Abstract
Eggstokkreft er fortsatt vanskelig å behandle hovedsakelig på grunn av presentasjonen av sykdommen på et avansert stadium. Betinget reproduserende adenovirus (Crads) er lovende kreftlegemidler som selektivt drepe kreftceller. Denne studien evaluerte effekten av en roman crad (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) inneholder CXCR4 promoter for selektiv virusreplikasjon i kreftceller sammen med TIMP2 som en terapeutisk transgenet, rettet matrise metallproteasene (MMP) i en murine orthotopic modell av disseminert eggstokkreft. En ortotopisk modell for ovariekreft ble etablert i atymiske nakne mus ved intraperitoneal injeksjon av human ovarian cancer cellelinje, SKOV3-Luc, som uttrykker luciferase. Ved bekreftelse av peritoneal spredning av cellene ved ikke-invasiv bildediagnostikk, ble musene tilfeldig delt inn i fire behandlingsgrupper: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Alle mus ble fotografert ukentlig å overvåke tumorvekst og ble avlivet ved å nå noen av de forhåndsdefinerte endepunktene, inkludert høy tumorbelastning og betydelig vekttap sammen med kliniske symptomer på smerte og ubehag. Survival analyse ble utført ved hjelp av Log-rank test. Median overlevelse for PBS kullet var 33 dager; for Ad-ΔE1-TIMP2, 39 dager; for Ad5 /3-CXCR4, 52,5 dager; og for Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, 63 dager. Den TIMP2-bevæpnet crad forsinket tumorvekst og betydelig økt overlevelse sammenlignet med ubevæpnet crad. Denne terapeutiske effekten ble bekreftet å være mediert gjennom hemming av MMP9. Resultater av
in vivo
studien støtter translasjonsforskning potensialet i Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 for behandling av menneskelige pasienter med avansert eggstokkreft
Citation. Yang SW, Chanda D, Cody JJ , Rivera AA, Waehler R, Siegal GP, et al. (2011) betinget replikerende Adenovirus uttrykker TIMP2 Øker Overlevelse i en musemodell for disseminert eggstokkreft. PLoS ONE 6 (10): e25131. doi: 10,1371 /journal.pone.0025131
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: May 27, 2011; Godkjent: 25 august 2011; Publisert: 12 oktober 2011
Copyright: © 2011 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir R01CA108585, T32 CA075930, og University of Alabama i Birmingham, Avdeling for patologi forskningsfond er verdsatt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende årsak til gynekologisk kreft dødsfall i USA [1]. Den betydelige morbiditet og mortalitet hos pasienter med denne gruppen av svulster er knyttet til det faktum at pasienter presentere bare med uspesifikke symptomer på et tidlig stadium, noe som utelukker sin diagnose [2]. Størstedelen av pasientene diagnostisert ved trinn III eller utover, hvor kreften er utbredt i hele bukhulen, noe som fører til en dårlig prognose. Nåværende behandlingsformer har begrensninger, som fem-års overlevelse har holdt seg uendret på 50% i løpet av de siste fire tiårene [3]. Således er ny og effektiv målrettet terapi for disseminert sykdom presserende behov.
betinget replikerende adenovirus (Crads) er en lovende ny klasse av terapeutiske midler, da disse virusene har potensial til å selektivt og selv stadig replikere og lyse cancer celler for å utrydde hele svulsten [4]. Kliniske studier med Crads har så langt vist sikkerheten onkolytiske adenoviruses. Men beskjeden terapeutisk effekt med Crads antyder ytterligere optimalisering for effektiv klinisk oversettelse kreves [5]. En strategi for å forsterke antitumor effekt anvender crad som en plattform for levering av et terapeutisk transgen, i tillegg til deres onkolytisk potensiell [6]. For dette formål, hypotese vi at effektiviteten av en replikerende adenovirus kan forbedres for behandling av eggstokkreft ved arming med et gen som virker på vertsmikromiljøet, som samspillet mellom kreftceller og dens mikromiljøet som har vært kjent for å modulere tumorprogresjon [7], [8], [9].
