Abstract
Tull-mediert mRNA Decay (NMD) degraderer mutante mRNA inneholder tidlig avslutning kodon (PTC-mRNA ). Her evaluere vi konsekvensen av Sjøfartsdirektoratet aktivitet i kolorektal kreft (CRC) som viser mikrosatelitt ustabile (MSI) hvis progresjon er assosiert med akkumuleringen av PTC-mRNA som koder for immunogene proteiner på grunn av rammeskiftmutasjoner i koderepeterte sekvenser. Inhibering av UPF1, en av de viktigste faktorene NMD, ble oppnådd ved siRNA i HCT116 MSI CRC-cellelinje og de resulterende forandringer i gen-ekspresjon ble undersøkt ved hjelp av ekspresjon mikromatriser. Virkningen av Sjøfartsdirektoratet aktivitet ble også undersøkt i grunnskolen MSI CRC ved å kvantifisere uttrykket av flere mRNA i forhold til sin mutasjonsstatus og til endogen UPF1 og UPF2 uttrykk. Host immunitet utviklet mot MSI kreftceller ble verdsatt ved å tallfeste antall CD3ε-positive tumor infiltrerende lymfocytter (Tīlss). UPF1 stanse førte til oppregulering av 1251 gener i HCT116, blant hvilke en andel av dem (dvs. 38%) betydelig høyere enn ventet ved en tilfeldighet inneholdt en kodende mikro (
P
mindre enn 2 x 10
-16). I MSI primære CRC, UPF1 var betydelig over uttrykt i forhold til normal tilstøtende slimhinne (
P
0,002). Våre data gitt bevis for differensiell nedbrytning av PTC-mRNA sammenlignet med vill-type som ble positivt korrelert til UPF1 endogen ekspresjon nivå (
P
= 0,02). En negativ effekt av UPF1 og UPF2 uttrykk på vertens antitumorrespons ble observert (
P
0,01). Samlet sett viser våre resultater at NMD dypt påvirker MSI-drevet tumorigenesis på molekylært nivå og indikerer en funksjonell negativ effekt av dette systemet på anti-tumor immunitet hvis intensiteten er recurrently vist seg å være en faktor av betydning gunstig utfall i CRC.
Citation: El-Bchiri J, Guilloux A, Dartigues P, Loire E, Mercier D, Buhard O et al. (2008) Nonsense-mediert mRNA Decay Impacts MSI-Driven Karsinogenese og anti-tumor immunitet i kolorektal kreft. PLoS ONE 3 (7): e2583. doi: 10,1371 /journal.pone.0002583
Redaktør: Cathal Seoighe, University of Cape Town, Sør-Afrika
mottatt: 02.04.2008; Godkjent: 28 mai 2008; Publisert: 09.07.2008
Copyright: © 2008 El-Bchiri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Association pour la Recherche contre le Cancer (kredittnummer 3946). JEB, EL og PDLG var mottakere av et fellesskap fra Ministère Français de la Recherche (MRT)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tull-mediert mRNA-forfall (SD) er en evolusjonært konservert mRNA overvåking mekanisme som gjenkjenner og eliminerer avvikende mRNA’er som bærer for tidlig avslutning kodoner (PTC), for derved å forhindre akkumulering av potensielt skadelige trunkerte proteiner i eukaryote celler [1]. Etter pre-mRNA spleising, er Sjøfartsdirektoratets mål gjenkjent via en multiprotein ekson-krysset kompleks (EJC) som er avsatt 24 nukleotider oppstrøms av hver ekson-exon veikryss. Som en generell regel, er det blitt fastslått at avvikende mRNA som inneholder PTC plassert enten mindre enn 50-55 nukleotider oppstrøms av den siste exon-ekson kryss eller i den siste ekson ikke brytes ned av NMD (NMD-irrelevant) [2]. Kjernen i NMD effektorer omfatter de evolusjonære bevart UPF proteiner, UPF1 /RENT1, UPF2 /RENT2, og to paraloger av UPF3, UPF3 (også kalt UPF3a) og UPF3X (også kalt UPF3b). UPF1 er en RNA helikase hvis aktivitet er regulert av sykluser av fosforylering /defosforylering. Fosforylering av UPF1 krever UPF2 og UPF3 og katalyseres av SMG1, en proteinkinase relatert til fosfoinositid-3-kinase-familien. UPF1 fosforylering av SMG1 har vist seg å være det hastighetsbegrensende trinn i NMD [3], [4]. Det er bemerkelsesverdig at SMG1 aktivitet ikke er bare viet til NMD men spiller også en rolle i DNA-skade signalering og reparasjon, særlig ved å fosforylere p53 [5]. Defosforylering av UPF1 formidles av SMG5, SMG6 og SMG7, tre proteiner som fungerer som adaptere mellom fosforylert UPF1 og protein fosfatase 2A [3]. UPF1 funksjon er avgjørende i NMD, mens UPF3 og UPF3X er delvis overflødig [6] og UPF2 er unnværlig i noen tilfeller som antyder eksistensen av en UPF2-uavhengig NMD veien [7]. UPF1 opptrer ikke bare i NMD-mediert nedbrytning av avvikende transkripter, men også i den fysiologiske nedbrytning av forskjellige mRNA, som regulerer ekspresjonen av 3-10% av den transkriptomet [8], [9]. Stanse av UPF1 og i mindre grad UPF2 har blitt rapportert til å modulere ekspresjonsnivået av en rekke fysiologiske substrater av Sjøfartsdirektoratet, inkludert transkripter med oppstrøms åpne leserammer i den 5′-utranslaterte region, transkripter inneholdende et intron i deres 3′- utranslaterte region samt transkripter avledet fra transposon eller endogene retrovirus [8], [10]. Sjøfartsdirektoratet har også blitt foreslått å spille en rolle i reguleringen av alternative spleisehendelser, ettersom sekvens-baserte analyser forutse at omtrent 35% av pattedyr alternative spleisehendelser fremstille PTC-inneholdende spleisede varianter. Imidlertid har det nylig blitt rapportert at de fleste PTC-inneholdende spleisevarianter blir produsert ved lave nivåer i humane celler, uavhengig av virkningen av Sjøfartsdirektoratet, noe som tyder på at de fleste av slike PTC-introdusere hendelser er ikke under positivt seleksjonstrykk og derfor ikke er forventes å bidra viktige funksjonelle roller [11].
Hittil konsekvensene av NMD aktivitet har vært mest undersøkt i monogene arvelige sykdommer, inkludert arvelige svulster [12]. Sjøfartsdirektoratet har blitt rapportert å beskytte heterozygote bærere fra de skadelige virkninger av noen avvik PTC-mRNA som koder for avkortede proteiner med dominant-negativ aktivitet [12]. Motsatt har NMD manglende evne i nedverdigende NMD-irrelevante transkripsjoner blitt foreslått å favorisere den fenotypiske uttrykk for dominante arvelige sykdommer [12]. Fordi kreftceller er genetisk ustabilt og akkumulerer mange somatiske rammeskiftmutasjoner i gener med en forventet rolle i celle-transformasjon, har Sjøfartsdirektoratet system blitt foreslått å spille en rolle i tumorutvikling [12]. Imidlertid har vurderingen av dens samlede innvirkning på denne fremgangsmåte er dårlig beskrevet og fremdeles er vanskelig å definere, siden den avhenger av arten og antallet av mutanter akkumulert i cancerceller i løpet av tumorprogresjon. Til dags dato har NMD hemming blitt brukt som en
in vitro
strategi for å oppdage nye kreftrelaterte gener husing avkorting mutasjoner, noe som tyder på at det kan faktisk ha en rolle i å favorisere valg av noen hyppige mutasjons hendelser i ulike tumortyper [13]. Det er bemerkelsesverdig at NMD-aktivitet har vist seg å være svært variabel, noe som fører til ufullstendig og differensial nedbrytning av putatively NMD-relevante mRNA som inneholder en PTC (referert til som NMD-escape) [14], [15], [16].
