Abstract
Akkumulerende data indikerer at kreft stamceller bidra til tumor chemoresistance og deres utholdenhet endrer klinisk utfall. Vår tidligere studie har vist at eggstokkreft kan være initiert av eggstokkreft initiere celler (OCIC) preget av overflateantigenet CD44 og c-KIT (CD117). Det er vist eksperimentelt at en mikroRNA, nemlig MIR-193a, rettet mot c-KIT mRNA for nedbrytning og kan spille en avgjørende rolle i eggstokkreft utvikling. Hvordan MIR-193a er regulert er dårlig forstått, og den nye bildet er sammensatt. For å løse denne kompleksiteten, foreslår vi en matematisk modell for å utforske hvordan østrogen-mediert oppregulering av et annet mål av MIR-193a, nemlig E2F6 kan svekke funksjonen til MIR-193a på to måter, en gjennom en konkurranse av E2F6 og c -KIT transkripsjoner for MIR-193a, og andre ved binding av E2F6 protein, i forbindelse med en polycomb kompleks, til arrangøren av MIR-193a til ned-regulere transkripsjon. Vår modell forutsier at denne bimodal kontroll øker ekspresjonen av c-KIT, og at den andre modus av epigenetisk regulering er nødvendig for å generere en svitsje oppførsel i c-kit og E2F6 uttrykk. Ytterligere analyse av TCGA eggstokkreft datasett viser at eggstokkreft pasienter med lav uttrykk for EZH2, en polycomb-gruppe familie protein, viser positiv korrelasjon mellom E2F6 og c-KIT. Vi formodning at en samtidig EZH2 hemming og antiøstrogenbehandling kan utgjøre en effektiv kombinert terapeutisk strategi mot eggstokkreft
Citation. Cheng FHC, Aguda BD, Tsai JC, Kochańczyk M, Lin JMJ, Chen GCW, et al. (2014) en matematisk modell av Bimodal epigenetiske Kontroll av MIR-193a i eggstokkreft stamceller. PLoS ONE 9 (12): e116050. doi: 10,1371 /journal.pone.0116050
Editor: David Wai Chan, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 22 september 2014; Godkjent: 30 november 2014; Publisert: 29.12.2014
Copyright: © 2014 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av forskningsmidler fra departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (NSC102-2320-B-194-006, NSC102 -2115-M-194-007-MY2, MOST103-2911-i-194-504 og MOST103-2320-B-194-002), Nasjonalt Senter for teoretisk og biovitenskap (NCTS), og National Chung Cheng University (NCCU Tverrfaglig Science gi 103-03), Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Medforfatter Baltazar D. Aguda er ansatt DiseasePathways LLC. DiseasePathways LLC gitt støtte i form av lønn for forfatteren BDA, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den spesifikke rolle denne forfatteren er uttrykt i «forfatterens bidrag» -delen
Konkurrerende interesser:. Medforfatter Baltazar D. Aguda er ansatt DiseasePathways LLC. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft og den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner [1]. Som eggstokkreft har få symptomer tidlig i utviklingen, er de fleste av pasientene diagnostisert med sene stadier (III og IV) av sykdommen. Den 5-års overlevelse er generelt mindre enn 20% for pasienter med avansert stadium sykdommen til tross for terapeutiske fremskritt, mens overlevelse for pasienter med stadium I eller II sykdom er større enn 80% i samme periode [2]. Selv om dagens kjemoterapeutika demonstrere en mer enn 90% fullført svarprosenten i tidlig stadium svulster, er bare en 20-30% partiell responsraten observert i avansert stadium svulster samt i chemo-resistente tilbakefall svulster [3]. En bedre forståelse av molekylære endringer av eggstokkreft kreftutvikling kan føre til bedre terapeutiske strategier for denne dødelige sykdommen.
