-8), neuronal chemokine fractalkine og dens reseptor CX3CR1 har vist seg å være overuttrykt i nervene i CP vev, og øker endoneural fractalkine nærvær ble påvist å korrelere til alvorlighetsgraden av bukspyttkjertelen nevritt, vev makrofag infiltrasjon og smerte sensasjon [6] -. [8]
den nøyaktige subtyper og karakteristikker av immunceller infiltrere bukspyttkjertelen nervene er ennå ukjent. I den eneste studien knyttet til dette spørsmålet, Keith et al. vist i en halvkvantitativ måte økt tilstedeværelse av eosinofiler rundt nerver i CP og sammenhengen mellom smerteopplevelsen og graden av perinevral eosinofil infiltrasjon [9].
En bedre forståelse av egenskapene til perinevral inflammatoriske infiltrat cellen ved PCA og CP er sannsynlig å tillate en dyp innsikt i mekanismene for bukspyttkjertelnervesmerter. Derfor, i denne studien, vi sikte på å gi en systematisk kvantitativ karakterisering av pankreas nevritt-assosiert inflammatorisk cellegruppene ved PCA og CP. For dette formål, kvantifisert vi peri- og endoneural leukocytter i normal human bukspyttkjertel (NP), PCA og CP. Videre undersøkte vi den kvantitative fordeling av et stort panel av leukocytt-undergruppe markører i PCa og CP vev, inkludert CD68 (makrofager), CD8 (cytotoksiske T-lymfocytter), CD4 (T-hjelperceller), CD20 (B-lymfocytter), NCL-PC (plasmaceller), nøytrofil elastase, proteogylcan 2 /PRG2 (eosinofile) og anti-mastceller (MC) tryptase og chymase innen nevrale inflammatorisk klynger. Til slutt, korrelert vi mengden av disse nerve inflammatoriske celle-undergrupper, og ekspresjonen av to potensielle reseptorer (protease-aktivert-reseptor /PAR-1 og PAR-2) for MC-avledede proteaser til nevropatisk smerte følelse av PCa og CP pasientene .
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av etikkomiteer ved Technische Universität München, München, Tyskland og Universitetet i Heidelberg, Tyskland.
pasienter og vev
bukspyttkjertelen vevsprøver for immunhistokjemi ble samlet fra pasienter etter bukspyttkjertelen hodet reseksjon for kreft i bukspyttkjertelen (PCA, n = 20, mann /kvinne = 8/12, median alder = 66 år ) og kronisk pankreatitt (CP, n = 20, til mann /kvinne = 13/7, median alder = 51 år). Alle pasientene ble informert, og skriftlig samtykke ble innhentet for vev samling. Ifølge den internasjonale klassifiseringen av UICC (2009), hadde alle pasientene stadium IIb bukspyttkjertelkreft. Årsakene til CP var alkoholiker i alle pasienter. På grunn av hyppig observert samtidig betennelsesprosessen ved reseksjonskanten av pankreas vevsprøver, ble normale bukspyttkjertel vevsprøver hentet fra friske organdonorer (NP, n = 10; mannlig /kvinnelig = 6/4, median alder = 38 år) når det var ingen passende mottaker for transplantasjon tilgjengelig. Vevet samlingen ble godkjent av etikkomiteer ved Technische Universität München, München og Universitetet i Heidelberg, Tyskland. De resected bukspyttkjertelen vevsprøver ble delt inn i deler som umiddelbart ble løst i 4% paraformaldehyde fulgt av parafin-embedding, som beskrevet tidligere [1], [10].