matriks-metalloproteinaser (MMP) er en sammensatt familie av proteaser som er i stand til å nedbryte flere komponenter i den ekstracellulære matriks (ECM) [10]. De er en av de ideelle mål for ovarial cancer terapi, som deres feilregulering har vist seg å bidra til å fremme tumorvekst, angiogenese, invasjon og metastase [11]. Spesielt er MMP-2 og MMP-9 konsistent oppregulert i eggstokk-kreft og er assosiert med dårlig prognose [12], [13]. Viktig regulator av MMP’er er deres endogene inhibitorer, det vevsinhibitor av metallproteinaser (TIMP), en familie av små utskilte proteiner som virker ved å binde seg direkte til aktive MMP’er og dermed begrenser deres virkning. Hittil har fire pattedyr TIMPs blitt identifisert [14]. Blant de TIMP familiemedlemmer, er TIMP-2 enestående i sin evne til å hemme tumorvekst og angiogenese gjennom reaksjonsveier også uavhengig av MMP-inhibering [15], [16], [17]. Vi antok at produksjonen av TIMP2 fra virusinfiserte celler som skal bindes og hemmer overskytende ekstracellulære MMP’er og derved hemme tumorprogresjon gjennom både MMP-avhengige og MMP-uavhengige retninger.
Vi har tidligere utviklet og fast terapeutiske potensiale en TIMP2-armet crad, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, for eggstokkreft terapi [18]. Transductional selektivitet av crad ble oppnådd ved genetisk erstatte Ad5 knott med AD3 knott, som omgår Coxsackie og adenovirus reseptor (CAR) og omdirigerer binding til AD3 reseptoren, som er mer rikelig uttrykt på eggstokkreft celler [19], [ ,,,0],20]. CXCR4-promoteren ble anvendt for å mediere tumor selektiv replikasjon av vektoren, som det oppviser overlegen aktivitet i begge etablerte humane ovarie kreftceller og pasient-avledet primære tumor vev [18]. Videre er aktiviteten av CXCR4-promoteren er minimal i leveren, hovedorgan kjent for å modulere systemisk levert adenovirale vektorer [21]. Den TIMP2 genet ble tatt med for å hemme tumorprogresjon. Vi har nylig validert
in vitro
at Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 produsert funksjonell TIMP2, som vist ved inhibering av den enzymatiske nedbrytning av gelatin av aktive MMP [18]. For TIMP2 væpnet crad å være effektiv, var det viktig at uttrykket av TIMP2 ikke svekke virusreplikasjon eller dets onkolytiske potens. Vi har nylig vist at både virusreplikasjon og onkolytiske potens ikke ble svekket i både SKOV3.ip1 og OV-4 menneskelige eggstokkreft celler ved å bevæpne med TIMP2 [18]. Videre har vi vist at det var selektiviteten i replikering med CXCR4-promoteren, som indikert ved et høyere nivå for replikasjon i de eggstokkreft celler, når sammenlignet med kontroll fibroblaster. Mot oversette dette viruset inn i klinikken, vi videre anvendes bruken av en
ex vivo
modellsystem for å undersøke ytterligere virusreplikasjon i tumorer vev oppnådd fra pasienter med bekreftet stadium III og IV eggstokkreft. Resultatene av denne studien indikerte en gjennomgående høyt nivå replikering med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 [18]. Sammen er disse dataene var veldig oppmuntrende, noe som tyder på at Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 kan være effektive for behandling av avansert eggstokkreft. I denne studien, forsøkte vi å finne ut den terapeutiske effekten av Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 i en murine orthotopic modell av disseminert eggstokkreft. Tumorprogresjon ble overvåket gjennom ikke-invasiv
in vivo
imaging. Resultatene av denne studien viser en signifikant økning i overlevelse etter behandling med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, tyder dens potensial for klinisk oversettelse.