En voksende hypotese sier at kreft oppstår fra en liten bestand av selvfornyende kreft initiere celler (CIC) [4 ]. Disse CIC er tenkt å ha karsinogent potensial og forbedret narkotika motstand i en svulst, og er i stand til å repopulate kreft kolonier
in vivo
. Vi har tidligere isolert eggstokkene CIC (OCICs) fra eggstokkreft pasienter [5]. Disse OCICs utstillings økt resistens mot cisplatin og taxol, og er preget av uttrykket av flere celleoverflatemarkører, inkludert c-KIT (CD117, eller stamcellefaktor reseptor). Imidlertid er mekanismen for hvordan OCICs oppstår og hvordan disse celleoverflatemarkører er transkripsjonelt styres er ikke fullt ut forstått.
Østrogen er en viktig regulator av vekst og differensiering av normale eggstokker [6] og er involvert i utviklingen av eggstokk-kreft [7]. I denne forbindelse har studier utforsket risikoen for eggstokkreft hos kvinner som bruker hormonbehandling (HRT) ved behandling av menopausale symptomer [8], [9], [10]. For eksempel, en studie med en million kvinner antydet at kvinner som behandles med HRT var assosiert med økt risiko for eggstokkreft [11]. Imidlertid er rollen til østrogen i eggstokkene kreft ikke fullt ut forstått.
epigenetiske endringer i genomet spille en avgjørende rolle i transkripsjonen kontroll og avvikende epigenetisk modifikasjon er nå ansett som et kjennetegn på kreft [12]. Epigenetiske modifikasjoner er ansvarlig for å kontrollere genekspresjon som gir mulighet for spesifikke fenotyper [13], [14]. Blant dem er DNA-metylering en av de mest karakteriserte epigenetisk endring som finner sted i 5′-posisjon av cytosin i CpG-dinukleotider som resulterer i dannelsen av 5-metylcytosin. DNA metylering som skjer på klynger av CpG områder (kalt CpG øyer) i promoter-regionen i en tumor suppressor genet resulterer i transcriptional undertrykkelse og tumorigenesis i noen tilfeller [15]. Også betraktet som viktige regulatorer av genekspresjon, er Mirs referert til som tumor-suppressor-Mirs hvis de regulerer ekspresjonen av et oncogen [14]. Studier fant at tumor-suppressor-Mirs ofte er nedregulert ved genetiske eller epigenetiske mekanismer som fører til oppregulering av onkogener og akselerasjon av tumorigenesis [16]. For eksempel ble MIR-34b /c (som ligger på arrangøren CpG island av et gen) funnet å være epigenetiske brakt til taushet av DNA metylering i metastatiske kreftceller [17]. Re-uttrykk for MIR-34b /c trykkes kreft invasjon
in vitro Hotell og
in vivo
.
Vi er interessert i MIR-193a, som ligger på kromosom 17q11. 2 og innebygd i en CpG island. Studier har funnet at Mir-193a ble epigenetiske brakt til taushet av arrangøren hypermethylation i akutt myelogen leukemi (AML) og lungekreft [18], [19]. Viktigere, mål MIR-193a stamcelle markør, c-KIT, for undertrykkelse i AML [18], [20]. En annen eksperimentelt bekreftet målet på MIR-193a er E2F6 [21]. Oppregulering av E2F6 er blitt observert i brystkreftceller etter behandling med østrogen [22]. Innenfor E2F familien av transkripsjonsfaktorer som er involvert i cellesykluskontroll med transkripsjonen aktivering eller represjon [23], ble E2F6 funnet å være en transcriptional repressor er i stand til å assosiere med det histon-lysin-N-metyltransferase EZH2, noe som er en viktig bestanddel av den polycomb komplekse [24], [25], og med DNA metyl-transferase DNMT3b, noe som åpner for rekruttering til det undertrykkende komplekse [26].
