Abstract
deteksjon og behandling av kreft har avansert betydelig de siste tiårene, med viktige forbedringer i vår forståelse av grunnleggende molekylære og genetiske basis av sykdommen. Til tross for disse fremskritt, har narkotika-screening metoder forble i hovedsak uendret siden innføringen av
in vitro
human cellelinje skjermen i 1990. Selv om de eksisterende metoder gir informasjon om de samlede virkningene av forbindelsene på celle levedyktighet, de er begrenset av bulk målinger, store utvalgsstørrelser, og mangel muligheten til å måle spredning kinetikk ved den enkelte cellenivå. For virkelig å forstå arten av kreftcelle proliferasjon og for å utvikle tilpassede hjelpestoff-terapier, er det et behov for nye metoder som gir kvantitativ informasjon for å overvåke effekten av legemidler på cellevekst, så vel som morfologiske og fenotypiske forandringer på celle-nivået. Her viser vi at en kvantitativ fase avbildningsfunksjonalitet kjent som romlig lys forstyrrelser mikroskopi (SLIM) løser disse behovene og gir flere fordeler i forhold til eksisterende spredningsanalyser. Vi demonstrerer disse funksjonene gjennom målinger på effektene av hormonet østradiol og anti-østrogenet ICI182,780 (Faslodex) på veksten av MCF-7 brystkreftceller. Sammen med gir informasjon om endringer i den generelle veksten, gir SLIM ytterligere biologisk relevant informasjon. For eksempel finner vi at eksponering for østradiol resultater i raskt voksende celler med lavere tørrmasse enn kontrollgruppen befolkningen. Deretter blokkerer østrogenreseptoren med ICI resulterer i langsommere voksende celler, med lavere tørre masser enn kontrollen. Denne evnen til å måle endringer i vekstkinetikk som respons på miljøforhold gir ny innsikt på vekst reguleringsmekanismer. Våre resultater etablere mulighetene til SLIM som en avansert narkotika screening teknologi som gir informasjon om endringer i spredningskinetikk på cellenivå med større følsomhet enn eksisterende metode
Citation. Mir M, Bergamaschi A, Katzenellenbogen BS, Popescu G (2014) Sterkt Sensitiv Kvantitativ Imaging for overvåking av enkelt kreft celle vekst Kinetics og Drug Response. PLoS ONE 9 (2): e89000. doi: 10,1371 /journal.pone.0089000
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 9. oktober 2013, Godkjent: 13 januar 2014; Publisert: 18 februar 2014
Copyright: © 2014 Mir et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (NSF) Stipend: Science and Technology Center på Emergent atferd av Integrated Cellular Systems CBET 0.939.511 (til GP), NSF KARRIERE 08-46660 (til GP), CBET-1040461 MR (til GP), bryst Cancer Research Foundation (til BSK), National Institutes of Health (NIH) P50 AT006268 (til BSK), og et postdoktorstipend fra det amerikanske forsvarsdepartementet, W81XWH-09-1-0398 (til AB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: G. Popescu har økonomiske interesser i Phi Optics, Inc., et selskap som utvikler kvantitative fase mikroskoper, som imidlertid ikke sponser denne forskningen. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Cell vekst og masse homeostase har blitt beskrevet som grunnleggende for biologi, men de er ikke tilstrekkelig forstått [1]. Denne ulempe kan føres tilbake til manglende fremgangsmåter er i stand til å kvantifisere enkeltcellemassen med den nødvendige følsomhet. Som et resultat av dette nylig, betydelige fremskritt har blitt gjort mot å utvikle ny teknologi for å studere cellevekst. Disse metodene kan deles inn i
mikromekanisk product: [2] – [4], sette resonans frekvens skift av mikrostrukturer i celle oppdrift masse, og
optisk product: [5] – [8], konvertering kvantitativ fase bilder til kartene tørre massetetthet. Optiske metoder er ideell for å studere vekst de heftenkeltceller samt cellegrupper. Denne funksjonen åpner for nye muligheter i kreftcellebiologi, hvor følsomme målinger av celleproliferasjon kan føre til bedre forståelse av sykdommen, samt kvantitativ overvåking av legemidlets effekt. Her viser vi at
kvantitativ fase imaging (QPI)
gir en svært sensitiv metode for å studere kreftcellevekst og for testing av narkotika. Vi bruker brystkreftcellelinjer som en modell for å bevise prinsippet om vår metode.
