Abstract
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk sykdom som påvirker kvinner i USA. Kreft Genome Atlas Network identifisert p53 mutasjoner i 96% av høy grad av serøs ovariekarsinomer, demonstrerer sin kritiske rolle. I tillegg er den transformerende vekstfaktor beta (TGFp) pathway dysfunksjonell i forskjellige maligniteter, inkludert kreft i eggstokkene. Denne studien undersøkte hvor ekspresjon av vill-type, mutant eller fravær av p53 endrer ovarial cancer-cellerespons for å TGFfi signalering, så vel som reaksjon på ovarial flate epitel og egglederen epitelet til TGFp. Bare eggstokkreft celler som uttrykker villtype p53 var vekst inhibert av TGFp, mens eggstokkreft celler som var mutant eller null p53 ikke var. TGFB indusert migrasjon i p53 null SKOV3 celler, som ikke ble observert i SKOV3 celler med stabilt uttrykk av mutant p53 R273H. Knockdown av villtype p53 i OVCA 420 eggstokkreft celler forbedrede cellemigrering som reaksjon på TGFp. Økt protein uttrykk for DKK1 og TMEPAI, to pro-invasive gener med forbedret uttrykk i sent stadium metastatisk kreft i eggstokkene, ble observert i p53 knockdown og null-celler, mens celler som stabilt uttrykker mutant p53 demonstrert lavere DKK1 og TMEPAI induksjon. Ekspresjon av mutant p53 eller tap av p53 gi kontinuerlig proliferasjon av ovarian cancer cellelinjer i nærvær av TGFp; Men celler som uttrykker mutant p53 utstillings redusert migrasjon og redusert proteinnivå DKK1 og TMEPAI
Citation. Ó hAinmhire E, Quartuccio SM, Cheng W, Ahmed RA, kong SM, Burdette JE (2014) Mutation eller tap av p53 Forskjellig Endrer TGFB Handling i eggstokkreft. PLoS ONE 9 (2): e89553. doi: 10,1371 /journal.pone.0089553
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 12. september 2013, Godkjent: 21 januar 2014; Publisert: 20 februar 2014
Copyright: © 2014 Burdette et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis med tilskudd fra Liz Tilberis Ovarian Cancer Research Fund L /T /UIC /0.1.2011, Vahlteich Award fra UIC College of Pharmacy og American Cancer Society stipendiat Grant Illinois Division RSG-12-230-01-TBG . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den femte største årsaken til kreftdød og den mest dødelige gynekologisk sykdom blant amerikanske kvinner. I 2013 vil anslagsvis 22,240 tilfeller av eggstokkreft diagnostiseres, noe som resulterer i 14,030 dødsfall [1]. Den høye dødelighet kan tilskrives det faktum at over 60% av ovariekreft vil bli diagnostisert etter at sykdommen har spredd seg til fjerntliggende steder. Når metastasized faller fem-års overlevelse til under 30% [1]. Ineffektivitet av diagnose er først og fremst på grunn av en manglende forståelse av initierende hendelser og mekanismer for progresjon som gir opphav til kreft i eggstokkene, med få tidlig deteksjon strategier [2]. Viktigere, hvis eggstokkreft er diagnostisert tidligere, kan overlevelse være så høyt som 90% [1]. Denne statistikken viser det grunnleggende behovet for å bedre forstå tidlige mekanistiske hendelser på eggstokkreft som vil bistå med tidligere diagnose og bedre prognose for pasientene.
tumor suppressor p53 er den hyppigst muterte genet i alle menneskelige kreft [2] . p53 er en transkripsjonsfaktor som styrer mange cellefunksjoner, for eksempel cellesyklus, apoptose, og respons på DNA-skade [3]. Mest
TP53
mutasjoner er missense mutasjoner, hvor en enkelt nukleotid-base substitusjonen resulterer i enten dysfunksjon eller fravær av p53 aktivitet [4]. Disse mutasjonene føre til økt spredning, invasjon og metastasering i mange kreftformer [5]. Kreft Genome Atlas Network (CGAN) identifisert p53 som blir mutert i opptil 96% av kjemoterapi resistente, høy grad av serøs eggstokkreft, noe som indikerer en viktig rolle for p53 mutasjoner i serøs eggstokkreft [6]. Videre International Agency for Research on Cancer (IARC)
TP53
database viser at den hyppigste p53 mutasjon i serøs eggstokkreft er en arginin til histidin konvertering ved aminosyrerest 273 (R273H) i DNA-bindende domene , som står for 8% av alle p53 mutasjoner [7]. Mutant p53 R273H er blitt rapportert å spille en rolle i å fremme bryst og lunge cancer metastase [8], [9] ved å øke migrering og invasjon.