Magesmerter
I alle PCA og CP-pasienter, enkelte smertestatus (Pain vs No Pain) og den enkelte smerteskår (smerteintensitet og frekvens) ble prospektivt registrert før operasjonen, som tidligere beskrevet [2]. Smerteintensitet ble gradert ved hjelp av en kort skala: 0 = ingen, 1 = mild, 2 = moderat og 3 = sterk smerte. Smerte frekvens ble gradert som 3 = daglig, 2 = ukentlig og 1 = månedlig. For å beregne graden av smerte, ble smerteintensitet og smerte frekvensen for hver enkelt multiplisert. Ifølge den siste smerteskår, ble pasientene delt inn i tre undergrupper: Smerte jeg (0) representerer den gruppen av pasienter uten smerte, smerte II (1-3) pasienter som led av mild smerte og smerte III (4-9), med moderat til alvorlig smerte
Immunohistochemistry dobbel immunfluorescens merking
Påfølgende 3 um seksjoner fra parafininnstøpte NP, PCA og TF-prøver ble analysert for pan-neuronal markør Protein Gene Product 9,5 (PGP 9,5) og for inflammatoriske celleoverflatemarkører inkludert klynge av differensiering 45 (CD45) som pan-leukocytt markør, CD8 som markør av cytotoksiske T-lymfocytter, CD4 å merke T-hjelpe lymfocytter, CD68 som markør av makrofager, nøytrofile elastase (NE) for nøytrofile granulocytter, CD20 for B-lymfocytter, NCL-PC for plasma -celler, for å PRG2 for eosinofiler og anti-mastceller (MC) tryptase og anti-MC chymase identifisere mastceller. Den protease-aktivert reseptor type 1 (PAR-1) og type 2 (PAR-2) ble immunolabeled i flere på hverandre følgende seksjoner. Snittene ble inkubert med primære antistoffer ved de angitte fortynninger over natten i et fuktig kammer ved 4 ° C (tabell 1). De negative kontrollene ble inkubert med det samme IgG eller IgM subklasse ikke-immuniserte antistoffer. Primære antistoff fortynninger ble utført med normalt geiteserum. Alle antigener ble oppdaget gjennom DAKO Envision System-HRP (Hamburg, Tyskland) eller ved Alexa Fluor
® 488 og 594 antistoffer (Invitrogen, Tyskland) for de samsvarende arter. DAB ble brukt som kromogen. Digital bildebehandling ble utført med Keyence Biorevo BZ-9000 system (Keyence, Neu-Isenburg, Tyskland).
Kvantitativ analyse av inflammatorisk cellefordeling rundt nerver
For å bestemme mengden av betennelsesceller subtyper rundt intrapancreatic nerver ble immunostained området okkupert av hver celle subtype innen nevrale inflammatorisk cellegruppene målt via ImageJ programvare (ImageJ 1.36b, Wayne Rasband). For dette formålet, fra hver del av en pasient, mellom tre til fem nerver demonstrerer bukspyttkjertelen nevritt ble først identifisert og deretter fotografert ved hjelp av en sammenhengende PGP9.5-farget del og en påfølgende hematoxylin-eosin-farget delen. Pankreatisk nevritt ble histologisk definert og identifisert som «en klynge av nevrale inflammatoriske celler som er i kontakt med perineurium og /eller endoneurium og kan tydelig avgrenset fra den gjenværende generelle vev inflammatorisk infiltrat celle». Etter omdannelse av RGB-bilde til et 8-bits bilde, ble terskelfunksjon brukt for å definere en fase ved hjelp av en forhåndsinnstilt terskel som utelukkende etiketter det areal som opptas av immunfargete neurale inflammatoriske celler, og programvaren fastsettes automatisk den absolutte og prosent-området av denne fasen på hvert bilde, som også tidligere beskrevet [10]. De absolutte områdene målt på hvert bilde for immunoreaktivitets av CD8, CD4, CD68, CD20, NCL-PC, PRG2, NE, anti-MC-tryptase og -chymase ble så knyttet til at for CD45 som pan-leukocytter markør for å bestemme fordelingen av inflammatoriske celleundergrupper i bukspyttkjertelen neuritt cellepopulasjon. Den fotografering og påfølgende kvantitativ analyse ble utført av tre observatører (SS, IED og ESD) blindet for kliniske og immunhistokjemiske data, som beskrevet tidligere [1].