Brystkreft utgjør 30% av alle krefttilfeller og for 14% av alle kreftdødsfall hos kvinner [9]. En betydelig reduksjon (7%) i forekomsten har blitt observert siden 2002 som kan knyttes direkte til en bedre forståelse av sammenhengen mellom østrogen og veksten av brystkreft [10] – [16]. Denne kunnskapen har ført til utviklingen av en klasse av agenter som direkte modulerer østrogenreseptor (ER) og nå er hjørnesteinen i behandling og forebygging i ER positive pasienter (70% av alle tilfeller) [17]. Med den erkjennelse at det er mulig å utøve kontroll over kreftvekst via anti-hormoner og kjemoterapeutiske midler kom behovet for storskala testing av muligens nyttige forbindelser. I 1974 ble over 40.000 forbindelser blir testet årlig bruker murine modeller [18], [19]. I 1990 etablerte NCI den primære skjermen av 59 humane cellelinjer, som fortsatt er i bruk i dag, [20], [21]. Denne nye primære skjermen kreves metoder for å vurdere vekst
in vitro
. Flere metabolske analyser ble utviklet for å måle cellevekst og levedyktighet-som til dags dato, har holdt seg stort sett uendret [20], [22] -. [26]
En tilnærming mye brukt er basert på reduksjon av en fargeløs tetrazoliumsalt til å gi en farget formozan proporsjonal med antallet levedyktige celler. Selv om slike analyser er nyttige for å måle den generelle cytotoksiske effekt av en forbindelse, stort antall celler (10
3-10
5) [27] har til å bli brukt for å unngå feilaktige konklusjoner fra effekter som for eksempel variable doblingstider [20]. Videre, siden mange legemidler har virkning på cellesyklus-stans som ikke resulterer i metabolske forandringer, i noen tilfeller en falsk avlesning kan foretas [28]. Non-tetrazodium baserte analyser er også utviklet. Disse assays bruke fargestoffer som binder seg elektrostatisk til basiske aminosyrer [25] og det målte signal er således lineær med celletallet. Til tross for de praktiske problemer involvert, ble en slik reagent kjent som sulforhodamin B (SRB) til slutt vedtatt for rutinemessige screenings. Begge analysetyper gir indirekte målinger av vekst: de tetrazodium baserte analyser måle metabolsk aktivitet mens SRB analysen i hovedsak måler total proteinkonsentrasjon. Begge metodene er avhengige av å bruke et stort antall av celler, bare gi bulk målinger på hele samlingen av celler, og er ikke i stand til å måle tidsavhengige reaksjoner på legemidler på cellenivå. Vanligvis blir veksten analysedata supplert med fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) eksperimenter for å tilveiebringe ytterligere statistisk informasjon, og studere genekspresjon og cellesyklusprogresjon. Selv om svært informativ, analyser FACS krever celler til å bli fjernet fra sine vanlige dyrkningsforhold, cellegruppene som skal skilles, forårsaker endringer i fenotype og morfologi.
