Abstract
Tumor progresjon er fremmet av Tumor-Associated Makrofager (TAM), og metastasis- indusert ben ødeleggelse av osteoklaster. Begge myeloide celletyper avhenger av CD115-CSF-en vei for deres differensiering og funksjon. Vi brukte 3 forskjellige musecancermodeller for å studere effektene av målretting kreft verts myeloide celler med et monoklonalt antistoff (mAb) som er istand til å blokkere CSF-1-binding til murine CD115. I mus med sub-kutane EL4 svulster, som er CD115-negative, anti-CD115 mAb utarmet F4 /80
+ CD163
+ M2-type TAMs og redusert tumorvekst, noe som resulterer i forlenget overlevelse. I MMTV-PyMT musemodell, ble den spontane utseendet av palpable brysttumorer forsinket når den anti-CD115 mAb ble administrert før ondartede overgang og svulster ble følbar først etter avslutning av immunterapi. Når administrert til mus allerede bærer etablerte PyMT svulster, anti-CD115 behandling forlenget overlevelse og forsterker virkningen av cellegift med Paclitaxel. Som vist ved immunhistokjemi, dette terapeutisk effekt korrelert med uttømming av F4 /80
+ CD163
+ M2-polarisert TAM. I en brystkreft modell av beinmetastaser, Mab anti-CD115 potent blokkert differensiering av osteoklaster og bein ødeleggelse aktivitet. Dette resulterte i inhibering av kreft-indusert vekttap. CD115 representerer således et lovende mål for cancer immunoterapi, siden en spesifikk blokkerende antistoff kan ikke bare inhibere veksten av en primærtumor inn TAM tømming, men også metastase-indusert bendestruksjon gjennom osteoklast inhibering
relasjon:. Avverge L , Accart N, Kintz J, Cochin S, Reymann C, Le Pogam F et al. (2013) terapeutiske effektene av anti-CD115 monoklonalt antistoff i mus Cancer modeller gjennom Dual Inhibering av tumorassosierte Makrofager og Osteoklaster. PLoS ONE 8 (9): e73310. doi: 10,1371 /journal.pone.0073310
Redaktør: Serge Nataf, Universitetet i Lyon, Frankrike
mottatt: 02.05.2013; Godkjent: 18 juli 2013; Publisert: 3. september 2013
Copyright: © 2013 avverge et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Laetitia avverge er mottaker av en industriell opplæring Konvensjonene av recherche (Cifre) doc. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne tilsluttet selskapet Transgene erklærer at dette ikke endrer sin tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Innledning
Makrofager og osteoklaster er myeloide celletyper som er kjent for å bidra til kreft progresjon på ulike stadier av sykdommen [1] -. [5]. Deres differensiering og funksjon reguleres av CD115 (M-CSFR, CSF-1R, c-fms), kodet av
c-fms
proto-onkogen, og som hører til klasse III reseptor-tyrosin-kinase-familien [6] . CD115 er den eneste celleoverflate-reseptor identifisert hittil for kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1), et viktig cytokin regulering av differensiering, proliferasjon og migrering av myeloide celler avstamning [7]. Interleukin-34 (IL-34) har mer nylig blitt identifisert som en annen CD115 ligand med sammenlignbare biologiske effekter [8]. Mens regulering og funksjon av IL-34 i løpet av kreft progresjon fortsatt å bli undersøkt, har eksperimentell og klinisk dokumentasjon i stor grad dokumentert den sentrale rollen CSF-1 i tumorutvikling og metastasering.
Hos mennesker CD115 og CSF- 1 overekspresjon er hyppige i et bredt utvalg av epiteliale tumorer (bryst, prostata, endometrial, cervikale, ovariekreft) og har blitt korrelert med mer aggressive sykdommer og dårlig prognose [9] – [13]. I brystsvulster, ble CD115 funnet å uttrykkes både av kreftceller og ved å infiltrere makrofager [14]. Det ble foreslått av S. Scholl
et al
. [15] på at CSF-1 kan ikke bare virke som en autokrin vekstfaktor for tumorceller, men også rekruttere makrofager til tumorstedet fremme tumorprogresjon. I MMTV-PyMT (PyMT) musemodell for spontan brystkreft, CSF-1 produsert av tumorceller ble faktisk vist seg å være en viktig kjemoattraktant for makrofager og for å forbedre deres infiltrasjon inn i primærtumor [16]. Tumorassosierte makrofager (TAM) regulerer den angiogene bryter gjennom induksjon av angiogene faktorer, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor og produsere matriks-metalloproteaser, som kan regulere angiogenese og metastase lette [17], [18]. Metastatiske celler krever CD115-positive makrofager for ekstravasasjon og vekst i sin metastatiske stedet [5].