Et annet viktig signalveien som er modifisert i ovarian cancer er den transformerende vekst faktor Beta-reaksjonsveien (TGFp) [10]. TGFp er en superfamilie av peptid vekstfaktorer som regulerer vekst, differensiering, apoptose, og migrasjon [10]. TGFp-signaler ved å binde seg til en familie av serin /treonin-kinase-membranreseptorer, som fosforylerer nedstrøms signalmolekyler, Smads i første rekke 2 og 3 [11]. Når aktivert, disse Smad komplekser translocate til kjernen og samhandle med ulike co-aktivatorer og repressors å modulere Smad regulert transkripsjon [11], [12]. TGFp spiller en viktig rolle i å indusere vekstarrest i normale eggstokk-celler [13]. I noen kreftceller induserer TGFp apoptose og cellesyklus arrest, mens i andre kreftceller den mister evnen til å indusere vekst arrest og kan i stedet fremme celle invasjonen [10]. Den kan også spille en rolle i chemoresistance i avanserte serøs eggstokkreft [14]. Kjerne TGFB sti komponenter, de TGFB reseptorer, og Smad proteiner, er sjelden mutert eller tapt i eggstokkreft [5], noe som tyder på at forstyrrelse av TGFB veien skjer ved andre mekanismer.
Som p53 og Smads er begge transkripsjonsfaktorer, er p53 stand til å kommunisere med Smads å endre både p53 og TGFB signalveier [4]. Smads kan danne en transkripsjonen kompleks med p53 å indusere ekspresjon av gener som fremmer cellesyklus arrest, slik som p21 [4]. Smads og p53 binder seg til sine egne responsive elementer i arrangører av TGFB-responsive gener til synergi aktivere eller undertrykke transkripsjon [4]. Faktisk har det vært vist at p53 er nødvendig for TGFp-indusert cellesyklus-stans [4]. I tillegg opphever mutant p53 R273H TGFB-indusert cellesyklus arrest og fremmer metastatisk atferd ved å blokkere p63 i brystkreft celler [8]. I disse cellene, den mutante p53 /Smad komplekset inhiberer p63-mediert transkripsjon fører til invasjon i nærvær av onkogeniske Ras [8].
Gitt den høye prosentandel av p53-mutasjoner i ovarietumorer [6] og den siste bevis på at p53 og Smads virker sammen for å regulere metastase i bryst carcinoma celler [8], ble rollen av mutant p53 som respons på TGFp signalering i eggstokkreft undersøkt. p53 og TGFp er innblandet i mange kreftformer så som bryst og lunge på egen hånd [15], [16] og i konsert [8]. I bryst og lunge kreft, samhandler mutant p53 med Smads å endre transkripsjon av gener som regulerer metastase [8], men lite er kjent om hvordan p53 og TGFB samhandle på eggstokkreft. Faktorene som er nødvendige for vekst og metastase i bryst, lunge, og tykktarmskreft kanskje ikke er nødvendig i eggstokk-kreft, fører til vev-spesifikke virkninger av mutert p53-signalering [17]. To gener (
TMEPAI Hotell og
DKK1
) ble undersøkt basert på deres rolle i metastase i eggstokkreft.
TMEPAI
er en TGFB-indusert negativ regulator [18] og er involvert i TGFB-indusert metastaser i brystkreft cellelinjer [18], men har aldri blitt rapportert å være co-regulert av p53 og Smads.
DKK1
er en hemmer av Wnt signalering, som ofte er oppregulert i metastatisk kreft i eggstokkene, og er assosiert med dårlig prognose [19]. Maspin, et anti-metastatisk protein, ble også valgt som den har etablert regulering av p53 og Smads [20]. Den aktuelle studien vurdert om uttrykk for en av de vanligste p53 mutasjoner i eggstokkreft (R273H) endrer cellens respons på Smad signale å modulere celleproliferasjon og migrasjon.