Derfor er det stadig mer klart at for å virkelig forstå innholdet i kreftcelle proliferasjon og for å utvikle tilpassede hjelpestoff-terapier, er det et behov for nye metoder som gir kvantitativ informasjon til å overvåke legemiddeleffekter på cellevekst og de medfølgende morfologiske og fenotypiske endringer på enkeltcelle-nivå. Den ideelle medikament skjermen skal være følsom nok til raskt å bedømme responsen hos et lite antall celler til en rekke potensielle behandlinger for å direkte evaluere responsen hos en pasient eller effekten av et bestemt medikament. Her viser vi at QPI [29] løser dette teknologiske gapet. Spatial lys forstyrrelser mikroskopi (SLIM) [30] er en QPI tilnærming som har femtogram nivå sensitivitet for endringer i tørr masse og kan samtidig gi denne informasjonen både på enkelt celle og populasjonsnivå [31]. SLIM kan kombineres med fluorescens mikroskopi for å måle cellesyklusavhengig vekst [31]. I dette arbeidet, bruker vi den østrogenreseptor (ER) -positivt MCF-7 brystkreftcellelinjen [32], [33] som et modellsystem for å demonstrere at SLIM kan anvendes som en høyt følsom analyse medikament proliferasjon.
MCF-7 cellelinjen har vært en mye brukt modell for å studere hormonell påvirkning på brystkreft vekst, spesielt i respons til østrogen som spiller en nøkkelrolle i å fremme vekst og progresjon av kreftceller. Vi målte veksten av MCF-7 cellegrupper i standard cellekulturmedium (Veh) og under påvirkning av østradiol (E2) er den dominerende form av østrogen i løpet av reproduktive år, og ICI, 182, 780 – også kjent som Faslodex- [ ,,,0],34], en komplett antagonist av ER brukes til å behandle metastatisk brystkreft hos postmenopausale kvinner. Resultatene som er vist her fastslå at, i tillegg til å være en verdifull proliferasjonsanalyse, kvantitativ fase avbildning gir også biologisk relevant informasjon til enkelt celle og celle områdepopulasjonsnivå som ikke er tilgjengelig gjennom andre metoder. Slike målinger, i kombinasjon med eksisterende molekylære analyser har potensial til å forbedre drug design og karakterisering og for å bygge bro over forbindelsen mellom vår molekylær forståelse av kreft og behandlingseffekter på cellevekst og fenotypiske egenskaper, så som cellestørrelse /masse.
Resultater
MCF-7 celler ble sådd i en to godt lysbilde kammer og målinger ble utført i tre cellekulturbetingelser (se
Materialer og metoder
for mer informasjon om cellekultur og behandling) . Først typisk cellevekstmedier som styre bærer (Veh), andre cellevekstmedier inneholdende 10 nM østradiol (E2), og endelig cellevekstmedier med antiøstrogen 1 pM ICI182,780 10 nM E2 (E2 + ICI). For E2 + ICI behandling ble cellene dyrket under E2-betingelser i 10 timer før ICI ble tilsatt. Den 10-timers punkt ble valgt til å administrere medikament siden dette er det tidligste punktet hvor ble det observert en signifikant forskjell mellom vekstratene av Veh og E2-behandlede populasjoner (Fig. S1). En 1,55 x 1,16 mm
2 område av hver brønn ble skannet hvert 30. minutt ved hjelp av en kommersiell fase kontrast mikroskop utstyrt med en SLIM tilleggsmodul. For hvert forsøk, inneholdt en vel en ubehandlet kontrollpopulasjon (Veh) og den andre brønnen inneholdt E2 eller E2 + ICI-behandlede populasjonen. To målinger ble utført på en slik måte for hver tilstand. Alle data vil bli gjort fritt tilgjengelige ved forespørsel.
En skjematisk av instrumentet og representative SLIM bilder fra én brønn er vist i fig. 1 henholdsvis A og B. SLIM opprett subcellulære oppløsning (Fig. 1B) over et stort område ved å skanne hvert kammer i et mosaikkmønster (for mer informasjon om målingen viser til
Materialer og metoder
). Fra de store mosaikk bilder, kantene av individuelle klynger (sammensatt av 2-3-celler ved t = 0 timer) ble spores ved hvert tidspunkt, og overflatearealet og total tørrvekt ble målt (se film S1 for et tidsforløp av synsfelt for alle grupper). På denne måte kan vi analysere både den generelle vekst trender i hver gruppe og heterogeniteten ved klyngen nivå innenfor hver populasjon. Det bør bemerkes at denne type måling er i dag umulig å utføre med eksisterende spredning analysen.