In vivo
invasjons analyser har vist at TAMs ko-migrerer med brysttumorceller og bidra til tumorcelle-invasjon gjennom en parakrin sløyfe som involverer epidermal vekstfaktor, som produseres av makrofager, og CSF-1 produsert av cancerceller [19 ] – [21]. I tillegg har CSF-1 blitt vist å polarisere makrofager mot et alternativt aktivert, trofisk eller M2-type, utstyrt med immunundertrykkende aktivitet og kjennetegnes særlig ved CD163 uttrykk [22] – [28]. Høyt antall TAMs, som kan utgjøre den mest tallrike immunsuppressive cellepopulasjon i svulsten mikromiljøet, har blitt korrelert med dårlig prognose i mange kreftformer, inkludert bryst [1], [2], [4], [23]. På grunn av deres pleiotrope roller i tumorprogresjon, TAMs representere et viktig mål for kreftbehandling [29].
CSF-en overekspresjon av benmetastaser kan også bidra til differensiering av osteoklaster, som fører til benskader og smerter i kreftpasienter. Osteoklaster, som makrofager, er avhengig av CD115 /CSF-1 veien for deres differensiering [30]. CSF-en særlig induserer RANK uttrykk ved osteoklast forløpere [31] – [33]. Nyere resultater tyder på at CSF-1 er en potent stimulator av moden osteoklast ben-resorberende aktivitet, i tillegg til RANK /RANKL [32]. Både celleoverflaten og utskilt CSF-1 produsert av kreftceller metastatiske til bein kan bidra til å indusere osteoklastdannelse [3].
Vi har studert effekten av målretting CD115 i 3 forskjellige musekreft modeller preget av infiltrasjon av M2-polarisert TAMs i de primære tumorer, eller ved dannelse av osteolytiske benmetastaser. For dette formål anvendte vi et monoklonalt antistoff (mAb), AFS98, kjent for å blokkere CSF-1-binding til murine CD115-uttrykkende celler og å inhibere CSF-1-avhengig kolonidannelse av musebenmargsforløpere [34]. Dette mAb har blitt brukt av andre forfattere til å utarme myeloide celle undergrupper i ulike eksperimentelle musemodeller [19], [29], [35], [36].
Våre resultater markere potensialet for kreft immunterapi med en anti-CD115 mAb, som kan hemme tumorvekst ved å tappe TAMs, synergistisk med kjemoterapi og hindre bein ødeleggelse av osteoklaster.
Materialer og metoder
Antistoffer
Hybrid AFS98 sekresjon rotte anti-mus CD115 IgG
2a ble vennlig levert av Pr S. Nishikawa (Riken Senter for Developmental Biology, Japan). Det monoklonale antistoff ble produsert ved dyrking av hybridomet i fullstendig RPMI-medium inneholdende 5% FCS og renset på protein G (Millipore) og diafiltrering på Pellicon 3 30 kDa (Millipore). Rat IgG brukt som negativ kontroll var fra Rockland /Tebu-bio. I noen tilfeller, mAb AFS98 og isotype kontrollrotte-IgG
2a ble kjøpt fra eBiosciences.
Cellelinjer
EL4 murine lymfom cellelinje (ATCC TIB-39) ble dyrket i fullstendig DMEM-medium (Sigma-Aldrich) med 10% FCS (PAA Laboratories) med 40 ug /ml gentamycin (Schering-Plough), og 2 mM glutamin (Sigma). MDA-MB231SA-GFP6 menneskelige brystkreft celler som brukes i metastase-osteolyse modellen ble oppnådd ved Pharmatest (Turku, Finland) fra Dr Theresa Guise (Indiana University, Indianapolis, USA) [37], [38] og transfektert med pTurboGFP- N vektor (Evrogen).