Materialer og metoder
Cell kultur
Alle reagenser ble hentet fra Life Technologies (Carlsbad, CA) med mindre annet er angitt. OVCA 420, OVCA 429, og OVCA 432 er cellelinjer som tidligere har blitt publisert [21], [22], mens OVCAR5 celler er tilgjengelig gjennom National Cancer Institute (NCI) som en del av NCI60 tumorcellelinjen kreft narkotika skjermen [ ,,,0],23]. De OVCA 420, OVCA 429, OVCA 432, og OVCAR5 celler (gaver fra Dr. Gustavo Rodriguez og Dr. Teresa Woodruff ved Northwestern University) ble opprettholdt i minimalt essensielt medium (MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 % L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% natriumpyruvat, og 1% penicillin /streptomycin. OVCAR3 celler ble erholdt fra ATCC (Manassas, VA) og opprettholdt på det samme mediet som ovenfor, med unntak av kosttilskudd med 20% FBS. SKOV3-celler ble anskaffet fra ATCC og opprettholdt i McCoys 5A supplert med 2,3 g /l natriumkarbonat, 10% FBS, og 1% penicillin /streptomycin.
Stabile cellelinjer ble valgt ved hjelp av antibiotikaresistente plasmider som inneholder genet av renter. SKOV3 celler som stabilt uttrykker mutant p53 R273H [24] (Addgene, plasmid: 16439, donert av Dr. Vogel, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) ble valgt ved hjelp av 500 mikrogram /ml G418 (Gemini bio-produkter, West Sacramento , CA) og opprettholdt i SKOV3 media inneholdende 200 ug /mL G418. OVCA 420-celler som uttrykker p53 shRNA eller kryptert shRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble valgt ved anvendelse av 4 ug /ml puromycin (Sigma-Aldrich) og opprettholdt med 1 ug /ml puromycin. p53 villtype plasmid [24] ble kjøpt fra Addgene (Addgene plasmid: 16434, donert av Dr. Vogel, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD)
Normal udødeliggjort menneskelige eggstokkene overflaten epitelceller (. IOSE 80) var en gave fra Dr. Nelly Salzburg ved Universitetet i Vancouver og ble opprettholdt i 50% v /v Medium 199 og 50% v /v MCDB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 15% FBS, 1% L-glutamin, 1% penicillin /streptomycin, og 0,055% epitelial vekstfaktor (EGF, Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ) [25]. Normal menneskelig egglederen sekretoriske epitelceller (FTSEC) var en gave fra Dr. Ronny Drapkin ved Harvard University og ble opprettholdt i 50% v /v DMEM og 50% v /v F-12 (Mediatech, Manassas, VA), 1% L-glutamin, 1% penicillin /streptomycin, og 2% Ultroser G (Pall Corporation, Port Washington, NY) [26]. Muse eggstokkreft overflate epitelceller (Mose) ble isolert fra C57BL /6 mus og muse tubal epitelceller (MTEC) ble isolert fra CD1-mus som tidligere beskrevet [27]. Dyrkede celler ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator.
Luciferase-analyse
Celler ble sådd ut i en tetthet på 25 000 per brønn i 24-brønners plater og inkuberes over natten. Celler ble transfektert med 0,05 ug /brønn av en ekspresjonskonstruksjon som inneholdt den Smad bindende element promoter oppstrøms for luciferase-genet ved hjelp av Mirus transitt LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Den Smad responsive element plasmidet inneholder en CagA sekvens gjentatt tolv ganger oppstrøms av luciferase genet (gave fra Dr. Aris Moustakas ved Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Sverige). Plasmider for ekspresjon av villtype p53 eller mutant p53 R273H plasmider ble transfektert inn i cellene ved 0,05 ug /ml. -Celler ble transfektert i 24 timer i serum-supplert medium. Cellene ble deretter vasket med PBS og behandles med TGFβ1 ved 10 ng /ml (Sigma Aldrich) i 24 timer. SB-431542 (Selleck Chemicals, Houston, Texas) ble anvendt ved en konsentrasjon på 5 uM for alle luciferase-analyser. Protokollen og SBE-luciferase transfeksjonseffektiviteter var normalisert og kjøre som tidligere beskrevet [28]. Normal celle luciferaseaktivitet ble målt ved anvendelse av en Synergy Mx (BioTek, Winooski, VT).
proliferasjonsanalyse
Sulforhodamin B (SRB) analyser ble anvendt for å bestemme celletetthet. Cellene ble behandlet i 48 timer med TGFp (20 ng /ml), fulgt av kolorimetrisk analyse som tidligere er beskrevet [29]. Celleoverlevelse ble beregnet ved sammenligning av absorbans-verdier mellom behandlede og kontrollbrønnene. Bakgrunn ble subtrahert ved å måle absorbansen av 0,1 mM Tris-base-alene.