(A) Skjematisk av eksperimentelle oppsettet. En helautomatisk kommersiell fasekontrastmikroskop utstyrt med fasen topp inkubering kontroll og x, y, z-skanning evner ble anvendt for å skanne et område mm 1,5 mm x 1.2 i hver brønn av en to-brønns gli hvert 30. minutt. Komponentene i den stiplede linjen omfatter SLIM tilleggsmodulen: Fourier Lens 1 (FL1) prosjekter eleven planet av fasekontrastmikroskop på en Liquid Crystal Phase Modulator (LCPM), som gir kontroll over faseforsinkelse mellom spredt og un-spredt lys; Fourier Lens 2 prosjekter fase-modulert bilde på en CCD. Alle komponenter i instrumentet ble synkronisert ved hjelp av CPU. (B) Representative bilder av en skannet synsfelt i ett av kamrene ved 0 timer og 94 timer, i området i den stiplede gule linje er forstørret og vist ved hvert tidspunkt (gul skala bar er 50 mikron). (C) Gjennomsnittlig normalisert flateareal for klynger i hver gruppe i de merkede tidsperioder. (D) Gjennomsnittlig normalisert masse for klynger i hver gruppe i de merkede tidsperioder. (C-D) Firkant markører indikerer middelverdien, er senter median, toppen av boksen er 25
th persentil linje, er bunnen 75
th persentil linje, indikerer værhår 5
th og 95
th persentiler , betydning ble testet ved hjelp av en un-paret t-test, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001. (E) WST-1 spredning analyse måling på 72 timer.
tidsmessige endringer i Mass og området
Først etablerer vi mulighetene til SLIM som en spredning analysen ved å måle effekten av østradiol på de relative endringene i vekst, som er kvalitativt lik den informasjonen som gis av konvensjonelle analyser. Mengdene av interesse her er de relative mengder av vekst i størrelse og masse, og ikke de absolutte verdier. For å utføre denne analysen, er massen og overflatearealet av hver klynge normalisert i forhold til sin opprinnelige størrelse, M (t) /M (t = 0) og området (t) /område (t = 0), respektivt. Den normaliserte område og masse for alle analyserte klynger (minst 5 pr gruppe) ble separert i 15 timer i binger som vist på fig. 1C og 1D. Det er ingen vesentlig forskjell i den normaliserte område på hvert tidspunkt. I motsetning til forskjellene i den normaliserte masse kan påvises i hele måleperioden (fig. 1 C-D). Dette understreker viktigheten av å måle masse i stedet for bare arealet av en klynge. Videre tar ICI behandlingseffekten hurtig når E2 gruppe oppviser større relativ vekst i massen i løpet av 30 timer. En forskjell mellom E2 + ICI og kontrollgruppe kan påvises ved 60 timer. Det skal bemerkes at mens omløps proliferasjonsanalyser avhengige av å bruke et stort antall celler, var slank målinger utført på det enkelte grupperingsnivå.
Sammenligning med kolorimetrisk analyse
For sammenligning målinger fra en WST-1-analysen tatt etter 72 timers behandling er vist i fig. 1E. Det kan sees at det er en god kvalitativ avtale mellom de WST-1-data, som indirekte indikerer formeringshastigheten, og de normaliserte målingene området etter 75 timer. Imidlertid er den normaliserte massen høyere i kontroll enn E2 + ICI gruppe etter 60 timer. Disse forskjellene er sannsynligvis fordi WST-1-analysen bare måler reduksjonen av en tetrazolium fargestoff utenfor cellen. Selv om graden av denne reduksjon er relatert til det metabolske aktivitet av cellene og reflekterer antall levedyktige celler i populasjonen, er det ikke en direkte måling av cellulær masse eller størrelse. Videre er slike analyser begrenset til å tilveiebringe ett nummer for en hovedpopulasjon, og gir ingen praktisk måte å studere heterogenitet i befolkningen. For bedre å illustrere den målte variasjoner i dataene den normaliserte masse og område for de enkelte grupper er vist i fig. 2.