Som rollen MIR-193a i eggstokkreft er foreløpig ukjent , hypoteser vi at E2F6 protein kan undertrykke uttrykket av MIR-193a, både direkte som en DNA-bindende transcriptional repressor og indirekte gjennom promotering av polycomb kompleks sammenstilling. Faktisk, eksistensen av bindingssteder for E2F6 protein i formidler av MIR-193a som demonstrert av kode chip-Seq data [27] synes å antyde at langsiktig undertrykkelse av MIR-193a ved E2F6 kan føre til epigenetisk stanse av MIR -193a. Disse hendelsene kan føre til oppregulering av c-kit og utløse utbruddet av OCIC fenotype, og dermed fremme eggstokkkreftutvikling. I denne studien bruker vi en matematisk modell for å utforske vanskelighetene med denne epigenetisk kontroll av MIR-193a som kan vise seg å være viktig som det spår en veksling oppførsel i c-KIT som kan være avgjørende for eggstokkreft kreftutvikling.
Materialer og metoder
Cell kultur
Eggstokkreft cellelinje A2780 ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, California) supplert med 10% FBS, og 50 enheter /ml penicillin /streptomycin. Cellen ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2.
Kloning av MIR-193a uttrykke vektoren
De sekvenser som transkribere MIR-193a pre-miRNA ble forsterket av PCR hjelp spesifikke primere F: 5′-CGCGGATCCAGTTTCTCGGCGCATAACTC-3 «og R: 5′-CCCAAGCTTCGCTATTTCTCCAGCGAAGTG-3», ved hjelp av genomisk DNA fra IOSE celler som uttrykker MIR-193a. PCR-produktene ble ligert inn yT A kloningsvektor (Yeastern Biotech, Taiwan) for sekvense bekreftelse. MIR-193a-yT A ble kuttet med BamHI og Hind III, og satt inn flere kloningssetet p
Silencer
4,1-CMV puro siRNA uttrykk vektor, som ble predigested med BamHI og Hindi
.
utvinning av RNA og kvantitativ RT-PCR
RNA ekstraksjon ble utført ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll. For å fjerne potensielle forurensende DNA fra det komplementære DNA, ble 1 pg av total RNA behandlet med DNase I (Amplifikasjon Grade, Invitrogen) forut for revers transkripsjon. RNA ble deretter reversere-transkribert ved hjelp av tilfeldige primere (for c-KIT eller E2F6 uttrykk) eller TaqMan revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ sanntids RT-PCR ble deretter utført ved anvendelse av ABI StepOne real-time PCR-system (Applied Biosystems). Primere er tilgjengelig på forespørsel. Relativ uttrykk for MIR-193a, c-KIT og E2F6 ble beregnet ved hjelp av komparative Ct metoden.
Resultater
MIR-193a retter seg mot c-KIT og E2F6
For å undersøke forholdet mellom MIR-193a og c-KIT /E2F6 i eggstokkreft (fig. 1A), vi over-uttrykt MIR-193a i A2780 eggstokkreft celler som har lave nivåer av MIR-193a uttrykk. Ekspresjon av MIR-193a resulterte i en betydelig nedregulering av c-KIT mRNA og E2F6 mRNA, noe som antyder at c-KIT mRNA og mRNA E2F6 er mål for MIR-193a i eggstokkreft celler (Fig. 1B).
(A) Skjematisk fremstilling av c-KIT og E2F6 mRNA viser spådd MIR-193a bindingssetet på sin 3’UTR. De detaljerte bindende sekvenser (MREs) av disse områdene er også vist sammen med miRNA sekvenssammenstillinger. (B) qPCR analyse av MIR-193a, c-KIT og E2F6 i A2780 eggstokkreft celler. Overekspresjon av MIR-193a i A2780 celler fører til nedregulering av c-KIT og E2F6 mRNA.