Strømningscytometri
OVCA 420, OVCA 432, og SKOV3-celler ble sådd ut i T25-kolber 24 timer før behandling. Medium inneholdende TGFp (20 ng /ml) eller løsningsmiddelkontroll ble tilsatt og inkubert i 48 timer. Etter behandling ble cellene trypsinert, vasket med PBS, resuspendert i 500 ul PBS, deretter fiksert i 4 ml 70% etanol og lagret ved -20 ° C over natten. De fikserte cellene ble vasket med PBS og farget med 500 ul propidiumjodid (PI) løsning [50 ug /ml PI, 90 enheter RNase A, 0,1% Triton X-100, 4 mmol /l citrat-buffer, 10 mM polyetylenglykol (PEG ) 4000]. Celler ble inkubert i PI løsningen i 20 minutter ved 37 ° C før den ble behandlet med 500 ul PI saltoppløsning (1 mg /ml PI, 0,1 ml 10% Triton X-100, 4 M NaCl-oppløsning, 10 mM PEG 4000) . Flowcytometrisk analyse ble gjort på en Beckman Coulter Elite ESP (Miami, Florida) med minst 30.000 enkelthendelser per reaksjon. Data ble analysert med Mod-fit programvare (Verity Software House, Inc., Topsham, ME).
Western blot analyse
Celler ble platet på 50.000 celler per brønn i seks-brønns plater, transfektert med egnede plasmider ved 0,05 ug /ml, og behandlet med TGFβ1 (10 ng /ml) i 24 timer. Å indusere p53 express, ble cisplatin (Fisher Scientific, NC9343338) behandling utført ved 125 mikrometer i to timer. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL). Cellelysat (30 ug) ble analysert ved 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulose. Blottene ble deretter blokkert med 5% melk i TBS-T og probet over natten med primære antistoffer. Antistoffene som ble brukt var menneskelig p53 (# 9282), p21 (# 9247), maspin (# 9117), CDC2 (# 9112) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) i en konsentrasjon på 1:1000; DKK1 (H-120) og mus p21 (F-5) (Santa Cruz Technology, Inc., Santa Cruz, CA) ble anvendt i en konsentrasjon på 1:200; TMEPAI 2A12 (Abnova, Taipei, Tiawan) ble brukt i en konsentrasjon på 1:500; og aktin (Sigma-Aldrich) ved en konsentrasjon på 1:1000. Anti-mus og kanin HRP-linked sekundær (Cell Signaling Technology, Inc.) ble brukt for alle blotter ved en konsentrasjon på 1:1000.
sårtilheling analysen
Celler ble sådd ut i 50 000 celler per brønn i en 24-brønns plate og inkubert over natten. En uniform såret ble skapt gjennom cellemonolaget ved hjelp av en pipette. Cellene ble vasket og behandlet med TGFβ1 (20 ng /ml) umiddelbart etter riper. Bildene er tatt på 0, 24, og 48 timer etter riper, og arealet av den grunnen ble analysert med ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Prosent nedleggelsen ble målt i forhold til 0 hr og brett endringen ble bestemt ut fra prosent nedleggelse av behandlet i forhold til ubehandlet.
Dyr, orgel kultur og immunhistokjemi (IHC)
Dyr ble innhentet, behandlet, og plassert som tidligere beskrevet [27]. Eggstokkene og egglederne ble dissekert og dyrket som tidligere beskrevet [30], [31]. Vekstmediet besto av a-MEM (Invitrogen), og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen) med 0,1% DMSO, 20 ng /mL TGFfi, 5 uM SB431542 (TGFfi inhibitor), eller 20 ng /mL TGFp pluss 5 uM SB431542 lagt til som behandlingsforhold. TGFp ble oppløst i vann, men 0,1% DMSO ble tilsatt til TGFp alene betingelse for å kontrollere for SB431542 oppløsningsmiddel. Bromdeoksyuridin (BrdU, Sigma; 10 uM) ble tilsatt til vekstmediet 24 timer før fiksering vev. Vev var forberedt på parafin seksjonering og immunhistokjemi ble gjennomført som beskrevet tidligere [27].