immunfluorescens
mus formalinfiksert parafin-vevssnitt ble deparaffinized og utvannet, og epitoper ble hentet ved å koke i 10 mM citratbuffer pH 6. EL- 4 frysesnitt ble rehydrert og løst i aceton. Snittene ble mettet med 3% H2O2 og 10% geiteserum for å fjerne endogen peroksidase-aktivitet og ikke-spesifikk farging, henholdsvis, før inkubasjon i 90 minutter ved romtemperatur med antistoffer mot F4 /80 (BM8, ref. MF48000, Caltag) eller CD163 (M-96, ref. sc-33560, Santa Cruz). Se for seg system (HRP-konjugert polymer koplet til sekundære antistoffer, ref. K4003, Dako) og TSA-Cy3 (ref. SAT704A, Perkin Elmer) ble anvendt for signalforsterkning. Endelig Snittene ble motfarget med 0,5 ug /mL DAPI (Hoechst 33258, B-2883, Sigma) og montert i Mowiol® (Calbiochem). Isotype-matchet kontroll-antistoffer ble anvendt som negative kontroller. Bilder ble kjøpt med en optisk mikroskop 90i (Nikon) er utstyrt med 40x objektiv og epifluorescence (skala bar = 50 mikrometer). Signal ble kvantifisert på avsnitts skanner (Nanozoomer, Hamamatsu) ved hjelp av ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij) fri programvare. Til dette målet, ble bildene delt inn i 3 kanaler (rød, grønn og blå). Den blå kanalen gjør det mulig å kvantifisere de blå bildeelementer som avgrenser tumor seksjon overflate, mens den røde kanal måler de røde pikslene som svarer til den immunfarget overflate. Prosentene av positive celler er beregnet som (røde piksler /blå piksler) x100.
Preklinisk musemodeller
Forsøk utført i EL-4 og PyMT kreft modellene ble utført i full overensstemmelse med CEE-direktiv 2010/63 av 22 september
d 2010 om vern av dyr som brukes til eksperimentelle eller andre vitenskapelige formål og i samsvar med fransk lov (décret n ° 2013-118 1. februar
st, 2013 ) og godkjent av Comité National de Reflexion Ethique sur l’Eksperimentering Animale (CNREEA, Etisk Komité TG nummer 93). Forsøkene i brystkreft beinmetastase modell ble godkjent av den finske nasjonalkomiteen for Animal Experiments (lisensnummer STH667A).
EL4 Tumor Modell
Fem ukers gamle C57BL /6 mus (Charles River Laboratories) ble plassert i en bestemt patogen fri dyr anlegget og akklimatisert for en uke før forsøkene. På dag 0 ble 10
4 EL-4-celler injisert subkutant inn i høyre flankene av mus. Ti dager etter tumor-implantering, ble mAbs fortynnet i PBS dosert IP ved 10, 25 eller 50 mg /kg til grupper på 21 mus. Injeksjoner ble utført 3 ganger per uke i 3 uker. Tumorvolumer ble overvåket to ganger i uken av caliper målinger av hver dimensjon og beregnes etter følgende formel: V = 4/3 π (lengde /2) (bredde /2) (dybde /2). Tre mus per gruppe bærende EL4 svulster ble ofret på dager 20 og 27, når svulster ble samplet for makrofager deteksjon av immunfluorescens. Musene ble avlivet ved halshugging når tumorvolum nådd 3000 mm
3 eller når dyrene viste nød, for å unngå unødvendig lidelse. Statistikk på tumorvolum (n = 15 mus /gruppe) ble utført ved hjelp av Kruskal-Wallis test fulgt av Mann-Whitneys test for parvise sammenligninger. Log-rank test ble brukt for statistisk analyse av mus overlevelse (n = 15).
PyMT Tumor Model
MMTV-PyMT (PyMT) transgene mus ble hentet fra Mayo Foundation for medisinsk utdanning og forskning (Rochester, Minnesota) og ligger i en bestemt patogen fri dyre~~POS=TRUNC. Stammen ble opprettholdt ved tilbakekryssing på C57BL /6 bakgrunn. Når PyMT mus nådd 10 ukers alder (tidlig behandling), ble 10 mus per gruppe gis med mAbs gjennom IP rute, 3 ganger per uke i 4 uker for å studere svulstvekst og mus overlevelse. Sen behandlingen ble utført på lignende måte men ved å starte fra uke 16. MAb ble gitt i en dose på 50 mg /kg, fortynnet i PBS. Tumorvolumer ble overvåket hver 7. dag av caliper målinger av 3 dimensjoner og beregnes etter følgende formel: V = 4/3 π (lengde /2) (bredde /2) (dybde /2). For å unngå unødvendig lidelse, ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon når det totale antall tumorvolumer, det vil si summen av alle målbare tumorer, var over 2000 mm
3. Statistikk på tumorvolum ble utført ved hjelp av Kruskal-Wallis test fulgt av Mann-Whitneys test for parvise sammenligninger. Statistikk om overlevelse ble utført ved hjelp av Log-rank test. Ved gjentatte eksperimenter utført på 3 mus per gruppe ble dyrene avlivet ved cervikal dislokasjon en uke etter avslutningen av behandlingen. Tre til fem svulster per mus ble samplet for immunfluorescens og histopatologi.