Modell ligninger
Interaksjoner mellom komponentene i MIR-193a-E2F6- c-KIT reguleringsmodulen er vist i fig. 2A. Tett kobling av nettverkskomponenter og potensielle ikke-lineær kinetikk kan gi opphav til komplekse systemdynamikk, som kan forstås ved hjelp av en matematisk modell. I vår kinetiske modellen (Fig. 2B) er det seks komponenter, som representerer: MIR-193a (
R
m), E2F6 mRNA (
R
e), c-KIT mRNA (
R
c), komplekset av MIR-193a med E2F6 mRNA (
R
em), kompleks av MIR-193a med c-KIT mRNA (
R
mc), og E2F6 protein (
P
). De kjemiske masse action ligninger for de respektive konsentrasjonen av disse molekylene eller komplekser,
R
m,
R
e
R
c,
R
em,
R
mc, og
P
, er oppgitt som følger: (1) (2) (3) ( 4) (5) (6)
(A) Aktivering av østrogenreseptor (ER) signalisering kan øke øke transkripsjon av E2F6 som senere kan øke ekspresjonen av c-KIT gjennom MIR-193a mediert CERNA mekanisme . På den annen side, i tillegg til transcriptional repressor, kan E2F6 føre til epigenetisk stanse av den mir-193a-promoteren resulterer i opp-regulering av c-KIT. Beskrivelsen for hvert nummer i veien er oppført i S1 tabell. (B) Den biokjemiske samhandling for denne foreslåtte MIR-193a regulatoriske nettverk. Modell variabler navn for molekyl arter er også gitt.
Her er foreningen frekvensen av MIR-193a-E2F6 mRNA
k
1 og foreningen frekvensen av MIR-193a c-KIT mRNA er
k
2; dissosiasjon frekvensen av komplekser MIR-193a-E2F6 mRNA er
k
m1 og MIR-193a-c-KIT mRNA er
k
m2; oversettelsen frekvensen av E2F6 protein er
k
3; transkripsjon frekvensen av MIR-193a er
k
4, av E2F6 mRNA er
k
5 og c-KIT mRNA er
k
6; nedbrytningshastigheten av MIR-193a er
δ
m, fra E2F6 mRNA er
δ
e, av c-KIT mRNA er
δ
c, av MIR-193a-E2F6 mRNA er
δ
em, og av MIR-193a-c-KIT mRNA er
δ
mc og nedbrytningshastigheten av E2F6 protein er
δ
p; og styrken på MIR-193a transkripsjon hemming av E2F6 protein betegnes som
K
4.
Det første leddet på høyre side av Eq. (1) svarer til pilen 9 i fig. 2A uttrykker MIR-193a transkripsjon inhibering av, primært, E2F6 protein, men også ved polycomb komplekse proteiner aktivitet. Verdien av parameteren
K
4 er således ment å ta hensyn til både den direkte transkripsjon undertrykkelse av E2F6 og for den langsiktige genet Slå utført av og avhengig av nivåene av EZH2 og DNMT3b. (Konsentrasjonen av E2F6 er en variabel av den dynamiske modellen mens nivåer av essensielle polycomb proteiner, som ikke er direkte tilstede i modell likninger, er ikke emner til regulering av modulen og deres nivåer antas konstant i det minste på modulen ekvilibreringstid målestokk .) den andre (henholdsvis tredje) uttrykket på høyre side av ligning. (1) er frekvensen av MIR-193a utgivelse fra komplekset med E2F6 mRNA (henholdsvis kompleks med c-KIT mRNA). Interaksjoner svarende til pilene 6 og 7 i fig. 2A, som uttrykker hybride mRNA kompleksdannelse, er gitt av henholdsvis den fjerde og den femte ledd på høyre side av ligning. (1). Det siste leddet i Eq. (1) er en første orden MIR-193a degradering sikt.
Satsen for konstituerende E2F6 gentranskripsjon (pil 1 i fig. 2A) er
k
5 (Eq. (2)). Denne prisen avhenger av nivået av hormonstimulering, og som vår modell beskriver forenklet regulering i eggstokkene celler, vil vi direkte knytte
k
5 med nivået av østrogen. Det andre leddet i ligning. (2) representerer frigjøring av E2F6 mRNA fra komplekset med MIR-193a, mens den tredje periode er frekvensen av den motsatte bindingsreaksjonen. Det siste leddet i Eq. (2) er en degradering av E2F6 mRNA. Vilkårene på høyre side av Eq. (3) er analoge. Det første leddet i ligning. (4) er satsen for binding av E2F6 mRNA og MIR-193a. Det andre leddet i ligning. (4) står for den motsatte reaksjon, og det tredje ledd representerer nedbrytning av
R
em. Vilkårene på høyre side av Eq. (5) er analoge. Den siste ligningen står for E2F6 oversettelse (pil 8 i fig. 2A) og degradering.