Proliferation bildebehandling
Imaging ble utført med et Nikon E600 mikroskop med en DS-Ri1 digitalkamera og NIS Elements programvare (Nikon Instruments, Melville, New York). ImageJ ble anvendt for å kvantifisere celleproliferasjon. Prosent spredning ble beregnet ved å dividere antall epitelceller flekker positivt for BrdU av det totale antall epitelceller.
Etikk uttalelse
Alle dyrene ble behandlet i henhold til National Institutes of Health retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr og den etablerte Institutional Animal bruk og vedlikehold protokollen ved University of Illinois i Chicago. Protokollen ble godkjent av Animal Care Utvalget ved University of Illinois i Chicago (protokollnummer: A08-250). Dyrene ble huset i en temperatur og lys kontrollert miljø (12 timer lys, 12 timer mørke) og ble gitt mat og vann ad libitum. Alle mus ble avlivet av CO
2 innånding fulgt ved halshugging.
Statistiske analyser
Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± standard feil. ANOVA etterfulgt av Tukey største multiple sammenligningstester ble benyttet for å vurdere forskjeller mellom forsøks- og kontrollgrupper. For sårheling analysen ble en paret t-test anvendt for å analysere kontroll og behandles i hver cellelinje, mens en uparet t-test ble anvendt ved sammenligning av de behandlede gruppene mellom to ulike cellelinjer. p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
TGFB induserer vekst arrest i eggstokkreft celler som uttrykker villtype p53
For å bedre forstå rollen til p53 i eggstokkreft. seks kjente eggstokkkreftcellelinjer ble analysert for p53-ekspresjon (fig. 1a). OVCA 420 og 429-celler uttrykker lave nivåer av p53-protein, i samsvar med rapporter om at de har villtype p53 [32]. På grunn av disse lave nivåene ble cisplatin behandling anvendt for å indusere og bekrefte p53-ekspresjon i OVCA 429 (fig. S1). SKOV3 og OVCAR5 viste ingen tegn til p53-protein ekspresjon, som er i overensstemmelse med det foregående funn at klassifisert dem som p53 null [7]. I kontrast, OVCA 432, og OVCAR3 utstilt rikelig p53 protein uttrykk på grunn av R277H og R248Q mutasjoner, henholdsvis (Tabell S1) [7].
(a) Western blot analyse av eggstokkreft cellelinjer demonstrere sin p53 status. Actin anvendt som en lasting kontroll. (B) Seks eggstokkreft cellelinjer (OVCA 420, 429, SKOV3, OVCAR 5, OVCA 432 og ovčar 3), sammen med fire primære, ikke-kreft cellelinjer (Mose, Mtec, IOSE80, og FTSEC) ble behandlet med eller uten TGFp (10 ng /ml) ved hjelp av SBE-luc plasmid. ANOVA ble utført separat for fold induksjon (TGFB) og brett undertrykkelse (hemmer og TGFB + hemmer) for å analysere betydning i forhold til ubehandlet. Data representeres som gjennomsnitt ± SEM, * p≤0.05.
For å vurdere hvordan p53 uttrykk modulerer evnen til cellene til å svare på Smad signalering, en luciferase assay ble ansatt for å bestemme hvilke celler var lydhør overfor TGFB indusert Smad transkripsjon (fig. 1b). Alle cellelinjene som ble testet, bortsett fra OVCAR5, demonstrerte TGFp-mediert transkripsjon som kan bli blokkert av SB431542, en TGFp inhibitor (data ikke vist).
Deretter effekten av TGFp på ikke-kreft stamceller ble undersøkt. Siden eggstokk flate epitel (OSE) og eggleder epitel (TEC) kan gi opphav til kreft i eggstokkene [33], var responsen av disse normale celler til TGFp undersøkt. For å overvåke aliserte nedstrøms av TGFp, ble SBE-luciferase-analyser utført på normal 2D murine OSE (MOSE) og muse-TEC (MTEC) celler, så vel som human udødeliggjort OSE (IOSE80) og human eggleder epitel (FTSEC). OSE og TEC-celler i betydelig grad svart på Smad-mediert transkripsjon indusert av TGFp i både mus og humane cellelinjer (Fig. 1b). Mose celler svarte med et høyere fold aktivering (21 ganger) av reporteren enn Mtec celler (7 ganger). p53 uttrykk i MOSE var tidligere bekreftet å være villtype [27], [34]. Mtec celler oppførte seg som villtype som reaksjon på cisplatin (fig. S2), mens den IOSE80 og FTSEC var funksjonelt null for p53 på grunn av immortalisering med SV40.