Histopatologi
progresjon av primære svulster ble analysert på kreft seksjoner fra 4 til 25 uker gamle PyMT mus. Kort sagt ble brystkjertlene fiksert i 10% formalin ved 4 ° C og deretter dehydrert. Vev ble parafininnstøpte, seksjonert og farget med hematoxylin og eosin (H E). Tumor iscenesettelse ble utført basert på de fire-trinns klassifisering tidligere beskrevet for PyMT mus [39].
MDA-MB231 Breast Cancer Metastase-osteolyse Modell
Fem uker gammel kvinne atymiske nakne mus (Harlan) ble bedøvet med Xylazin (4-5 mg /ml) og ketamin (75-92 mg /ml) ble inokulert med MDA-MB231SA-GFP6-celler (10
5-celler i 0,1 ml PBS) ved intrakardial rute . Tildeling til grupper på 15 mus ble utført ved randomisering prosedyre basert på kroppsvekt. Behandlingen ble startet på dag intrakardiell inokulasjon, på dag 0. Femti mg /kg av mAb AFS98 eller kontroll rotte IgG (Rockland, Tebu-bio) ble administrert IP 3 ganger per uke, mens zoledronsyre (Zometa, Novartis) ble injisert SC ved 0,1 mg /kg på dagene 0 og 14. analgesi (buprenorfin 0,1 mg /kg, gitt subkutant to ganger daglig) ble benyttet for de siste 5 dager av studien. Blodprøver for analyse av tartrat-resistent sur fosfatase isoformen 5b (TRACP 5b) ble samlet før begynnelsen av administrasjonen og på dager 17 og 24. Serum TRACP 5b ble analysert ved hjelp av musefelle ™ ELISA kit (IDS Ltd). Statistisk analyse av resultatene ble utført ved hjelp av en enveis ANOVA etter logaritmisk transformasjon av dataene, etterfulgt av Dunnetts test for parvise sammenligninger. Osteolyse ble målt ved radiografisk analyse av dyrene under bedøvelse før ofre ved hjelp av Faxitron Specimen Radiografisk System MX-20 D12 (Faxitron Corp.) og Faxitron DICOM 3.0-programvare. Minst to røntgenbilder (begge bakbena og thorax) per dyr ble tatt hver gang. Lesjonen antall og areal i bakbena ble bestemt ut fra bildene med MetaMorph bildeanalyse programvare. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Kruskal-Wallis test fulgt av Mann-Whitneys test for parvise sammenligninger. Musene ble avlivet på dag 24 ved cervikal forvridning under anestesi. Relativ kroppsvekt ved ofring ble beregnet som en prosentandel i forhold til dag 0. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av en enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts test for parvise sammenligninger. Fire 4 um tykke midt sagittal seksjoner ble oppnådd fra begge bakbena for hvert dyr. Trabekulært ben områder og tumorområdet ble målt fra Masson-Goldner Trichrome-farget seksjoner og osteoklaster i tumor-bein grensesnittet ble beregnet ut fra TRACP-farget seksjoner. Antallet av osteoklaster ble dividert med lengden av svulst-ben grensesnitt. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts test for parvise sammenligninger.
Resultater
Anti-CD115 mAb depletes TAMs og har terapeutisk effekt i en solid svulst Model
Innledende forsøk ble utført for å vurdere virkningsmåte av mAb AFS98. Konkurranse ELISA ble utført, hvori løselige murine CD115-Fc ble ko-inkubert med immobilisert murin eller human CSF-1 i nærvær av økende konsentrasjoner (Figur AFS98 S1). AFS98 blokkerte bindingen av CSF-1 fra begge art til mus CD115, hvilket viser at dens hemmende effekt på reseptoren funksjon sannsynligvis avhengig av konkurranse med liganden.