(A) Normalisert masse vs. tid for alle klynger som ble analysert. (B) Normalisert område vs tid for alle klynger. (A-B) Prikkete linjer viser individuelle klase data og heltrukne linjer viser gjennomsnittsdata. Stiplede linjene indikerer hvor forskjellen mellom gruppene blir betydelig.
tidsmessige endringer i Mass vekstrate
I tillegg til å gi en kvantitativ forståelse av hvordan ulike behandlinger påvirke relative endringer i størrelse og masse , SLIM kan også måle endringer i veksten av små cellegrupper som en funksjon av tid eller størrelse. Måling av vekst med høy følsomhet er mer informativ enn bare å måle relative endringer i massen som det gir en forståelse av når behandlinger begynner å tre i kraft og hvor lenge effekten vedvarer. Tørre massetetthetskart av typiske grupper fra hver gruppe over tid er vist i fig. 3A (se Movie S2 for). Fig. 3B viser vekst av klynger i hver gruppe vs. tid. kan påvises en signifikant forskjell i vekst mellom alle de tre grupper så tidlig som 15 timer (5 timer etter ICI behandling ble administrert), som er 15 timer tidligere enn detekterbar endring i både området og masse. Videre, selv om den normaliserte masse er større for E2 + ICI gruppe enn kontrollgruppen opp til 60 timer, veksten av kontrolloverstiger E2 + ICI grupper etter 45 timer. Det kan også sees at selv om klynger i E2 gruppen oppnå mye større relative masser og områder enn kontroll, er det ingen signifikant forskjell i vekstratene mellom de to gruppene etter 90 timer.
(A) Kles tetthet kart masse av representative klynger fra hver gruppe av MCF-7 brystkreft celler på hver 22 timer. Fargene indikerer tørrmassetettheten på hver piksel som vises på fargelinjen. Den gule Målestokk er 50 mikrometer. Merk at i E2 + ICI gruppe, ble ICI tilsatt til hver prøve på 10 timer. (B) Cluster vekst i hver gruppe i vist tidsrom. (C) Cluster vekst i hver gruppe som en funksjon av normalisert masse. Solid linjer er vist som en guide for øyet å avgjøre hvor veksten er i endring som en funksjon av masse vekst. (B-C) Firkant markører indikerer middelverdien, er senter median, toppen av boksen er 25
th persentil linje, er bunnen 75
th persentil linje, indikerer værhår 5
th og 95
th persentiler , betydning ble testet ved hjelp av en un-paret t-test, o: p 0,05, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p. 0,001
Av plotting av veksthastigheten som en funksjon av den normaliserte masse (fig. 3C) veksten trend (eksponensiell eller lineær) av gruppene kan bestemmes. Det kan ses at den gjennomsnittlige veksthastigheten av klynger i E2 og VEH-grupper fortsetter å øke inntil en 4-gangers økning i massen er oppnådd, hvoretter veksten er enten stabil eller minsker. Denne trenden innebærer at ca. to masse doblinger begge grupper oppvise eksponentiell vekst, hvoretter veksten er lineær. I motsetning til dette oppviser den E2 + ICI gruppe eksponentiell vekst (lineær trend i fig. 3C) til en 2-ganger økning i massen er oppnådd, hvoretter veksten er lineær (konstant kurve i fig. 3C). Det er viktig å merke seg her at en dobling i massen ikke nødvendigvis tilsvarer en fullstendig cellesyklus som både østrogen og ICI er kjent for å resultere i forandringer i hvordan en celle utvikler seg gjennom cellesyklusen, dvs. den doblingstiden og størrelse og divisjon både kan påvirkes.