MSI svulster skjuler mangel mismatch reparasjon (MMR) er hyppig hos mennesker. De representerer ca 15% av sporadisk kolorektal, mage og endometrial svulster og inkluderer svulster som oppstår i Arvelig Non polypose tykktarmskreft (HNPCC) syndrom. Dusinvis av mutasjoner som påvirker genene inneholder kodende gjentatte sekvenser har blitt rapportert i disse svulstene, definere den såkalte mutator veien hvis rolle er mistenkt for å være avgjørende i MSI-drevet tumorigenesis [17]. Til dags dato har et stort antall publikasjoner rapportert rammeskifte mutasjoner i gener som er involvert i ulike biologiske mekanismer som cellesyklusregulering (f.eks
TGFBR2
,
IGF2R
,
TCF4
,
AXIN2
,
PTEN
,
RIZ
), apoptose (f.eks
BAX
,
CASP5
,
BCL10
,
APAF1
,
FAS
), DNA-skade reparasjon (f.eks
ATR
,
DNA-PKCS
,
RAD50
,
MSH3
,
MSH6
,
MBD4
,
MLH3
,
BLM
,
CHK1
) og andre [17]. Vi har nylig rapportert at forfallet av rammeskifte mutasjon-avledet mRNA følgende
in vitro
stanse av UPF1 og /eller UPF2 i et panel av MSI CRC cellelinjer var differensial og ufullstendig [14]. Hvis ikke fullstendig nedbrutt, rammeskifte mutante mRNA koder for proteiner inneholdende avvikende C-terminal hale, hvorav noen har vist seg å vise immunogene egenskapene til [18], [19]. Flere studier har lagt vekt på det faktum at i samsvar med denne fremgangsmåte, ble MSI tumorer markert infiltrert av cytotoksiske intra-epitelial tumor-infiltrerende T-lymfocytter (Tīlss), og at en slik cellulær immunrespons var prediktiv av et forholdsvis positivt resultat uavhengig av den initielle tumorstadium og andre kliniske faktorer [20]. Derfor kan NMD aktivitet interferere med anti-tumor-immunitet ved å begrense ekspresjonen av noen av disse avvikende proteiner. Ved hjelp av MSI kolorektal kreft som en modell, rettet vi her på ytterligere å undersøke hvilken rolle NMD i onkogenese.
Resultater
transkriptomet endringer sekundært til UPF1 stanse i HCT116 CRC celler og deres forhold til mikro ustabilitet
ved hjelp av Affymetrix GeneChip® Menneskelig exon 1,0 ST genuttrykk arrays, uttrykket av 1363 gener ble funnet å være signifikant deregulert på UPF1 stanse i HCT116 (MSI) CRC cellelinje, med en fold endring ≥1.5 forhold til ubehandlede celler (tabell S1). Med 111 andre, UPF1 ble, som forventet, en av genene for å være betydelig nedregulert. Graden av hemming var betydelig (mer enn 75%) og stemte godt med data våre oppnådd ved sanntids kvantitativ RT-PCR (data ikke vist). Total, 1251 gener ble oppregulert ved UPF1 stanse (1251/1363, dvs. 92% av alle deregulerte gener under disse betingelser), blant hvilke 472 (38%) inneholdt en mononukleotid repetisjonssekvens på minst 7 basepar i den kodende region (tabell S2). Av interesse, det totale antall av gener i humane genom med en kodende gjenta skrift ≥7N er lavere (4470/22218,. 20% Data ikke vist), slik at signifikant høyere enn antatt ved en tilfeldighet det totale antall slike målgener opp- reguleres i HCT116 ved UPF1 lyddemping (
P
mindre enn 2 x 10
-16; Chi2 test).
Blant de ovennevnte 472 gener i HCT116-celler, 22 gener inneholdende en kodende mononukleotid gjentakelse av 7 til 10 nukleotider ble valgt på grunn av deres antatte rolle i tykktarmskreftutvikling og screenet for innsetting /delesjonsmutasjoner i disse cellene (tabell 1). Alle disse genene, men tre (
MBD4
,
MSH3
,
TGFBR2
) hadde aldri blitt rapportert å være mutert i MSI CRC (tabell 1). Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi har oppdaget eller bekreftet homozygote mutasjoner i
SLC35F5
,
TGFBR2
,
ARV1
,
MSH3
,
SMAP1
gener og heterozygote mutasjoner i
MBD4
,
EFHC1
,
TTC3
, og
WDR19
gener (Figur 1a). Alle de tilsvarende mutant mRNAer næret en PTC lokalisert i kodende regioner som kan være utsatt for NMD. I tillegg observerte vi at 4 andre målgener med tidligere beskrevet heterozygote rammeskifte mutasjoner i HCT116 (
BAX
,
RECQL
,
RAD50 Hotell og
MSH6
) ble ikke signifikant gjen uttrykte følgende UPF1 lyddemping (Figur 1a). De re-ekspresjonshastigheter for PTC-mRNA indusert av UPF1 stanse i HCT116 er vist i figur 1a og fremheve det faktum at, som beskrevet [14], er svært variabel i en serie av endogent mutert PTC-mRNA selv UPF1-mediert mRNA forfall allel spesifikke uttrykk analyser ble ikke brukt til å skille mellom muterte og villtype mRNA i tilfelle av heterozygote rammeskifte endringer.