Effekten av målretting CD115 mAb med AFS98 på tumorvekst ble først undersøkt i en modell ved hjelp av kreft EL4 thymoma-celler implantert subkutant i flankene av C57BL /6 mus. EL4 celler er CD115-negative
in vitro
som bestemmes av IC /FC med mAb AFS98 (data ikke vist). Tumorvekst ble retarderes i mus som ble behandlet i 3 uker med anti-CD115 mAb utgangs ti dager etter implantering, sammenlignet med PBS-behandlede mus (figur 1A). Bare maksimal testet dose på 50 mg /kg ga en statistisk signifikant reduksjon i tumorstørrelser (p = 0,0245 og p = 0,0166 (n = 15) på dager 23 og 27, henholdsvis), mens det ikke var noen effekt med 10 eller 25 mg /kg. Følgelig overlevelse var signifikant forlenget (p = 0,0368) bare i mus behandlet med 50 mg /kg AFS98 (figur 1B). F4 /80 farging av IHC viste at makrofagen populasjonen var sterkt redusert i tumorer samplet under AFS98 behandlingen, både på dag 20 (figur 2A, B) og 27 (data ikke vist). Ekspresjon av M2-type makrofag markør CD163 var også betydelig redusert i EL4 tumorer fra mus behandlet med 50 mg /kg AFS98 (figur 2C, D). Disse resultater antyder at den terapeutiske effekten av anti-CD115 mAb i denne tumormodellen, kan være en konsekvens av M2-type TAM uttømming.
tumor-bærende mus ble behandlet med 10, 25 eller 50 mg /kg mAb AFS98 eller PBS, IP, fra dag 7 etter svulst implantasjon. A. Tumorvolumene er vist som gjennomsnitt ± SEM. * Mann-Whitney test p 0,05 sammenlignet med tumorvolumer av PBS-behandlede mus (n = 15). B. Prosentvise overlevende mus i hver gruppe. * Log-rank test p. 0,05 sammenlignet med PBS-behandlede mus (n = 15)
EL-4 svulster samplet på dag 20 fra mus behandlet med enten PBS (A, C, E) eller 50 mg /kg mAb AFS98 (B, D, F), ble analysert ved IF med anti-F4 /80 mAb (A, B), anti-CD163 mAb (C, D) eller irrelevant isotype kontroll (E, F ). Blå: DNA; Red: F4 /80
+ makrofager (A, B) eller CD163
+ M2-type makrofager (C, D). Seksjoner viste oppnådd fra en tumor er representative for tre analyserte per gruppe. F4 /80 (G) og CD163 (H) farging ble kvantifisert i svulstene som vises i AD.
Fordi CSF-1 er normalt fjernes fra sirkulasjonen ved CD115 endocytose [40], og siden AFS98 hindrer CSF-1 /CD115-binding, vi titrert nivåene av sirkulerende CSF-1 etter bare ett mAb injeksjon. Så snart en dag etter administrasjon, AFS98 ved alle doser testet dramatisk økte CSF-1 serumkonsentrasjoner (Figur S2). Mens serum CSF-1 var nesten ikke påvises ved hjelp av ELISA i buffer-behandlede mus, dens konsentrasjon nådde 2000 pg /ml av en dag etter AFS98 injeksjon. Betydningen og varighet av CSF-1 akkumulering i serum ble korrelert med doser av AFS98 administrert. Ved 25 eller 50 mg /kg, AFS98 hadde en enda mer drastisk effekt på CSF-1 serumkonsentrasjon, som fortsatt var øket 19 dager etter injeksjon av 50 mg /kg. Dette resultatet kan forklare den høye dosen av AFS98 (50 mg /kg) som kreves for å oppnå en terapeutisk effekt, ettersom mAb må konkurrere med CSF-1 for binding CD115.