Sanntids Lys Cycler® Kvantitativ-Polymerase-kjede- reaksjon (QRT-PCR)
Utvinning av mRNA fra bukspyttkjertelen vev ble utarbeidet ved hjelp av TissueLyser II og RNeasy pluss kit (Qiagen /Hilden) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble RNA mengde og renhet bestemmes ved hjelp av Nanodrop ND1000 (Peqlab /Erlangen). Første cDNA syntese ble utført med Transcriptor-First-Strand cDNA Synthesis kit (Roche /Mannheim) i henhold til produsentens instruksjoner. Ekspresjon av protease-aktivert reseptor type 1 (PAR-1, Genebank, GeneID: 2149), protease-aktivert reseptor type 2 (PAR-2, Genebank, GeneID: 2150) og av referansehusholdningsgenet cyklofilin-B (CypB , genbanken, GeneID: 5479) ble målt med Roche LightCycler-480 real-Time PCR System og LightCycler-480 SYBR Grønn jeg Master kit. I henhold til den Pfaffl metoden [11], ble relative uttrykk basert på den midlere krysningspunktet avvik mellom de 3 prøver normalisert til gjennomsnittet krysningspunktet avvik for referansegenet, etter å ha effektivitet korrigering av PCR-reaksjoner. Den relative ekspresjon av PAR-1 og PAR-2 i prøvene ble deretter normalisert til et nivå på normale humane bukspyttkjertel (NP). Alle primere ble hentet fra Sigma-Aldrich.
Kvantifisering av nevrale immunoreaktivitets for PAR-en og PAR-2
På hver seksjon, var gjennomsnittlig nevrale immunoreaktivitets for PAR-en og PAR-2 ble bestemt ved ImageJ basert kolorimetri, som også vist tidligere [10]. Kort sagt ble immunolabeled nerver med bukspyttkjertel neuritt fra hver seksjon med PCa eller CP photomicrographed og utsatt for terskelfunksjonen i programmet etter omdannelse til en 8-bits bilde. Den prosent immunostained område i hvert nerve ble bestemt ved programmet etter innstillingen en definert terskel i nerver som regioner av interesse for hver farging (dvs. PAR-1 og PAR-2) og tilsvarte nevrale immunreaktivitet. Gjennomsnittlig immunoreaktivitets av hver pasient ble beregnet ved å bestemme den gjennomsnittlige nevrale immunoreactivitiy av alle nerver med bukspyttkjertel nevritt i hver pasient.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5 programvare (La Jolla, CA, USA). For multiple sammenligninger og på grunn av den gjensidige avhengighet av de målte celleundergruppe områder og prosenter i en gitt befolkning nevritt, Friedman test, etterfulgt av Dunn post hoc test ble anvendt. Spesielt ble denne testen anvendt for sammenligning av de immunreaktive områdene av inflammatorisk celleundergrupper, og også for å sammenligne deres relative (prosent) porsjon i hver neuritis populasjon. For analyse av PAR-1 og PAR-2 ekspresjon mellom NP, PCa og CP, og for korrelasjon av neural invasjon med perinevral mastcelleinfiltrasjon ble Kruskal-Wallis-test i forbindelse med Dunn sin post hoc test anvendt. For sammenligning av immunoreaktiviteter for hver inflammatorisk celle-undertypen, og av PAR-1 og PAR-2 neuro-immunoreaktiviteter og ekspresjonsnivåer mellom pasienter med smerte og pasienter uten smerte, ble Mann-Whitney U-test anvendt. For disse to-gruppe smerte analyser, ble det uparede t-test i tillegg benyttes for å bekrefte de observerte forskjellene. For mastcelle undergruppe analyse involverer tryptase-chymase samlokalisering frekvens, ble Fishers eksakte test brukt. Resultatene er uttrykt som median (Minimum; Maximum), bortsett fra mRNA ekspresjon data som ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Tosidige p-verdier var alltid beregnet, og en effekt ble vurdert som statistisk signifikant på
p
-verdi ≤ 0,05.
Resultater
Intrapancreatic nerver ved PCA og CP er hovedsakelig infiltrert av cytotoksiske T-lymfocytter, makrofager og mastceller
Siden hovedmålet med denne studien, kvantifisert vi mengden av leukocytter og leukocytt subpopulasjoner i bukspyttkjertelen nervesmerter. For dette formål ble det areal som opptas av hver enkelt leukocytt-undertype kvantifisert via kolorimetrisk analyse og uttrykt i um
2. I PCA ble bukspyttkjertelen nevritt immuncellepopulasjon i hovedsak består av CD68
+ makrofager [39,87% (10,15; 64,88) av alle perineural betennelsesceller, 2545 nm
2 (665,9; 22 012)], etterfulgt av CD8
+ cytotoksiske T-lymfocytter [33,20% (21,06; 54,11), 2623 mikrometer
2 (586,5; 21 092)] og mastceller [MC, 14,46% (0,28; 52,10), 1106 mikrometer
2 (21,51; 16 090), Figur 1A-C]. Viktigere, alle andre store inflammatorisk cellepopulasjoner var tilstede i knapt påviselige mengder [CD20
+ B-lymfocytter: 0,79% (0,10; 13,84) og 76,84 nm
2 (3,06; 2598); CD4
+ T-hjelpeceller: 1,61% (0,39; 28,45) og 83,03 nm
2 (13.55, 2962); NCL-PC
+ plasmaceller: 1,87% (0,01; 10,54) og 140,9 nm
2 (0,31; 986,9); PRG2
+ eosinophils: 0,49% (0,10; 19,77) og 38.71 pm
2 (9,93; 888,8); Figur 1A-C)]. Den prosent fordelingen av leukocytter subpopulasjoner i bukspyttkjertelen nevritt ved PCA er avbildet i figur 1C.