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3
,
SMAP1
,
TTC3
,
EFHC1
,
MBD4
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50 Hotell og
MSH6
havn homozygote eller heterozygote rammeskifte mutasjoner i HCT116 MSI CRC cellelinje. Bruke uttrykk array, fold endringer i uttrykket av de tilsvarende mRNA i forhold til UPF1 lyddemping ble bestemt (fold change = E
mRNA i celler behandlet med en UPF1 siRNA /E
mRNA i celler behandlet med kontroll siRNA). Gener som er understreket er de som har re-uttrykk var betydelig i disse forholdene (1,5 fold-endre opp med en p-verdi ≤0.005). Bevis for variabel følsomhet for UPF1-mediert nedbrytning av slike PTC-mRNA kan derfor oppnås, selv om spesifikke uttrykk allel analyser ikke ble brukt til å skille mellom muterte og villtype mRNA når det gjelder heterozygot rammeskifte endringer. b. Coding rammeskifte mutasjoner i mål gener i forhold til NMD-status i MSI primære CRC. Frekvenser av rammeskifte mutasjoner i samme serie av 13 målgener for ustabilitet i 44 MSI primære CRC er representert. Målgener som rammeskifte mutasjoner er ofte valgt for under MSI CRC progresjon båtplass ulike overfølsomhet for UPF1-mediert forfall.
rammeskifte mutasjoner i MSI primære CRC i henhold til deres NMD status
Alle målgener mutert i HCT116 hvor virkningen av Sjøfartsdirektoratet har tidligere blitt bestemt ble screenet for rammeskiftmutasjoner i kodende mikrosekvenser i en serie av primær MSI CRC (n = 44). Dette inkluderer gener hvis mutert mRNA er mer eller mindre følsom for NMD (
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3
,
TTC3
,
EFHC1
,
MBD4
,
SMAP1
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50
,
MSH6
) (Figur 1a). Mutasjons frekvenser av disse 13 gener som representerer mulige mål for MSI-drevet ustabilitet var svært variabel i disse svulstene (Figur 1b). Basert på deres høye mutasjonsfrekvens,
SLC35F5
,
ARV1
,
TTC3
, og
SMAP1
representerer nye målgener der rammeskifte mutasjoner har ikke tidligere blitt rapportert hos MSI CRC. De ble mutert i 48% (21/44), 23% (10/44), 32% (14/44) og 73% (32/44) av svulster, henholdsvis (figur 1b).