Effekter av Østradiol på Cell size og Dobling Tid
for å finne ut hvordan endringer på celle-nivå bidra til målbare endringer i relativ størrelse, masse og vekstrater målte vi doblings tid og prosent endring i gjennomsnittlig cellestørrelse for individuelle celler som utgjør de klynger (Fig. 4). Doblingstiden regnes bare som, der
t
f
er siste tidspunkt,
t
0
er den første tidspunktet, og
N
celle (t)
er celletall ved
t
. Doblingstidene for E2 gruppen ble funnet å være vesentlig lavere enn både Veh og E2 + ICI-grupper (Fig. 4A). Disse data viser at estradiol induserer celler til å dele på nesten det dobbelte av frekvensen av kontrollgruppen, og at behandling med ICI nesten fullstendig reverserer denne effekten. På linje med tidligere rapporterte studier, finner vi at østrogener akselerere cellene gjennom cellesyklusen, noe som resulterer i en økning i celleproliferasjon. Å merke seg er at effekten av ICI i å øke celle-doblingstiden innebærer ikke at cellesyklus føres tilbake til normale forhold, men mer sannsynlig er et resultat av cellene tilbringe en større mengde av tid i en spesifikk fase av cellesyklusen.
(A) fordoblingstid i hver gruppe, er den midlere doblingstiden reduseres med 12 timer i E2-gruppen sammenlignet med VEH og E2 + ICI grupper, noe som indikerer at tilsetting av ICI returnerer doblingstiden for å kontrollere nivåer. (B) Prosent forandring i den midlere cellemassen i løpet av måleperioden for hver gruppe. En betydelig reduksjon i cellemassen er observert i både E2 og E2 + ICI-grupper sammenlignet med kontrollen. (C) Målt doblingstiden sammenlignet med endringen i midlere cellemasse for hver klynge som ble målt, kan disse to parametre anvendes for å separere de tre gruppene helt og kan tjene som en vekst signatur.
endring i gjennomsnittlig cellemasse over tid ble beregnet ved å dividere den totale masse av hver klynge med antall celler i klyngen. Figur 4B viser den prosentvise endring i gjennomsnittlig cellemassen mellom begynnelses- og slutt-tidspunkt for hver klynge. Resultatene indikerer en betydelig reduksjon i den midlere cellemassen over tid, til E2 og E2 + ICI-celler sammenlignet med kontrollen. Denne reduksjonen i cellemassen og fordoblingstiden viser at sammenlignet med kontrollen, østrogen resulterer i mindre, raskere delende celler, og at tilsetting av ICI resulterer i lengre doblingstider sammen med mindre celler. De små celler i E2 + ICI-grupper innebære at selv om doblingstiden har gått tilbake til kontrollnivåer, er ICI påvirker cellenes metabolske aktivitet og evne til å vokse på vanlig måte. Som vist på figur 4C, er doblingstiden og endring i gjennomsnittlig cellemassen tilveiebringe en pålitelig «vekst signatur» for hver gruppe, og tyder på at nivået av ekspresjon av østrogenreseptoren eller nærvær av en ER modulator kan bestemmes ganske enkelt ved å undersøke disse to parametre. Siden dagens analyser ikke gir en direkte måling av cellevekst, disse er de første målingene, utført kontinuerlig med en befolkning, som belyser hvordan østrogen påvirker MCF-7 vekstkinetikk ved den enkelte cellenivå.
Diskusjoner
resultatene som er vist her konstatere at slanke mål av tørrmassetettheten kan brukes som svært sensitive proliferasjonsanalyser. De viktigste fordeler i forhold til eksisterende metoder er at SLIM kan detektere endringer i vekstkinetikk på færre antall celler, på kortere tid, og kan brukes til å undersøke forskjeller innenfor en befolkning i stedet for bare å gi et nummer for hoveddelen vekst av en kultur. Som en sammenligning var WST-1-analysen arbeider med celletall på 10
3-10
5 intervallet [27], mens Slim er følsom for endringer i spredning av til og med en enkelt celle. Videre tilveie SLIM evnen til å analysere veksthastigheten til enkeltceller og klynger som en funksjon av deres masse, som gir innsikt i mekanismen for vekstregulering (f.eks hvorvidt en cellestørrelse eller alder sjekkpunkt blir utnyttet) [35]. Denne informasjonen er utilgjengelig for alle eksisterende spredning analysen. Dette systemet kan lett brukes til å måle vekstkinetikk og fenotypiske effekter for en hvilken som helst celletype og behandling.