anti-mus CD115 mAb behandling Utsetter Utseende av brysttumorer i PyMT mus
Transgen MMTV-PyMT mus som uttrykker polyoma midten T onkogen under kontroll av musebrysttumorvirus-promoteren, spontant utvikle brysttumorer med trinn sammenlignes med den menneskelige situasjon [16], [ ,,,0],39]. Basert på den firetrinns klassifiseringen er beskrevet i PyMT mus oppdrettet på en C3H /B6 bakgrunn av Lin et al [39], vi har karakterisert histologisk progresjon av mammatumorer hos PyMT mus på C57BL /6 genetisk bakgrunn (figur 3). Ved 4 ukers alder, noen melkekjertler var hyperplasic med epitelceller prolifererende innen acini og danne samlings eller multifokale klynger på terminalen kanaler. I tillegg til den hyperplasi, ble adenomer (mammary intraepitelial neoplasi MIN) observert ved 6 uker gamle, karakterisert ved faste ark av prolifererende epitelceller fullstendig fylling av acini men likevel begrenset av en basalmembran. Foci av leukocyttisk infiltrasjon var assosiert med økt vaskularisering. Den innledende fasen av ondartet overgang, betegnet tidlig karsinom (EC), ble først oppdaget som starter ved 10 ukers alder. EF var preget av en endring i kjernefysisk morfologi, forsvinningen av basalmembraner og høy tetthet leukocyttinfiltrater rundt acini. Mammary svulster ble håndgripelig mellom 13 og 14 ukers alder og på uke 16, alle musene hadde følbar svulster. Avanserte invasive karsinomer (sen) (LC) først i området rundt 18 uker gamle, karakterisert ved faste ark av epitelceller og tap av acinar strukturer, med forsvinningen av basalmembraner og tilstedeværelsen av nekrotiske områder. LC ble alltid forbundet med lungemetastaser.
Percentile fordeling av tumorstadier preget av histopatologi. Fire til seks melkekjertlene ble fjernet 2-6 PyMT mus ved de angitte tidene.
Vi tar sikte på å studere effekten av anti-CD115 mAb behandling på utviklingen av disse svulster på melkekjertler. På tumorsnitt på EC fasen ble alle F4 /80-positive makrofager infiltrerende farget med et anti-CD115 antistoff (figur S3). I motsetning til dette trenger PyMT tumorceller ikke uttrykker CD115 [16] og kan derfor ikke direkte rettet ved AFS98 behandling. Den mAb ble administrert (50 mg /kg, IP 3 ganger per uke) til PyMT mus fra uke 10 til 13, samtidig med MIN EC overgang (figur 3). Palpable brysttumorer først vesentlig senere (15,8 +/- 0,9 uker, n = 10) enn i mus behandlet med isotype kontroll (13,8 +/- 1,4 uker, p = 0,0112, n = 10) eller med PBS (14,4 +/- 1,1 uker, p = 0,020, n = 10) (figur 4A). Tumor størrelser ble signifikant redusert med AFS98 ved uke 13 (p = 0,0149 vs PBS og p = 0,0098 vs rotte-IgG), og ved uke 14, etter avslutning av behandlingen (p = 0,0183 vs rotte IgG- og p = 0,0212 vs PBS-behandlede mus) (figur 4B). AFS98 behandling signifikant forlenget overlevelse sammenlignet med rotte-IgG (p = 0,018) (figur 4C). Av notatet, behandling med rotte-IgG hadde en skadelig virkning på overlevelse sammenlignet med PBS-behandlede gruppen (p = 0,0283). Den terapeutiske virkning av anti-CD115 mAb ble mistet to uker etter avslutning av behandlingen. Dette kan forklares ved den dramatiske oppregulering av sirkulerende CSF-1, som forekommer i C57BL /6 (figur S2) og i PyMT mus (data ikke vist) etter flere mAb administrering.
Ved 10 ukers alder, MMTV -PyMT mus ble behandlet med 50 mg /kg mAb AFS98, kontrollrotte-IgG eller PBS, injisert IP 3 ganger per uke fra uke 10 til uke 13. A. utseendet av palpable tumorer ble forsinket i AFS98-behandlede mus. Den midlere alder (i uker ± SEM) av følbar tumordeteksjon er vist for hver av de 3 musegruppene. * Mann-Whitney test p 0,05 sammenlignet med Rotte IgG og PBS-behandlede mus (n = 10). B. Tumorvolumene er vist som gjennomsnitt ± SEM. * Signifikant forskjell i tumorvolum ved hjelp av Mann-Whitney test, p 0,05 mellom gruppene behandlet med Rotte IgG og PBS (n = 15). C. Prosenter av overlevende mus i hver gruppe. * Log-rank test p. 0,05 sammenlignet med den angitte mus (n = 10)
Som funnet i EL4 SC svulst modell, makrofag markør F4 /80 var sterkt redusert i primær bryst svulster fra PyMT mus behandlet med 50 mg /kg AFS98 samplet en uke etter avsluttet behandling, sammenlignet med PBS-behandlede mus (figur 5A, B, G). Antallet M2-polariserte makrofager som er identifisert av CD163 farging ble også redusert i tumorer fra anti-CD115-behandlede mus (figur 5C, D, H). Imidlertid angiogenese var ikke påvisbart inhibert som funnet av CD31-farging av disse svulstene, samplet en uke etter avsluttet behandling (data ikke vist).