over-uttrykk for UPF1 mRNA i MSI primære CRC
Ved å måle nivåene av UPF1 og UPF2 mRNA ved real-time kvantitativ RT-PCR i en annen uavhengig serie MSI primære CRC som vi også fått prøvene tilsvarer samsvarende normal slimhinne, observerte vi en tilnærmet syv ganger over-ekspresjon av UPF1 i tumorer (n = 25) sammenlignet med normal slimhinne (
P
= 0,0015; paret t-test) (figur 2). Siden kvantifisering (7 ganger) av over-uttrykk har å bli tatt med forsiktighet på grunn av den lille mengden av data, bekreftet vi at UPF1 mRNA ble faktisk over-uttrykt i MSI primære CRC ved å utføre en kvalitativ chi-kvadrat test, som er robust overfor ekstreme verdier. Ved hjelp av denne tilnærmingen, antall tilfeller der UPF1 uttrykk var høyere i tumorer sammenlignet med matchende normal slimhinne (N = 20/25) var vesentlig annerledes enn forventet ved en tilfeldighet (
P
= 0,009; chi-kvadrat test ). Disse dataene er vist på figur 2, hvor 20 og 5 åpne sirkler representerer MSI tumorprøver over-uttrykker UPF1 eller ikke, henholdsvis, er representert over en stiplet linje som symboliserer virkningen av dette NMD faktor i normal slimhinne. Av interesse, ble en trend for over-uttrykk for denne faktoren også observert i ikke-MSI (MSS) CRC (n = 31) i samme forhold (
P
= 0,08; paret t-test) (Figur 2). I motsetning til dette ble UPF2 ikke uttrykt forskjellig i enten MSI eller MSS CRC sammenlignet med samsvarende normal slimhinne (
P
= 0,56 og 0,83, henholdsvis, paret t-test). (Figur 2)
i 25 MSI og 31 MSS CRC sammenlignet vi uttrykk for UPF1 og UPF2 mellom svulster og matchet normal tarmslimhinnen ved real-time kvantitativ RT-PCR. I alle, men fem tilfeller, over-uttrykk for UPF1 ble observert i MSI CRC svulster. Tatt i betraktning alle prøvene, over-uttrykk for UPF1 i MSI svulster var statistisk signifikant (
P
= 1,5 × 10
-3, paret t-test). I MSS CRC, en trend for over-uttrykk for denne faktoren ble observert under samme forhold (
P
= 0,08; paret t-test). Hos pasienter med MSI eller MSS CRC ble UPF2 ikke uttrykt forskjellig mellom svulst og matchende normal slimhinne (
P
= 0,56 og
P
= 0,83, henholdsvis paret t-test).
Betydelig nedbrytning av rammeskifte mutasjon-avledet mRNA som er avhengige av UPF1 uttrykk i MSI primære CRC
i vår serie med 44 primær MSI CRC, nærmere bestemt vi den relative
in vivo
uttrykk for 18 MSI målgener ved real-time kvantitativ RT-PCR ved hjelp av eksperimentelle forhold som vi tidligere bestemt i en serie av CRC cellelinjer (
ATR
,
BAX
,
BLM
,
CBF2
,
CDX2
,
GRB14
,
GRK4
,
IGF2R
,
MBD4
,
MSH3
,
MSH6
,
RAD50
,
RBBP8
,
RECQL
,
RIZ
TCF4
,
TFDP2
,
TGFBR2
) (figur 3 og også tabell S3 for mutasjonsstatus av disse 18 gener i MSI CRC) [14]. For alle gener unntatt tre (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), ble det observert en trend for nedbrytning av mutant sammenlignet med villtype mRNA. Nedbrytning av mutante mRNA sammenlignet med vill-type var signifikant for MSH6 (
P
= 0,02, Student t-test) og nesten signifikant for et par andre bare, f.eks BAX (
P
= 0,08), CDX2 (
P
= 0,10), MSH3 (
P
= 0,10), RIZ (
P
= 0,10 ) og TFDP2 (
P
= 0,10), noe som gir bevis for differensiell nedbrytning av PTC-mRNA sammenlignet med villtype i vår serie av primære CRC, som allerede beskrevet i en serie av MSI CRC-cellelinjer [14] (figur 3). Totalt var det en meget betydelig nedbrytning av PTC-mRNA i MSI primære CRC (
P
10
-4, t-test, se «Materialer og metoder» for statistiske analyser ). Som indirekte bevis på bidraget fra Sjøfartsdirektoratet, ble den generelle intensiteten i denne prosessen i MSI primære CRC positivt korrelert til den endogene UPF1 uttrykk nivå (
P
= 0,02, t-test, se «Materialer og metoder «seksjon for statistiske analyser), mens virkningen av UPF2 var ikke signifikant (
P
= 0,72, t-test) (data ikke vist).
∂Ct verdier er angitt i forhold til mutasjonsstatus for hvert gen i de 44 MSI primære CRC (villtype og muterte tumorprøver vises med hvite sirkler og svarte trekanter, henholdsvis). For hvert gen, ble middels verdier av ∂Ct knyttet til villtype (hvit pil) eller muterte (svart pil) tumorprøver beregnes. For alle gener unntatt tre (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), en trend for nedbrytning av mutant sammenlignet med villtype mRNA ble observert (∂Ct verdier er omvendt proporsjonal med genekspresjon). Samlet sett dataene gi bevis for betydelig nedbrytning av PTC-mRNA sammenlignet med villtype mRNA
in vivo
i MSI primære CRC (
P
10
-4, student
t
-test).