Våre resultater viser også at måle vekst på cellenivå, og klynge ikke bare tilveiebringer fordeler i form av økt sensitivitet og redusert utvalgsstørrelser, men også gir ytterligere informasjon som ikke er tilgjengelig med eksisterende metoder. Spesielt viser vi kinetikken og modalitet av virkningen av E2 i MCF-7. Faktisk MCF-7 under påvirkning av E2, del raskere og oppnå lavere massene, noe som resulterer i et økt antall celler som i gjennomsnitt er mindre. På grunn av den reduserte dobling gang, fortsatt gir dette en generell økning i den totale masse for E2 når sammenlignet med kontrollgruppen. For celler dyrket i E2 og deretter behandlet med ICI doblingstidene returneres til de som finnes i kontrollen, men reduksjonen i cellestørrelsen var enda større enn i kontrollgruppen.
Virkningene av E2 og anti-østrogener på cellesyklusprogresjon, er blitt undersøkt i detalj, [11], [15], [36], [37]. Både raske og forbigående effekter har blitt observert på grunn av funksjonell aktivitet både i kjernen (genomiske effekter) og extranuclear rommet (ikke-genomiske effekter) [38]. Den raske effekt på vekst er klart observerbare i våre data som forskjellene i veksthastigheten mellom E2 og Veh eksponerte celler er observerbar etter 10 timer (fig. S1) og kan tilbakeføres til tidlig aktivering av stoffskifterelaterte gener [39 ]. Ved tilsetting av ICI, en ren ER antagonist, forskjeller i veksten mellom E2 og E2 + ICI grupper begynner å vises over tid (Fig. 3B). De forbigående effekter av E2 + ICI er også manifestert i hvordan veksten renteendringer som en funksjon av økning i celle størrelse (Fig. 3C), et klart brudd i veksttakten kan observeres når ICI-klynger omtrent dobbel størrelse.
Østrogener er kjent for å aktivere transduksjon kaskader som regulerer mange gener-både positivt og negativt som spiller nøkkelroller i celleproliferasjon og metabolisme [10] – [15], [39]. Det har også blitt vist at østrogener forårsake ikke-sykling-celler (G
0-fase) for å gå inn i cellesyklus, og for raskt å komme seg gjennom G
1 til S-fasen [11], [15], [37 ]. Denne raske progresjon gjennom cellesyklusen står for både den reduserte doblingstiden og reduksjon i gjennomsnittlig cellemassen ble observert i E2 gruppe (Fig. 4). På den annen side har ICI blitt vist å blokkere MCF-7-celler i G0-G
en fase [15], [28], [37]. Denne inhiberende virkning på progresjonen gjennom G1 er manifestert i den økte doblingstiden for E2 + ICI gruppe når sammenlignet med E2-gruppen. ICI også påvirker transkripsjonen av flere gener som er ansvarlige for vekstregulering i alle faser av cellesyklusen. Den nedregulering av gener som er kjent å være ansvarlig for proliferasjon i kombinasjon med den økte tiden i G1 er sannsynligvis ansvarlig for reduksjonen i cellestørrelsen observert i E2 + ICI gruppe [15].
i tilfellet med østrogenreseptoren, har celleproliferasjon også styres gjennom aktivering og modulering av reguleringssignalkaskader av vekstfaktorer; å måle vekst på cellenivå har potensial til å bygge bro mellom den molekylære forståelsen av kreftvekst og selve tumorvekst. Det er således av stor interesse å kombinere disse vekstmålinger med fluorescens-markører for cellesyklus fase (slik det ble gjort tidligere for U2OS celler [31]), eller til andre proteiner som er kjent for å spille viktige roller i regulering av proliferasjon. Måling av forandringer i vekstkinetikk som en funksjon av cellesyklusen eller mer spesifikt gen aktive, vil gi rom for bedre forståelse av den spesielle virkning av en forbindelse /medikament på cellesyklusprogresjon.