Basert på disse resultatene, tre cellelinjer (OVCA 420 , OVCA 432, og SKOV3) ble valgt for ytterligere å analysere virkningen av TGFB på spredning. Disse cellelinjer ble behandlet med TGFp (20 ng /ml) i 48 timer og cellesyklusprogresjon ble undersøkt ved hjelp av flow cytometri. TGFB behandling indusert G
0 /G
en cellesyklus arrest i OVCA 420 (Fig. 2a). OVCA 432 celler som uttrykker mutant p53, var ikke vekst arrestert av TGFB behandling (fig. 2b). Til slutt, TGFp ikke induserer cellesyklusarrest i SKOV3-celler, men snarere nedsatt antall celler i G
0 /G
1 (fig. 2c).
(a-c) OVCA 420, OVCA 432, og SKOV3 cellelinjer ble behandlet med 20 ng /mL TGFp i 24 timer og underkastet strømningscytometri-analyse. Fordelinger av celler i de tre faser av cellesyklusen er representert ved midlere prosenter +/- SEM. Statistisk signifikans representerer en forskjell mellom antall celler i hver syklus mellom behandlet og ubehandlet og representert med * for en økning av behandlede celler sammenlignet med ubehandlet;
#represents reduksjon av behandlede celler sammenlignet med ubehandlet; p≤0.05 (d) Western blot-analyse av de tre ovarian cancer cellelinjer probet for cellesyklusproteiner p21 og CDC2. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (E-f) proliferasjonsanalyse utført ved anvendelse av BrdU-inkorporering i 3D-organkultur av mus ovarier og rør. Enveis ANOVA ble utført. Data representeres som gjennomsnitt ± SEM * p≤0.05.
For ytterligere å bekrefte mekanisme for p53-Smad regulering cellesyklus, uttrykk for p21 og CDC2 ble evaluert i OVCA 420, OVCA 432, og SKOV3 celler behandlet med TGFp (fig. 2d). p21 er et cyklinavhengig kinase-inhibitor som er regulert av både p53 og Smads, og korrelerer med TGFp-mediert cellesyklus-stans [4]. CDC2 (eller CDK1) er en cyklinavhengig kinase og dens ekspresjon er i overensstemmelse med cellesyklusprogresjon [35]. TGFp behandling i OVCA 420 økt p21-protein ekspresjon (Fig. 2a og d), som ikke ble observert i de OVCA 432 og SKOV3-celler (fig. 2d). De OVCA 432 og SKOV3-celler uttrykte høye nivåer av CDC2 sammenlignet med OVCA 420 (fig. 2d). Deretter immunhistokjemi ble utført for å kontrollere spredning av normal mus ovarial flate epitel og oviductal epitel ved hjelp av en 3D-organkultur-system [30] ble behandlet med TGFp. Etter 48 timer, OSE spredning var betydelig redusert med TGFB behandling i forhold til DMSO kontroll (Fig. 2e). Til tross for at transkripsjonelt responsive, ble spredning ikke hemmet av TGFp behandling i oviductal celler i 3D-kultur (fig. 2f). Immortalisering av IOSE80 og FTSEC med SV40T antigen inaktiverer p53 [25], [26], derfor vekst analyser med TGFB ble ikke utført på disse cellene.
TGFB-indusert cellesyklus arrest oppheves i p53 mutant og null-celler
Varianter av OVCA 420 ble opprettet for å undersøke hvilken rolle p53 i TGFB-indusert cellesyklus arrest (tabell S1 og S2). Ved hjelp shRNA, ble endogen vill-type p53 effektivt slått ned i OVCA 420 (OVCA 420 p53 shRNA) celler i forhold til egge shRNA kontroll (OVCA 420 Scr) (Fig. 3a). I tillegg SKOV3-celler ble stabilt transfektert for å uttrykke mutant p53 R273H (fig. 3a). Vill-type p53 ble ikke stabilt transfektert inn i SKOV3-celler fordi cellene gikk alderdom og ikke kunne forplante seg som tidligere rapportert [36]. Transient transfeksjon av vill-type p53 inn i SKOV3-celler ikke umiddelbart induserer senescens, som tillater innsamling av data ved kortere tidspunkter.