UPF1 og UPF2 er negative prediktive faktorer av vertens immunrespons mot MSI CRC
med unntak av
TCF4
, ingen signifikante positive korrelasjoner ble funnet mellom endogen uttrykk for PTC-mRNA og tilstedeværelsen av CD3ε-positive Tīlss i tumorer (
P
TCF4 = 0,06; bootstrapped t-test) (data ikke vist ). Koblingen mellom antall Tīls og uttrykk for UPF1 og UPF2 var ikke lineær, men log-lineær. Dermed ble påvirket av UPF1 og UPF2 uttrykk på antall Tīlss undersøkt
via
en Wald test og koeffisientene i Poisson regresjon modellen ble estimert via gjentatte re-vektet minste kvadraters. Basert på disse observasjonene, ble en negativ effekt av UPF1 og UPF2 uttrykk på det totale antallet CD3ε-positive Tīlss demonstrert (
P
0,01 for UPF1 og UPF2; Wald test). En matematisk modell som korrelerer antallet CD3ε-positive Tīlss med uttrykket av disse NMD faktorene i MSI CRC ble etablert, forutsi at Tīlss økt med ca 30% når uttrykk for UPF1 ble halvert.
Disse dataene er illustrert for UPF1 og UPF2 i figur 4; tumorprøver der UPF1 og UPF2 uttrykk er lav (under gjennomsnittet) presenteres med variable priser av CD3ε positiv-Tīlss mens tumorprøver der UPF1 og UPF2 uttrykk er høy (over gjennomsnittet) ble funnet å være nesten alltid preget av en lav CD3 telle, gjør UPF1 og UPF2 mulige markører for dårlig anti-tumor immunitet hos MSI primære CRC.
det totale antallet CD3ε positiv-Tīlss var signifikant relatert til den endogene uttrykk for UPF1 og UPF2 i denne serien av 44 MSI primære CRC (
P
0,01; Wald test). Av interesse, mens tumorprøver der UPF1 og UPF2 uttrykk var lav (under gjennomsnittet) presentert med variable priser av CD3ε positive-Tīlss, tumorprøver der UPF1 og UPF2 uttrykk var høy (over gjennomsnittet) ble nesten alltid preget med lav CD3 count (dårlig immunogene CRC). Disse dataene gjør UPF1 og UPF2 spesifikke markører for dårlig anti-tumor immunitet hos MSI primære CRC. CD3 protein farging presenteres for 2 MSI primære CRC prøver som viser enten lav CD3 telle og høy UPF1 og UPF2 uttrykk (venstre) eller høy CD3 telle sammen med lav UPF1 og UPF2 uttrykk (til høyre).
Diskusjoner
ved å evaluere et stort antall mål gener som ble mutert med flytende rente i sine koding gjentatte sekvenser, viser vi et betydelig forfall av den tilsvarende mutant mRNA sammenlignet med villtype i MSI primære CRC med en betydelig innvirkning på endogen ekspresjon av UPF1 i denne prosess, med UPF2 å spille en mindre rolle i prosessen, som nylig beskrevet av vår gruppe i en serie av MSI CRC-cellelinjer [14]. Tatt en etter en, ble det observert en vesentlig eller nesten signifikant nedbrytning av bare noen mutante mRNA sammenlignet med vill-type, og dette er ikke overraskende siden: (i) som nylig er publisert av vår gruppe, NMD effekt på ekspresjonen av rammeskift-mutasjon-avledet mRNA er svært variabel fra en mutant til en annen [14]; (Ii) frekvenser av målgenet forandringer var svært variabel og noen ganger svært lav i vår tumor serie; (Iii) noen mutanter i særdeleshet
(TCF4)
er NMD-irrelevant. I denne studien vi også undersøke stor skala genekspresjon forandringer i MSI CRC-celler i forbindelse med NMD-inhibering ved bruk av en spesifikk metode som viser at det førte til oppregulering av 1251 gener i HCT116, blant hvilke en andel av dem betydelig høyere enn forventet ved en tilfeldighet inneholdt en koding mikro. Selv om ikke alle av dem er forventet å bli mutert i MSI CRC-celler, slik det er vist her på en kort serie av oppregulert målgener, kan det føres frem at UPF1 er spesielt relevant for modulering av ekspresjon av mange gener mutert i MSI CRC celler. Samlet er disse dataene bekrefter for første gang, både
in vitro Hotell og
in vivo
at NMD dypt påvirker MSI-drevet tumorigenesis på molekylnivå.