steady state
steady state gi langsiktig oppførsel av systemet. De steady state av systemet (1) – (6) kan oppnås ved å sette likhetstegn mellom de høyre side av ligningene til null. La
S
= (
R
m,
R
e
R
c,
R
em,
R
mc,
P
), være steady state of system (1) – (6). Steady state
S
tilfredsstiller følgende ligninger (7) (8) (9) (10) (11) (12) hvor
og (13)
Vi registrerer at en gang
R
m bestemmes av Eq. (12), deretter de andre komponentene i den stabile tilstanden
S
kan bestemmes av ligningene. (7) – (11). Derav forutsetning for eksistensen av steady state
S
er at
k
4 ligger i
h product: [0, ∞), utvalget av funksjonen
h
. Vi er interessert i terskel eller bytte systemets egenskaper (1) – (6), særlig i svitsjing av ekspresjon av c-KIT mRNA. Dermed forholdene på parametrene for eksistensen av flere steady state er relevant. Her gir vi et kriterium for eksistensen av tre steady state av modellen som følger: (14) (15) hvor er den maksimale verdien av på intervallet [0, ∞), og er gitt ved
beviset for at kriteriet (14) -. (15) er gitt i S1 Text
Steady State deli Diagram i (
k
5,
R
c) plan
i lys av ligningene. (7) – (8), den steady state av
R
e og
R
c økning eller reduksjon i samme retning. Denne modellen prediksjon er konsistent med Cerna hypotesen [28], [29] som uttrykk for E2F6 positivt korrelerer med at av c-KIT.
Som nevnt før,
k
5 er et eksperimentelt styrbar parameter assosiert med tilsetning av hormoner (for eksempel østrogen), og
K
4 er et mål på inhibering effektiviteten av, primært, E2F6 protein mot MIR-193a. Som vi skal se i diskusjonen nedenfor, samspillet mellom
k
5 og
K
4 kan generere en over-uttrykk for c-KIT mRNA. Derfor ville det være interessant å se avhengigheten av steady state på parameteren
k
5 for forskjellige verdier av
K
4 – dette er vist i figur. 3. Dette diagram er referert til som en «steady-state» bifurkasjon diagrammer, og
k
5 blir referert til som en bifurkasjon parameter. For å generere eksperimentelle kurver tilsvarende de som er vist på fig. 3, kan man designe et eksperiment der celler dyrkes på ulike konsentrasjoner av østrogen, og deretter måle de langsiktige mRNA nivåer.
Avhengigheten av steady state av variabel
R
c (RNA nivå av c-KIT) på parameteren
k
5 (transkripsjon sats på E2F6) for forskjellen verdier av parameteren
K
4 (hemming effektivitet av E2F6). Verdien av parameterne er listet opp i S2 tekst.
Med parametere som tilfredsstiller Eq. (14) – (15), spår den modellen som det er et utvalg av
k
5 som systemet innrømmer tre coexisting steady state. For eksempel, for
K
4 = 0,0001 (dvs. en lavere hemming effektivitet, Fig. 3, grønn linje) og
k
5 er mellom 0,0556 og 0,1585, modellen gir tre steady state (hvorav den høye
R
c og den lave
R
c stater er stabil, se kurven forbundet med
K
4 = 0,0001 i fig. 3). Betydningen av det høyre kne i et steady-state bifurkasjon diagram som ligger i det følgende faktum: som styreparameter
k
5 økes fra den lave verdi opp gjennom den kritiske verdi
k
5
R forbundet med den høyre kne, det tilsvarende steady state nivå på
R
c vil øke og, på grunn av ustabilitet (henholdsvis stabilitet) av steady state på den midtre gren (henholdsvis den øvre gren) i steady-state bifurkasjon diagram, vil systemet hopper til den stabile tilstanden på den øvre gren til den kritiske verdi
k
5
R , og deretter holde seg på den øvre gren (se fig. 3). Det er en kraftig forskjell i c-KIT mRNA nivåer mellom steady state av
R
c på nedre og øvre filialer i steady-state deli diagram, som tilsier kreft fenotype fremmende over- uttrykk for c-KIT mRNA for
k
5
k
5
R. På den annen side, hvis en er innledningsvis ved stabil tilstand på den øvre gren som er forbundet med den i forhold til ekspresjon av c-KIT mRNA, kan man redusere
k
5 verdi for å redusere den stadige statlig nivå av
R
c. Dessuten, hvis man fortsetter å redusere
k
5 verdi under den kritiske verdi
k
5
Lassociated med venstre kne, da det tilsvarende steady state nivå av
R
c vil avta, og på grunn av ustabilitet (henholdsvis stabilitet) av steady state på midten gren (henholdsvis den nedre gren) i steady-state bifurcation diagram, systemet vil stige til steady state på nedre gren på den kritiske verdien
k
5
L (se fig. 3). Dette vil gjenopprette normal c-KIT mRNA nivå.