(a) Western blot-analyse av stabile cellelinjer til knockdown av p53 med shRNA plasmid eller ekspresjon av mutant p53 R273H. C = kontroll, T = TGFp behandles. (B) SB-431542 (5 uM) ble anvendt for å hemme TGFp signalering. For hvert panel representerer data gjennomsnitt ± SEM p≤0.05 økning i forhold til ubehandlet for grupper som er merket med en, eller mellom behandlede grupper merket med b. (C) Celleoverlevelse. Andel TGFB behandlet celle overlevelse sammenlignet med ubehandlet. Data representerer gjennomsnitt ± SEM, * p≤0.05.
Først ble evnen til variant cellelinjer for å svare på TGFB undersøkt. Alle stabile cellelinjer opprettholdt evnen til å indusere Smad-mediert transkripsjon av et SBE-luciferase plasmid uavhengig av p53 status (fig. 3b). Luciferaseinduksjon forble det samme i OVCA 420 p53 shRNA og OVCA 420 Scr i forhold til de OVCA 420 ordnede celler (fig. 3b). På lignende måte ble det av SKOV3 stabil mutante p53 R273H celler ikke forandre TGFp-indusert Smad-mediert transkripsjon av luciferase-genet (Fig. 3b). Transient ekspresjon av villtype p53 i SKOV3-celler reduseres Smad-mediert transkripsjon i forhold til de SKOV3 mutant p53 R273H celler, men viste ingen signifikant forskjell sammenlignet med SKOV3 modercellelinje (Fig. 3b).
for å kunne vurdere proliferasjon i respons til TGFp (20 ng /ml), cellevekstanalyser ble utført etter 48 timers inkubering. Som ventet ble OVCA 420 Scr cellevekst trykt i respons til TGFfi, som var lik den foreldrelinjen (Fig. 3c). TGFB indusert veksthemming ble tapt i OVCA 420 p53 shRNA. Tilsvarende TGFfi ikke langsom spredning i enten forelder SKOV3 eller SKOV3 mutant p53 R273H cellelinje (Fig. 3c).
Mutant p53 R273H uttrykk hindrer TGFB-indusert migrering av SKOV3 celler
i tillegg til å påvirke proliferasjon, har TGFp og p53 også blitt vist å påvirke migreringen av tumorceller fra bryst og lunge [8], [9], [37]. Forrige litteratur antyder at mutant p53 kan fungere som en molekylær trigger slik TGFB å indusere pro-trekkende stimuli [38]. Derfor ble TGFp regulering av cellemigrering, i nærvær av vill-type mutant, og null p53 undersøkt ved anvendelse av en sårtilheling assay. TGFp indusert migrasjon i begge OVCA 420 Scr og OVCA 420 p53 shRNA-celler mellom 0 og 24 timer og 24 og 48 timer (fig. 4a). OVCA 420 Scr (p53 villtype) celler behandlet med TGFp migrerte betydelig mer enn ikke-behandlede kontroll mellom 0 og 24 timer, men ikke mellom 24 timer og 48 timer, mens OVCA 420 p53 shRNA celler behandlet med TGFp migrerte betydelig mer enn kontroll mellom 0 og 24 timer og mellom 24 og 48 timer (fig. 4a). Trekkende priser ble sammenlignet mellom behandlet OVCA 420 Scr og OVCA p53 shRNA. Knockdown av p53 er tillatt for en øket vandring sammenlignet med villtype-celler (fig. 4b).
(a) Sårhelende analyser ble utført på SKOV3 og OVCA 420 stabile cellelinjer. Cellemonolagene ble skrapet og behandlet med eller uten TGFp ved 20 ng /ml i 48 timer. Sårheling ble målt som en fold økning eller reduksjon sammenlignet med ingen behandling kontroll. Paret t-test ble brukt sammen med en p≤0.05. (B) Sammenligning av gangers økning av TGFp prøver fra 5 (a). Uparet t-test ble anvendt for å analysere betydning. Betydning er representert ved * og betyr en statistisk forskjell mellom cellelinjer. Data representeres som gjennomsnitt ± SEM, * p≤0.05.