(A) i bukspyttkjertelen nevritt ble identifisert ved hjelp av et hematoksylin-kontra delen som ble immunolabeled med pan-nevronale markør PGP9. 5 eller ved hjelp av en hematoyxlin-eosin (H 78,97) og 2064 mikrometer
2 (142,7; 11 334)], CD68
+ makrofager [34.40% (1,562; 54,22) og 1852 nm
2 (126,9; 11 667)] og mastceller [24.16% (1,78; 56,63) og 2339 mikrometer
2 (221,1; 10155)] var mest utbredt i bukspyttkjertelen nevritt lesjoner (Figur 2A-C). De resterende inflammatorisk celle subtyper ble bare sporadisk påvist rundt intrapancreatic nerver [CD20
+ B-lymfocytter: 0,57% (0,07, 3,19) og 21.93 pm
2 (1,27; 293,9); CD4
+ T-hjelpeceller: 0,56% (0,16; 6,22) og 27,77 nm
2 (5,38; 1325); NCL-PC
+ plasmaceller: 1,20% (0,05; 17,44) og 121,3 nm
2 (2,08; 474,3); PRG2
+ eosinophils: 0,61% (0,13; 6,24) og 23,33 nm
2 (2,41; 1384); Figur 2A-C]. Den prosent fordelingen av leukocytt-subpopulasjoner i bukspyttkjertelen nevritt i CP er vist i figur 2C.
I kronisk pankreatitt, pankreatisk neuritt viste en lignende sammensetning til kreft i bukspyttkjertelen, omfattende CD68 + makrofager, CD8
+ cytotoksiske T-lymfocytter og mastceller (MC). «N» står for den identifiserte nerve. Mellom tre til fem nerver med bukspyttkjertel nevritt ble analysert fra hver pasient. Alle bildene på 200x forstørrelse. Skala barer indikerer 50 mikrometer.
Nevropatisk smerte ved PCA er forbundet med spesielt økt mastcelleinfiltrasjon rundt intrapancreatic nerver
En av de viktigste målene med denne studien var å sammenligne fordelingen av de ovenfor nevnte leukocytt-subpopulasjoner blant PCA pasienter med og uten magesmerter. Ser vi på hele beløpet av leukocytter i nervebetennelses celleinfiltrater, gjorde PCA pasienter med smerter ikke påvise noen forskjell i størrelsen på den inflammatoriske cellepopulasjon per nerve [7574 mikrometer
2 (3121, 36358)] sammenlignet med PCa pasienter uten smerter [7320 mikrometer
2 (1155; 33 793)]. Analysen av betennelsesceller undergrupper viste at det var et skifte i fordelingen av bare en enkelt inflammatorisk celle undergruppe blant PCA pasienter med smerter: Mengden perineural mastceller er spesielt økt blant PCA pasienter med smerter [PCAP, 30,96% (10,75; 52.10) og 3081 nm
2 (21,51; 16 090)] enn blant pasienter uten smerter [PCaN, 13,41% (6,64; 26,29) og 777,6 nm
2 (69.93, 3228),
p
0,05 figur 3A-C]. Alle andre inflammatoriske celle undergrupper viste ikke noen signifikant variasjon med smertestatus PCA pasienter [CD8
+ cytotoksiske T-lymfocytter i PCAP: 32,22% (22,62; 42,07) og 2802 nm
2 (116; 10 933) vs . 39,57% (21,06; 54,11) og 2208 nm
2 (586,5; 21 092) i PCaN; CD68
+ makrofager: 38,74% (21,21; 64,88) og 2628 mikrometer
2 (1214, 22012) i PCAP vs. 40,99% (10,15; 53,00) og 2486 nm
2 (665,9; 8097) i PCaN; CD20
+ B-lymfocytter: 0,77% (0,23; 5,11) og 70,64 nm
2 (3,36; 2598) i PCAP vs. 1,1% (0,10; 13,84) og 83,04 nm
2 (3,06; 418,8) i PCaN; CD4
+ T-hjelpeceller: 1,42% (0,39; 15,13) og 82,62 nm
2 (30,62; 562,9) i PCAP vs. 1,79% (0,41; 28,45) og 83,03 nm
2 (13.55; 2962 ) i PCaN; NCL-PC
+ plasmaceller: 2,08% (0,01; 8,61) og 245,4 nm
2 (0,31; 986,9) i PCAP vs. 1,46% (0,20; 10,54) og 69,83 nm