Som en mulig funksjonell følge av NMD aktivitet
in vivo
i MSI tumorgenese, undersøkte vi hvorvidt aktiviteten av dette systemet modulerer antitumorimmunitet. Av interesse, var den eneste rammeskifte mutasjon hvis tilstedeværelse signifikant assosiert med et høyere antall Tīlss i MSI CRC var i
TCF4
, den eneste NMD-irrelevant target genet studert i vår serie som sin koding gjenta sekvensen ligger innenfor sin siste ekson. Dessuten ble det observert en invers korrelasjon mellom UPF1 og UPF2 ekspresjon og antallet CD3ε-positive Tīlss i MSI CRC, og en matematisk modell som forbinder antall CD3ε-positive Tīlss til ekspresjon av Sjøfartsdirektoratets faktorer i MSI CRC spådd at Tīlss økte med ca 30% når uttrykk for UPF1 eller UPF2 ble halvert. Disse dataene indikerer at NMD kan virke negativt vertens immunitet mot MSI tumorceller i en kumulativ måte
via
kontrast og ufullstendig nedbrytning av muterte transkripsjoner koder immunogene peptider. Det kan spekuleres i denne sammenheng at UPF faktorer kan være spesifikke markører for dårlig immunitet i MSI primære CRC. I lys av disse resultater kan det således føres frem at den nevnte negative virkningen av NMD på immun prosessen utviklet av verten mot MSI tumorcellene ville være effektiv bare når NMD faktorer er over-uttrykt og svært aktive i å nedbryte de mange PTC-termstorer mRNA som koder for immunogene peptider som er syntetisert i MSI CRC. I motsetning til dette, kan det antas at, når den uttrykkes ved lavere priser, vil NMD faktorer være ineffektiv i å forhindre utvikling av et anti-tumor immunrespons hvis intensitet vil avhenge av antallet og arten av rammeskifte endringer akkumulert i MSI kreftceller. Disse funnene kan være av klinisk interesse fordi, som nevnt tidligere, antitumorimmunitet er generelt ansett som en selvstendig faktor hvis intensitet har vært konsekvent vist å være prediktiv for positivt resultat uavhengig av den innledende kolon tumorstadium og andre kliniske faktorer [20] .
Siden effektiviteten av Sjøfartsdirektoratet for nedbrytning mutante mRNA fra målgener er svært variabel, vi nylig foreslått at NMD kan derfor spille en viktig rolle i valget av target-genmutasjoner med en funksjonell rolle i MSI karsinogenese [14 ]. Det er bemerkelsesverdig at blant de genene oppregulert på UPF1 stanse, fire ennå ikke rapportert målgener (
SLC35F5
,
TTC3
,
ARV1 Hotell og
SMAP1
) er her vist å være hyppig mutert i vår serie av MSI primære CRC. Blant dem,
SMAP1
, for stromal Membran Associated Protein-en, har tidligere blitt rapportert å delta i kromosom rearrangements med
MLL
i hematologiske maligniteter [21]. Med en 73% hyppighet av rammeskifte endringer i MSI primære CRC, inkludert homozygot mutasjoner i fem CRC prøver (data ikke vist), er det en av de mest mutert målgener i MSI CRC sammen med
TGFBR2 Hotell og
ACVR2 product: [17]. I tråd med våre tidligere resultater og de som oppnås ved Ionov et
al.
Hjelp emethine som en uspesifikk inhibitor av Sjøfartsdirektoratet system [14], [22], bekreftet vi i denne studien at
TGFBR2
PTC-mRNA brytes ned gjennom NMD i MSI CRC celler. I en nyere artikkel, du et
al.