F4 /80 (A, B) eller CD163 (C, D ) ekspresjon i brysttumorer samplet ved uke 14 fra mus behandlet med enten PBS (A, C) eller mAb AFS98 (B, D). Farging med irrelevant isotype kontroll, er vist i E, ble F. seksjoner vist erholdt fra en mus er representative for tre analyserte per gruppe. Blå: DNA; Red: F4 /80
+ (A, B) eller CD163
+ (C, D) makrofager. F4 /80 (G) og CD163 (H) farging ble kvantifisert i tumorer fra mus behandlet med enten PBS, kontrollrotte-IgG eller mAb AFS98.
sen anti-mus CD115 mAb behandling forlenger overlevelse av PyMT Mus og forsterker effekten av kjemoterapi
Vi studerte deretter effekten av anti-CD115 mAb behandling gitt senere under tumorprogresjon. AFS98 ble dosert (50 mg /kg, IP 3 ganger per uke, for 3 uker) fra uke 16, når alle svulster var håndgripelig, det meste på EC scenen uten ennå å nå LC scenen (figur 3). En uke etter avslutning av behandlingen (uke 20), ble størrelsen av primære tumorer betydelig redusert i den AFS98-behandlede gruppe sammenlignet med PBS-(p = 0,0101, n = 10), men ikke til de IgG-behandlede mus (p = 0,1457, n = 10) (figur 6A). Overlevelse ble betydelig forlenget ved AFS98 sammenlignet med enten PBS (p = 0,0031) eller IgG (p = 0,0474) (figur 6B). Som sett når behandlingen ble igangsatt tidligere (figur 5), utarming av CD163
+ makrofager ble observert i svulster fra mus behandlet med AFS98 (figur S4).
Ved 16 ukers alder, transgene PyMT mus var administrert 50 mg /kg mAb AFS98 eller isotype kontroll eller PBS, IP, 3 ganger per uke i 4 uker, alene (A, B) eller kombinerte (C, D) med paklitaxel ved 5 mg /kg, IP, en gang i uken for 3 uker. A. Tumor volumer er representert som betyr ± SEM. * Mann-Whitneys test p 0,05 for AFS98- sammenlignet med PBS-behandlede mus. I uke 20, * p 0,05 for AFS98- og Rat IgG- vs PBS-behandlede mus. B. Prosentandelen av overlevende mus var signifikant økt i den AFS98-behandlede gruppen. * Log-rank test p 0,05 mellom AFS98- og Rat IgG-behandlede grupper og ** p 0,005 mellom AFS98- og PBS-behandlede mus (n = 10). C. Tumor volumer er representert som betyr ± SEM. * Mann-Whitneys test p 0,05 for kombinasjonen paklitaksel + AFS98 sammenlignet med paclitaxel + PBS, og p 0,01 sammenlignet med paclitaxel + Rat IgG. ** P 0,01 og *** p 0,001 for Paclitaxel + AFS98 sammenlignet med paclitaxel + Rat IgG eller PBS (n = 10). D. Andelen overlevende mus ble betydelig økt med AFS98 kombinert med Paclitaxel. ** Log-rank test p. 0,01 for mus behandlet med paklitaksel + AFS98 sammenlignet med paclitaxel + Rat IgG eller PBS
For å studere effekten av anti-CD115 mAb i forbindelse med kjemoterapi, vi kombin den sistnevnte AFS98 behandling med paclitaxel (5 mg /kg, IP en gang per uke). Paclitaxel ved denne dosen viste ikke signifikante terapeutiske effekter, men en trend mot reduksjon i tumorvekst. I PyMT mus behandlet med paclitaxel i kombinasjon med AFS98, ble størrelsen av primære tumorer betydelig redusert sammenlignet med PBS (p = 0,0155 p = 0,0039 og p = 0,0009 ved uke 17, 18 og 19, henholdsvis n = 10) eller rotte-IgG (p = 0,0077 p = 0,0022 p = 0,0005 og ved uke 17, 18 og 19, henholdsvis n = 10) (figur 6C). Overlevelse ble betydelig forlenget når Paclitaxel ble kombinert med AFS98, sammenlignet med enten PBS (p = 0,0014) eller IgG (p = 0,00072) (figur 6D), som viser at anti-CD115 mAb behandling kan forsterke effekten av kjemoterapi.