Evnen SKOV3 null og SKOV3 mutant p53 R273H celler til å migrere som respons på TGFB ble også analysert. TGFp indusert migrering på null-p53 SKOV3-celler sammenlignet med ubehandlede celler mellom begge 0 og 24 timer og mellom (4a Fig.) 24 og 48 timer. Imidlertid ekspresjon av mutant p53 R273H i SKOV3-celler hemmet TGFp-indusert migrasjon, uten forandring mellom 0 og 24 timer, eller 24 og 48 timer sammenlignet med kontrollen (Fig. 4a). SKOV3 celler som uttrykker mutant p53 R273H demonstrert mindre TGFB-indusert migrering enn SKOV3 null-celler (figur 4b).
Uttrykk av mutant p53 R273H endrer TGFB indusert uttrykk av TMEPAI og DKK1
For å belyse mulige mekanismer som p53 og TGFB kan regulere migrasjon, ble pro-invasive målene kjent for å være regulert av enten p53 eller TGFB i eggstokkreft celler undersøkt. Maspin er en serin protease inhibitor som blokkerer metastase [20] og er kjent for å være co-regulert p53 og Smads i mammary epitelceller [20]. I tillegg er maspin uttrykk skal ha gått i eggstokkreft, og dette har vært assosiert med dårlig prognose og overlevelse [39]. Maspin var minimal indusert med TGFB behandling i OVCA420 og OVCA432 celler (fig. 5a), og ble ikke indusert i SKOV3. Overraskende, maspin viste ikke en avhengighet av TGFp behandling eller p53-ekspresjon i OVCA420 p53 shRNA eller SKOV3 R273H mutant p53-cellelinjer (data ikke vist), sammenlignet med foreldreceller tyder på at ytterligere trasé endre p53 og Smad regulering av maspin i eggstokkreft celler.
(a) OVCA 420 (p53 villtype), OVCA 432 (p53-mutant), og SKOV3 (null p53) celler ble behandlet med 10 ng /mL TGFp i 24 timer og analysert ved western blotting. Membraner ble undersøkt med Maspin, TMEPAI og DKK1 primære antistoffer. Aktin ble anvendt som en intern kontroll lasting. (B) OVCA 420 cellelinjer ble analysert ved western blot og analysert for pro-metastatiske faktorer TMEPAI, og DKK1. Aktin ble anvendt som en intern kontroll lasting. (C) SKOV3 cellelinjer ble analysert ved western blot og analysert for pro-metastatiske faktorer TMEPAI og DKK1. SKOV3 p53 WT ble transient transfektert med 100 ng /ml av p53 villtype-plasmidet. Aktin ble anvendt som en intern kontroll lasting.
TMEPAI er et TGFp-indusert protein som er kjent for å omdanne TGFp fra en tumor suppressor inn i en svulst promoter i brystkreft, og er assosiert med økt migrasjon i prostata og nyre karsinom [18], [40], [41]. Overekspresjon av TMEPAI har vært forbundet med mange kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene [42]. TGFp øket ekspresjon av TMEPAI i p53 villtype OVCA 420-celler og null-SKOV3-celler (fig. 5a). Mutant R277H p53 OVCA 432 celler viste en redusert induksjon av TMEPAI uttrykk. TGFp-indusert TMEPAI ekspresjon i OVCA 420 mutert p53 R273H transient-celler ble redusert sammenlignet med vill-type p53 og null-celler (fig. 5b). Tilsvarende TMEPAI induksjon av TGFp i SKOV3 mutant p53 R273H celler var lavere enn for SKOV3 villtype og null p53-celler (fig. 5c).
Til slutt DKK1, en Wnt-signale inhibitor, ble valgt som den differensielt regulert av villtype og mutert p53, og er også overuttrykt i sent stadium metastatisk eggstokk-kreft [19]. TGFp-indusert ekspresjon av DKK1 i SKOV3 null p53-celler (Fig. 5a). Denne økningen ble ikke sett hos villtype OVCA 420 eller mutant R277H p53 OVCA 432 celler. I OVCA 420 celler, generelle nivået av DKK1 var høyest i OVCA 420 p53 shRNA, med en svak induksjon på TGFB behandling (fig. 5b). OVCA 420 mutant p53 R273H hadde det laveste beløpet av DKK1, uten induksjon på TGFB behandling (fig. 5b).