2 (9,50; 597,9) i PCaN; PRG2
+ eosinophils: 0,50% (0,14; 19,77) og 48.98 pm
2 (10,75; 888,8) i PCAP og 0,53% (0,10; 2,44) og 26.99 pm
2 (9,93; 156,6) i PCaN ; Figur 3A-C). Den prosent fordelingen av leukocytter subpopulasjoner i bukspyttkjertelen nevritt blant PCA pasienter med versus uten smerter er avbildet i figur 3C.
Pain status av PCA pasienter ikke påvirke den relative fordelingen av de fleste perineural inflammatorisk celle undergrupper ved PCA , men det var bare mastceller som ble spesielt beriket rundt intrapancreatic nerver av PCA pasienter med smerter sammenlignet med pasienter uten smerte. «N» står for den identifiserte nerve. Mellom tre til fem nerver med bukspyttkjertel nevritt ble analysert fra hver pasient. Alle bildene på 200x forstørrelse. Skala barer indikerer 50 mikrometer.
Nevropatisk smerte i CP er preget av økt perinevral mast celle infiltrasjon og undertrykkelse av perineural cytotoksiske T-lymfocytter i bukspyttkjertelen nevritt
Selv om bukspyttkjertel nevritt ble først beskrevet i CP av noen pionerstudier [5], [9], påvirkning av smerter ved fordelingen av inflammatoriske celleundergrupper i CP-assosiert pankreatisk nevritt er allment kjent. Når vi sammenlignet mengden av leukocytter rundt intrapancreatic nerver i CP pasienter med vs. uten smerte, var det interessant mindre mengder perineural betennelsesceller blant CP pasienter med smerter [(CPP, median perinevral CD45-immunoreactive område: 4333 nm
2 (1118, 10375)] enn blant pasienter i KF uten smerter [(CPN, median perinevral CD45-immunoreactive område. 9831 nm
2 (1687, 25685)] Dette krymping av perinevral provoserende celle infiltrere i CPP ble ledsaget av en spesifikk økning i den relative andel av mastceller i denne inflammatoriske celle andelen [CPP: 36,93% (10,92; 56,63) vs. CPN: 20,25% (1,78; 37,22)], men ikke i de absolutte mengder av perinevral mastceller [CPP: 1546 um
2 (455,8; 3129) vs. CPN.: 2833 um
2 (221,1; 7396)] Videre har både den absolutte og den relative mengde av CD8
+ T-lymfocytter ble redusert i smertefull CP [CPP: 22,35% (12,27; 78,97) og 768,6 nm
2 (142,7; 11 334) vs. CPN: 37,32% (28,31; 48,09) og 3628 nm
2 (653,0; 7365)]. Det var ingen flere store endringer i de relative eller absolutte mengder av andre betennelsesceller subtyper blant CP pasienter med smerter [CD68
+ makrofager: 34,40% (5,57; 54,22) og 1409 mikrometer
2 (546,8; 4811) i CPP vs 34,29% (1,56; 51,03) og 3129 nm
2 (126,9; 6613) i NKP; CD20
+ B-lymfocytter: 0,50% (0,07; 1,65) og 7,07 mikrometer
2 (1,27; 40,86) i CPP vs. 0,76% (0,08; 3,19) og 61,42 nm
2 (2,57; 293,9) i CPN; CD4
+ T-hjelpeceller: 0,50% (0,16; 4,10) og 14.47 pm
2 (5.38; 208,3) i CPP vs. 0,87% (0,28; 6,22) og 46.73 pm
2 (21,97; 351,2 ) i CPN; NCL-PC
+ plasmaceller: 1,06% (0,05; 6,32) og 49.05 pm
2 (2,08; 264,0) i CPP vs. 2,38% (0,45; 17,44) og 151,5 nm
2 (8,58; 474,3) i NKP; PRG2
+ eosinophils: 0,42% (0,15; 5,48) og 16.22 pm
2 (2,41; 174,1) i CPP og 0,94% (0,13; 6,24) og 39.42 pm
2 (3,34; 1384) i CPN ; Figur 4A-C)]. Den prosent fordelingen av leukocytt-subpopulasjoner i pankreas nevritt blant CP pasienter med versus uten smerte er vist i figur 4C.