Anti-mus CD115 mAb hemmer osteoclasts og Bone ødeleggelse i en Breast Cancer Bone metastase Modell
Vi undersøkte effekten av CD115 blokade på metastase-indusert osteoklastisk degradering. For å oppnå dette, har vi gjort bruk av en modell hvor humane brystcancerceller ble injisert i den venstre hjerte ventriklene atymiske mus for å indusere osteolytiske benmetastaser [37], [41]. MDA-MB231-celler er kjent for å utskille humant CSF-1 [42], som kan aktivere murine CD115 [7]. MDA-MB231-celler er rapportert å uttrykke human også CD115 [42], men mAb AFS98 er spesifikk for muse-CD115 [34]; Derfor, i denne modellen, anti-CD115 mAb behandling vil bare målrette murine myeloid cellerommet. Behandling av mus med 50 mg /kg mAb AFS98 potent hemmet utviklingen av osteolytiske lesjoner visualisert ved røntgen-radiografi (figur 7A). AFS98 viste en aktivitet som ligner på zoledronsyre, en standart-of-care inhibitor av osteolyse som ble benyttet som positiv kontroll. Begge forbindelser svekket område, så vel som antallet av osteoklastisk lesjoner sammenlignet med PBS eller rotte-IgG-kontroller. AFS98 og zoledronsyre var like potente mot å redusere osteoklast tall, som vist ved den osteoklast markør tartrat-resistent sur fosfatase 5b (TRACP 5b) som ble redusert i serumet til mus på dag 17 (data ikke vist) og 24 (figur 7B) . Målt ved histomorfometri, ble osteoklastene tallene på tumor bengrenseflaten sterkt redusert med AFS98 eller zoledronsyre. Begge forbindelser økte totalt og trabekulært ben områder, med en sterkere effekt av zoledronsyre på trabekulært ben områder (figur 7C). Kreft-forbundet vekttap ble hemmet på samme måte av zoledronsyre eller AFS98. MDA-MB231 cellelinje anvendt i denne studien som stabilt uttrykker GFP [37]. Hele kroppen tumorbyrde analysert ved fluorescens avbildning ble ikke endret ved enten anti-CD115 mAb eller zoledronsyre behandling, sammenlignet med kontrolldyrene (data ikke vist). Til sammen viser disse resultatene at den anti-CD115 mAb hemmer metastase-indusert bendestruksjon ved å målrette osteoklaster.
atymiske nakne mus implantert med MDA-MB231 tumorceller ble behandlet med mAb AFS98, kontrollrotte-IgG (både IP hos 50 mg /kg, IP-3 ganger i uken), zoledronsyre (0,1 mg /kg) eller PBS (begge SC, på dagene 0 og 14). 7.A. Bone-beskyttende effekten av anti-CD115 mAb. Osteolytiske lesjoner ble målt ved slutten av forsøket.
Venstre
: Totale osteolytiske lesjoner områder (mm
2, mener + SD) er vist som summen av de områdene av bein lesjoner i høyre og venstre tibia og femur.
Høyre
: Antall osteolytiske lesjoner (gjennomsnitt + SD). Resultatene er vist som grevene av enkelte bein lesjoner i høyre og venstre tibia og femur. 7.B. Osteoklast-inhiberende virkning av anti-CD115 mAb.
Venstre product:: Den osteoklast markør TRACP 5b ble titrert i serum samplet på dag 24. Resultatene er uttrykt som relativ endring (%) i serum TRACP 5b fra dag 0 til dag 24 (gjennomsnitt + SD).
Høyre
: Profiler fra baklemmene av hvert dyr ble farget for TRACP 5b og osteoclast nummerert på tumor-bein grensesnitt (gjennomsnitt + SD). Osteoklast tall ble dividert med lengden av dette grensesnittet. 7.C. Effektene av anti-CD115 mAb i trabekulært ben og hemming av kreft-indusert vekttap.
Venstre
: trabekulært ben område (mm
2, mener + SD) av hvert dyr ble bestemt av histomorfometri. Lin et al.