For å oppsummere, spår modellen at det finnes en terskelverdi
k
5
R (henholdsvis
k
5
L) i transkripsjonshastigheten
k
5 for cellene å slå på (henholdsvis slå av) uttrykk for OCIC markør c-KIT. Derfor er det viktig å justere transkripsjonshastigheten
k
5 å påvirke uttrykket av OCIC markør c-KIT.
Betydningen av Parameter
K
4
Selv redusere verdien av
k
5 (forbundet med lav østrogen nivå) kan redusere uttrykk for OCIC markør c-KIT, antyder noen kliniske bevis for at anti -estrogen terapi er bare delvis effektiv i behandling av eggstokkreft [30], [31]. Modellen antyder at dette kan være på grunn av hemming av MIR-193a uttrykk ved E2F6 protein som gjenspeiles i verdien av parameteren
K
4 i første leddet på høyre side av Eq . (1). Dette begrepet er motivert av at ekspresjonen av MIR-193a er avhengig av den transkripsjonelle undertrykkende aktivitet av E2F6 protein (assosiert med nivået av EZH2 og DNMTs). Spesielt tilstrekkelig sterk hemming (tilstrekkelig stor
K
4) ville føre til en mer langsiktig stanse av uttrykket av MIR-193a ved DNA-metylering (se Eq. (1)), og dermed vil innebære at over-uttrykk for c-KIT mRNA; mens for ekstreme tilfellet
K
4 = 0, systemet (1) – (6) kan bare støtte på de fleste en steady state (se S1 tekst), som innebærer ikke-eksistensen av høyre og venstre kne i steady state diagram og tap av bistabile bryter.
La
k
5
b betegne basal transkripsjon hastighetskonstanten av E2F6 mRNA. I det følgende, avhengig av samspillet mellom
k
5
b og
K
4, vil vi beskrive to scenarier der den andre ville tilsvare til den kliniske observasjon at anti-østrogenterapi er bare delvis effektive i behandling av eggstokkreft [30], [31].
i celler med lav virkningsgrad inhibering av E2F6 (dvs. en lavere
K
4), som parameter
k
5 er økt fra
k
5
b til
k
5
2 (rød heltrukken linje i fig. 4A), steady state of
R
c vil først flytte fra
L
0 til
L
1 via den nedre gren, og på grunn av ustabilitet i steady state i midten gren, bytte fra
L
1 til
U
1 i den øvre gren, og til slutt bevege seg langs øvre gren til
U
2. På den annen side, som parameteren
k
5 er redusert fra
k
5
2 til
k
5
b (blå heltrukket linje i fig. 4A), steady state of
R
c vil først flytte fra
U
2 til
U
0 via den øvre gren, og på grunn av ustabilitet i steady state i midten gren, deretter bytte fra
U
0 til
T
0 i nedre gren, og til slutt flytte tilbake til
L
0. Derav for lav hemming effektiviteten av E2F6 (dvs. lav
K
4) og liten basal konstant (dvs. liten
k
5
b), tillegg av østrogen kan slå på over-uttrykk for c-KIT mRNA, mens tilbaketrekking av østrogen kan slå av over-uttrykk for c-KIT mRNA og gjør cellene gjenopprette normal c-KIT mRNA nivå.