I likhet med PCa, også i CP, pasienter med smerte viste større relativ mengde av mastceller (MC ) rundt intrapancreatic nerver enn pasienter uten smerter. Videre Parallelt denne økning i mengden av perinevral MC ved reduserte mengder av cytotoksiske CD8
+ T-lymfocytter i området rundt intrapancreatic nerver. «N» står for den identifiserte nerve. Mellom tre til fem nerver med bukspyttkjertel nevritt ble analysert fra hver pasient. Alle bildene på 200x forstørrelse. Skala barer indikerer 50 mikrometer.
perinevral mastcelleinfiltrasjon ikke relateres til nevrale invasjonen i bukspyttkjertelkreft
Neural invasjon (NI) er en av de histopatologiske kjennetegnene ved PCa og er oppstått i opp til 100% av PCa eksemplarer [12]. Som vi observerte en bestemt økning i mengden av perinevral MC i smertefulle PCA ett stort spørsmål som oppsto på dette tidspunktet var om perinevral MC infiltrasjon korrelerer også til økt tumorinvasjon av nerver. For dette formålet, klassifisert vi alvorlighetsgraden av NI ved PCA eksemplarer inn i tre kategorier ( «0 /nei invasjon», «I /peri-nevrale invasjon» og «II /endo-neural invasjon» [1]) og korrelert NI alvorlighets til den relative mengde av perinevral MC. Her var det ingen sammenheng mellom perinevral MC infiltrasjon og økende alvorlighetsgrad av NI ved PCA [ingen invasjon /Grade 0: 15,73% (3,08; 65,16), peri-nevrale invasjon /Grade I: 14,79% (0,34; 51,71) og endo- nevrale invasjon /Grade II. 37.67% (17,65; 60,05),
p
= 0,08, Figur 5]
Intrapancreatic nerver i PCA vev ble evaluert for tilstedeværelse av nevrale invasjon (NI) og klassifisert i NI grader «0 /nei invasjon», «1 /peri-nevrale invasjon» og «2 /endo-nevrale invasjon). I vår kohort, gjorde de relative perineural mast celle beløpene ikke skiller mellom ulike grader av NI i menneskelig PCa. Resultatene er presentert som median (minimum; maksimum)
Expression og nevrale immunoreaktivitets av PAR-en og PAR-2 ved PCA og CP
Nerveceller kan bli sensibilisert ved påvirkning av. trombin på protease-aktivert reseptor type 1 (PAR-1) eller av MC-avledede proteaser (for eksempel tryptase) ved protease-aktivert reseptor type 2 (PAR-2) [13]. Som vi har observert betydelig forhøyede mast celle mengder rundt intrapancreatic nerver ved PCA og CP, vi også kvantifisert nivåene av PAR-en og PAR-2 i disse vev og i tillegg i intrapancreatic nerver. Her, sammenligningen av mRNA-ekspresjon av PAR-1 og PAR-2 i NP, PCa og CP viste ingen vesentlig forskjell i nivåene av disse reseptorer (figur 6A). Tilsvarende når PCA og CP pasienter ble stratifisert i «No Pain» og «smerte» grupper, de mRNA nivåer av disse reseptorene var ikke forskjellig mellom disse gruppene (figur 6B-C). Når nevrale immunoreaktiviteter for disse reseptorene ble sammenlignet mellom pasienter med og uten smerte, PCA pasienter med smerte tendens til å oppvise en litt større immunoreaktivitet for PAR-1 [3,272% (0,20; 9,44)] enn de uten smerte [1,22% (0,14; 5,57), Figur 6D]. Imidlertid var det ingen forskjell i PAR-2-immunoreaktivitet i PCA pasienter med smerte [11,06% (4,45; 17,23)] sammenstilt uten smerte [11,90% (1,843; 28,64), (figur 6D)]. Tilsvarende smertestatus CP pasientene hadde ingen innflytelse på nevrale immunoreaktiviteten for PAR-1 eller PAR-2 i vår kohort (figur 6E).