[23] rapporterte motstrid data, og hevdet at dette målet genet samt
MSH3
unnslippe NMD i HCT116 cellelinje. De presenterte resultatene på en serie av PTC-mRNA som viser disse transkripsjonene var enten helt sensitive eller helt motstandsdyktig mot NMD i MMR-manglende celler. Sine data ble oppnådd ved å utføre analyser ekspresjon som var hverken kvantitativt eller allel-spesifikke. I den samme studien, disse forfatterne også foreslått en systematisk translasjonell undertrykkelse av avkortede proteiner fra rammeskifte mutasjon-avledet mRNA som rømte NMD (NMTR for «Tøys Mediert translasjonell undertrykkelse») [23]. Vi verifisert av western blotting som uttrykk for de tilsvarende proteiner for begge homozygously muterte målgener (
TGFBR2
,
MSH3
) var ikke påvises i HCT116-celler (data ikke vist). I motsetning til deg et
al
, foreslår vi at tap av
TGFBR2 Hotell og
MSH3
uttrykk skyldes i hovedsak NMD snarere enn til en hypotetisk NMTR sti. Det er bemerkelsesverdig at eksistensen av en NMTR banen ikke passer godt med immunogene egenskapene til MSI kreftceller som er direkte avhengige av opphopning av immunogene peptider som stammer fra en rekke rammeskifte relaterte proteiner som PTC-mRNA er NMD-relevant i de fleste tilfeller [ ,,,0],18], [19], [20]. Uavhengig av avvik, alle disse dataene argumentere for en rolle NMD i moduler uttrykket av flere gener som mutasjoner er allerede vist
(TGFBR2
,
MSH3
,
MBD4)
eller forventes å spille en viktig rolle under MSI CRC progresjon [17]. UPF1 uttømming med shRNA i ikke-MSI HeLa-celler ble nylig rapportert å indusere cellesyklus arrest i tidlig S-fasen på grunn av involvering av denne faktoren i DNA-reparasjon [24]. I motsetning, forbigående stanse av UPF1 og /eller UPF2 i MSI og MSS tykktarmskreftceller (HCT116, LoVo, Co115, LS174T, SW480, COLO320) førte ikke til vesentlige endringer av cellevekst og /eller død i våre hender (data ikke vist). Videre studier er nå pålagt å bestemme hvordan NMD aktivitet kan endre repertoar av gener involvert i MSI kreftutvikling og påvirkning tumorprogresjon ved hjelp av MMR mangelmusemodeller der UPF1 aktivitet er endret.
Våre observasjoner angår den hyppigste primære svulsten sted forbundet med MSI i menneskelig, dvs. kolon. De viser at NMD dypt påvirker uttrykket av mange mutanter med forventet avgjørende rolle i MSI-drevet tumorigenesis og negativt påvirker verten immunitet mot MSI kreftceller. En slik antatt onkogen funksjon av NMD i MSI karsinogenese passer godt med det faktum at vi også rapportere her for første gang at UPF1 er betydelig over uttrykt i MSI CRC sammenlignet med matchende normal slimhinne. Denne siste observasjonen var basert på måling av UPF1 mRNA nivå. Som et perspektiv, har det nå å bli bekreftet på proteinnivået gjennom en kvantitativ tilnærming, for eksempel Western blotting ble her ikke utført på grunn av mangel på tilgjengelig ytterligere tumormateriale. Utviklingen av kliniske forsøk skal nå bli utviklet for å se hvorvidt NMD kan betraktes som en faktor av dårlig prognose i MSI CRC eller ikke. Små molekyler som hemmer NMD er nå tilgjengelige [25] og kan brukes til å få ytterligere innsikt i NMD rolle i kreftformer. Vi har nå tenkt å bruke disse stoffene i MMR-mangelfull mus utviklings MSI svulster for å vurdere om det kan utgjøre en ny terapeutisk mål for behandling av slike svulster.
Materialer og metoder
tumorprøver og cellelinjer
CRC HCT116-cellelinjen ble anskaffet fra American Type Culture Collection og holdt i DMEM (Life Technologies) inneholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen) og glutamin uten antibiotika for å tillate transient transfeksjon eksperimenter med siRNA. Førti-fire MSI primære svulster ble innhentet fra pasienter som gjennomgår kirurgi for kolorektal kreft; alle saker ble histopathologically bekreftet som blir adenokarsinomer. Innsamlede svulster ble systematisk formalinfiksert, parafininnebygd og frosset etter operasjonen uten forutgående forankring i flytende nitrogen. MSI status ble bestemt ved fluorescerende multipleks PCR bestående av 5 quasimonomorphic mononukleotid gjentagelser (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og NR-27), som beskrevet [26].