avhengigheten av steady state av variabel
R
c (RNA nivå av c-KIT) på parameteren
k
5 (transkripsjon sats på E2F6) for ulike verdier av
K
4: (A)
K
4 = 0,1 (dvs. lav hemming effektiviteten av E2F6), (B)
K
4 = 1 (dvs. høy hemming effektiviteten av E2F6). Den røde og blå pilen linjen viser brå skift i steady state of
R
c med på ulike
k
5
verdier som angitt nedenfor. Verdien av parameterne er listet opp i S2 tekst.
I celler med høy hemming effektiviteten E2F6 (dvs. en høyere
K
4), som parameter
k
5 er økt fra
k
5
b til
k
5
2 (rød heltrukken linje i fig. 4B), steady state of
R
c vil først flytte fra
L
0 til
L
1 via den nedre gren, og, på grunn av ustabilitet i steady state i midten gren, bytte fra
L
1 til
U
1 i den øvre gren, og til slutt bevege seg langs øvre gren til
U
2. På den annen side, som parameteren
k
5 er redusert fra
k
5
2 til
k
5
b (blå heltrukket linje i fig. 4B), steady state of
R
c vil først flytte fra
U
2 til
U
0 via den øvre gren, og på grunn av det faktum at
k
5
b er basal transkripsjon hastighetskonstant på E2F6 mRNA og
k
5
b er større enn
k
5 komponent i venstre kne punkt, har så å stoppe på
U
0 som er den tilstand assosiert med over-ekspresjon av c-KIT mRNA. Derav for høy hemming effektiviteten av E2F6 (dvs. en høyere
K
4) og store basal konstant (dvs. stor
k
5
b), tilbaketrekking av østrogen kan ikke svekke den ekspresjonen av c-KIT mRNA. Vi gjør en viktig observasjon: for tilstrekkelig stor
K
4,
k
5 verdi knyttet til det venstre kneet er svært nær null. Derav for tilstrekkelig stor
K
4, ville det passe scenario diskutert i dette avsnittet. Dette tyder på at for tilstrekkelig stort
K
4, tilbaketrekking av østrogen kan ikke slå av over-uttrykk for c-KIT mRNA, som er konsistent med de nevnte klinisk observasjon.
Validering av modellen i TCGA eggstokkreft datasett
i lys av ovennevnte modell, vi tenkte at i eggstokkreft pasienter med lav EZH2 (dvs. lav
K
4), økning av E2F6 mRNA (som resultat av en økning av transkripsjon sats på E2F6,
k
5) kan indusere ekspresjon av c-KIT mRNA (
R
c), gjennom MIR -193a-mediert Cerna mekanisme. Imidlertid kan en slik sammenheng ikke finnes hos pasienter med høy EZH2 (dvs. høy inhibisjonskonstant av E2F6 til MIR-193a,
K
4) som MIR-193 er epigenetiske forstummet. For å gi en uavhengig støtte for denne hypotesen, analyserte vi uttrykket microarray data i TCGA eggstokkreft datasett [32]. Interessant, eggstokk-kreft pasienter med lavt nivå EZH2 viser en positiv korrelasjon mellom ekspresjonen av E2F6 og c-KIT (Fig. 5A). Analyse av et annet sett med mikroarray data i kreft i eggstokkene (GDS2785) også viste en lignende fenomen (S1 fig.). Imidlertid er et slikt forhold ikke observert i pasienter med høy EZH2 (fig. 5B og S1 fig.) Eller i korrelasjonen mellom E2F6 og en ikke-MIR-193a target (S2 fig.). Til sammen er dette fenomenet i tråd med vår prediksjon (Fig. 3) at mRNA av E2F6 og c-KIT demonstrerer en Cerna forhold ved lav
K
4.