I sum, har vi demonstrert en ny svært følsom spredning analyse for narkotika screening-programmer. Selv om vi har fokusert på en bestemt modell celle system her, gjelder det eksperimentelle oppsettet uten endring til andre celletyper og behandlinger. I tillegg til å måle vekstkinetikk, vår metode også samtidig gir informasjon om cellulær morfologi og motilitet [40], og kan også lett kombineres med andre mikros modaliteter. En gjenstand for fremtidige studier vil være å forstå og karakterisere morfologiske forskjeller som oppstår som følge av moduler ER (se Movie S1 og S2). De biologiske innsikt SLIM målinger i kombinasjon med andre molekylære analyser vil utvilsomt øke vår forståelse av kreft celle vekst generelt, og har potensial til å føre til forbedringer i drug design, karakterisering og terapeutiske effekten.
Materialer og metoder
Cell Culture
Kommersielt tilgjengelige MCF-7 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og ble dyrket i MEM (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) supplert med 5% kalveserum (HyClone, Logan, UT), 100 ug /ml penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA), og 25 pg /ml gentamicin (Invitrogen). Cellene ble deretter sådd ut i fenol rød-fritt MEM inneholdende 5% karbon-dekstran behandlet kalveserum inkuberes i 4 dager. To kammers objektglass (Lab-Tek) med glassbunn dekk ble anvendt for å tillate side-ved-side-avbildning av kontroll og behandlede prøver. Mediet ble forandret på dag 2 og 4 før behandling med kontroll kjøretøy eller ligand-behandlinger (Østradiol (E2, 10 nM) og ICI 182 780 (ICI Fulvestrant, 1 uM)). For de kolorimetriske målinger, ble en WST1-analyse (Roche, Basel, Sveits) som brukes, og absorbansen ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en BioRad 680 Microplate Reader.
under avbildning cellene ble holdt ved 37 ° C og i en 5% CO2-atmosfære med en inkubator og oppvarmet trinn innsats. Hver brønn ble skannet hvert 30. minutt i en 4 x 4-flis mønster med et Zeiss EC Plan-Neofluar 10 x /0.3 PH 1 objektiv som gir totalt synsfelt på 1,55 x 1,16 mm
2. En z-stabel med 12 skiver (48 mikrometer) ble spilt inn i hver posisjon. Eksponeringstiden var 15 ms for hvert bilde ved full lampeeffekt (3200 K, eller 10,7 V). For hvert eksperiment ble en brønn ubehandlet for å tjene som en kontrollpopulasjon og den andre brønnen ble behandlet med enten E2 eller E2 + ICI tilstand. Hver tilstand ble målt sammen med sin kontroll to ganger.
Imaging
Imaging ble utført ved hjelp av romlig lys forstyrrelser mikroskopi (SLIM) [30], [41]. SLIM er et hvitt lys optisk interferometri modalitet utformet som en tilleggsmodul til en kommersiell fase kontrast mikroskop. I korte trekk, SLIM opererer ved å projisere bak midt av en fasekontrast mål på en flytende krystallfase modulator (LCPM). Den LCPM er kalibrert til nøyaktig forskyve fasen av lyset spredt av prøven i forhold til den ikke-spredte lyset. Intensitet kart er bokført til fase skift på null, π /2, π, og 3π /2.
SLIM oppsettet brukt i denne studien er basert på en Zeiss Axio Observer Z1 (Zeiss katalog # 431007901000) motorisert invertert forskning bildebehandling mikroskop. Mikroskopet basen er utstyrt med en motordrevet fokusering stasjon (minimum trinn bredde 10 nm). Målene som brukes for denne studien er en Zeiss EC Plan-Neofluar 10 × /0,3 PH en M27. Det mellomliggende bilde etter objektive og rør objektivet er rettet mot venstre port av mikroskop hvor SLIM modulen er vedlagt.