(A) Ekspresjon av PAR-1 og PAR-2 var forhold mellom normal menneskelig bukspyttkjertelen (NP), CP og PCA vev via QRT-PCR og skilte seg ikke mellom disse tre enhetene. Expression ble normalisert første til husholdningsgenet cyklofilin B og deretter til NP. (B) ved PCA, gjorde vev nivåer av PAR-en og PAR-2 ikke forskjell hos pasienter med smerter versus pasienter uten smerte. (C) På tilsvarende måte også i CP, var det ingen forskjell i vev mRNA-nivåer av PAR-1 og PAR-2 til pasienter med ingen smerte i forhold til smerte. (D) Intrapancreatic nerver i PCa ble analysert for immunoreaktivitet for PAR-1 og PAR-2 og korrelert til smerten status av pasientene. Her, smertefølelse var ikke assosiert med forskjeller i immunreaktiviteten av intrapancreatic nerver for PAR-1 eller PAR-2. (E) I analogi med PCA også i CP, pasienter med smerter utstilt lignende immunoreaktivitetene i nerver for PAR-en og PAR-2 som pasienter uten smerter.
nevropatisk smerte-forbundet perinevral mastceller i PCa og CP er MC
TC-type mastceller
Hos mennesker kan MC klassifiseres basert på deres mekler innhold i to kategorier: MC
T-type mastceller som inneholder heparin og tryptase, og MC
TC-type mastceller som i tillegg inneholder det proteolytiske enzym «chymase» [14]. For å bestemme utbredt mast celle fenotype i PCA CP og NP, utførte vi dobbelt-immunofluoresence merking i bukspyttkjertelen vev mot mastcelle tryptase og mastceller chymase. I NP, mastceller var nesten ikke oppdages i det hele tatt rundt intrapancreatic nerver. I alle NP pasienter som ble inkludert i analysen, kunne vi bare finne tre nerver som viste en nær romlig sammenheng med betennelsesceller. Den doble immunolabeling av disse mastceller viste at alle disse cellene inneholdt både tryptase og kymase [100% (100; 100)], og således å klassifisere dem som MC
TC-type mastceller (figur 7A). På den annen side, både i PCa og CP, MC
TC attraksjon mastceller var igjen den overveiende perinevral mastcelle-fenotype (81,7 ± 4,9% og 77,0 ± 4,0%, henholdsvis), men begge sykdomsenheter inneholdt i tillegg perinevral MC
T type (tryptase-only) mastceller (18,3 ± 4,9% og 23,7 ± 4,0%, henholdsvis). Den subgruppeanalyse vurderer smerten status av pasientene viste en tilsvarende fordeling av perinevral MC
TC og MC
T typen mastceller i PCA pasienter med smerter (MC
TC: 85,6 ± 6,4% og MC
T: 14,4 ± 6,4%) versus de uten smerter (MC
TC: 77,4 ± 7,4% og MC
T: 22,6 ± 7,4%, figur 6A). I kontrast, CP pasienter med smerter viste signifikant større andeler av perinevral MC
TC-type mastceller (MC
TC: 86,9 ± 4,4% og MC
T: 13,1 ± 4,3%,
p
0,0001) enn pasienter i KF uten smerter (MC
TC: 62,9 ± 6,4% og MC
. T: 37,1 ± 6,4%, figur 6A)
(A) Menneskelig bukspyttkjertelen vev prøver fra NP, PCA og CP var dobbelt-immunolabeled for perinevral MC-tryptase (rød) og MC-chymase (grønn). I alle tre enhetene, de aller fleste av perinevral MC demonstrert dobbel immunoreaktivitets (gul i overlay) for MC-tryptase og -chymase. I CP, var det betydelig større relative mengdene av dobbelt immunoreactive MC blant pasienter med smerter enn blant dem uten smerter. De hvite skala barer indikerer 100 mikrometer.