Expression microarray data fra 568 kreftpasienter eggstokk blir sortert i henhold til ekspresjonsnivået av EZH2. Den spredningsdiagram viser sammenhengen mellom uttrykksnivået E2F6 og c-KIT i eggstokkreft pasienter med (A) lav EZH2 (nederst 12,5%) og (B) høy EZH2 (øverst 12,5%). R og P-verdien av Pearson korrelasjon er vist. Interessant, som spådd av vår modell, pasienter med lav EZH2 viser en positiv korrelasjon på E2F6 og c-KIT (A, R = 0,322, P 0,005). En slik sammenheng er ikke observert hos pasienter med høyt EZH2 (B, R = 0,2148 P . 0,05). Imidlertid kan pasienter med høy EZH2 bli videre delt opp i 2 undergrupper basert på medianverdien av c-KIT (høy, rød farge, lave, blå farge). Ingen av disse undergruppene viser en positiv sammenheng mellom E2F6 og c-KIT.
Diskusjoner
Vår matematisk modell postulerer eksistensen av en bimodal epigenetisk kontroll av MIR-193a i eggstokkene kreftutvikling. I celler med lav effektivitet inhibering av E2F6, er det en sammenheng mellom ~linear transkripsjon av E2F6 og c-KIT mRNA, noe som antyder en CERNA forhold mellom disse 2 genene. I denne hypotesen CERNA [28], [29], de 3’UTRs av flere mRNA inneholder MIR-bindende element (er) (MRE) og derfor konkurrere for binding med mir. Teoretisk kan en MIR bli epigenetiske kontrollert av både arrangøren hypermethylation og dens Cerna i en bimodal måte.
Det er også bemerkelsesverdig å påpeke at dette Cerna forholdet er en reversibel hendelse, slik at tilbaketrekking av østrogen som resulterer i lavere ekspresjon av E2F6, kan redusere ekspresjonen av c-KIT (fig. 6, øvre panel). Et slikt fenomen kan observeres i normale eggstokk-epitelceller eller eggstokkreft celler hvori E2F6 inhibering effektiviteten er lav. Faktisk komponenter i transkripsjons repressorer som EZH2 som er nødvendig for transkripsjonen undertrykkelse av E2F6 er funnet å være lav i normale eggstokk-celler og et under-sett av eggstokkreft [33], [34]. Viktigere, er dette også konsistent med kliniske bevis at uttrykket av E2F6 og c-KIT er korrelert i eggstokkreft pasienter med lav uttrykk for EZH2 men ikke i tilfeller av høy EZH2 uttrykk.
Under forutsetning av lav EZH2 og DNMT3b uttrykket (øvre panel, som angitt av lys blå og rød farge), E2F6 bare fører til en minimal undertrykkelse av MIR-193a (dvs. lav
K
4) og forholdet mellom E2F6 og c-KIT viser en Cerna forhold. Som et resultat vil mengden av c-kit i eggstokkreft celler avhenger av mengden av østrogen (denne informasjonen er mediert av nivået av E2F6). Tvert imot, under forutsetning av høyt ekspresjonsnivå av EZH2 og DNMT3b (lavere panel, som indikert ved mørk blå og rød farge), utøver E2F6 en høy hemming effektivitet (det vil si høy
K
4 ). Svakt tilveksten av E2F6 resultater i epigenetisk stanse av MIR-193a og senere en over-uttrykk for c-KIT. Uten MIR-193a, kan cellene bli «låst» i en høy c-KIT tilstand som resulterer i eggstokkkreftutvikling.
I celler med høy effektivitet inhibering av E2F6, vår modell forutsier en sterkt ikke- -lineære forholdet mellom uttrykk for E2F6 og c-KIT. Under forutsetning av lavt uttrykk nivå av E2F6, det følger en Cerna forholdet mellom E2F6 og c-KIT. Imidlertid, ved høy ekspresjon av E2F6 sammen med høy ekspresjon av transcriptional repressor slik som EZH2, kan E2F6 føre til epigenetisk stanse av ekspresjonen av MIR-193a gjennom trimetylert H3K27 og DNA-metylering (fig. 6, nedre panel).