Materialer og metoder
Cells
Den ildflue luciferase-uttrykke eggstokkene adenokarsinom cellelinje SKOV3-Luc ble vennlig levert av Dr. R. Negrin (Stanford Medical School, Stanford, California). Den A549 karsinomcellelinje human lunge ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Begge cellelinjer ble dyrket i en 01:01 blanding av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) og Hams F-12 medium, supplert med 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) , L-glutamin (2 mM), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml), ved 37 ° C i en fuktig atmosfære og ved 5% CO
2. Media og kosttilskudd ble kjøpt fra Media (Herndon, Virginia).
produksjon og konstruksjon av virus
Ad-ΔE1-TIMP2 er en E1-, E3-slettet replikering-mangel Ad5 vektor som uttrykker TIMP2 under kontroll av CMV-promoteren [22]. Ad5 /3-CXCR4, er en crad med CXCR4-promoteren innføres i E1A stilling sammen med en tropisme-modifiserte fiberen, inneholdende Ad5 fiber aksel og hale som har hatt knott domenet erstattet med den for AD3 virus [23]. Den Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 ble bygget ved hjelp av en full-lengde human TIMP2 cDNA som beskrevet tidligere [18]. Replikering-mangel adenovirus, Ad-ΔE1-TIMP2 ble dyrket i 293 celler. De Crads, Ad5 /3-CXCR4 og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 ble amplifisert i A549-cellelinjen. Alle virus ble renset ved to runder av cesium klorid tetthet sentrifugering. Titrene av virale partikler og smittsomme enheter ble bestemt som tidligere beskrevet [24].
ortotopisk eggstokkreft modell og vektor behandling
BALB /c nu /nu-mus av 6 til 8 uker etter alder ble hentet fra National Cancer Institute-Fredrik Animal Production Area (Frederick, MD) og satt i karantene i 2 uker. Musene ble holdt under patogen-frie forhold i henhold til American Association for Akkreditering av Forsøksdyromsorgs retningslinjer. Animal protokoller ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Alabama i Birmingham.
In vivo
optisk avbildning ble utført på små dyr bildebehandling kjernefasilitet i Comprehensive Cancer Center ved University of Alabama i Birmingham. På dag 0, ble musene injisert intraperitonealt (i.p.) med 5 x 10
6 SKOV3-Luc celler i 250 ul PBS og avbildes for bioluminescens for å oppnå basislinjeavlesninger. Åtte dager senere ble musene reimaged for å sikre implantering av tumorene og ble deretter tilfeldig delt inn i fire grupper: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, med n = 10 per gruppe. Hver mus ble injisert intraperitonealt med 2 × 10
8 IU av den gitte virus i 200 mL PBS, eller PBS alene. Alle mus ble fotografert for bioluminescens ukentlig etter tumorcelle-injeksjon for å overvåke tumorvekst. Alle mus ble fulgt daglig for å spille inn overlevelse. Overlevelsestid reflekterer den tid som er nødvendig for dyrene å nå begge disse parametere. Først den kliniske tegn på smerte eller ubehag. For det andre, en hvilken som helst av de forhåndsbestemte målbare endepunkter inkluderer: vekttap på over 15%, eller vektøkning på over 20% av kroppsvekten. Dyret Vekten ble målt på dag 0 og målt på nytt etter 3 dager fram til slutten av forsøket. Overlevelsesdata ble plottet på en Kaplan-Meier kurve, og forskjellige grupper ble sammenlignet med Log-rank (Mantel-Cox) test (GraphPad Prism programvare v.5).
Bioluminesens bildebehandling for å oppdage
i vivo
luciferaseekspresjon
Mus ble fotografert på dag 0 for bioluminescent signal etter injeksjon av SKOV3-luc celler for å få en baseline lesing av tumorbyrde. Imaging ble utført igjen før første behandling på dag 8 og deretter ukentlig inntil mus ble ofret. I korte trekk ble 150 mg /kg D-luciferin injisert i.p., og musene ble bedøvet med isofluran gassanestesi og plassert i et lystett kammer. Det fotografiske (grå-skala) referansebilde ble oppnådd ved 10 min etter D-luciferin injeksjon, og bioluminescent bildet ble samlet inn umiddelbart etterpå. Bilder ble oppnådd med et CCD avkjølt til -120 ° C, ved hjelp av IVIS -100 Imaging System (Xenogen Corp, Alameda, California), med synsfeltet satt til en 25 cm høyde. Bioluminescent bildene brukes eksponeringer som strekker seg fra 1 til 10 s, en f /stopp, 4 binning, og åpent filter. Datainnsamling programvare ble kalibrert slik at ingen piksler ble mettet under bildesamling. Bioluminescent og gråtonebilder ble kledde hjelp LivingImage programvare. Leve Bilde programvare (Xenogen, Alameda, CA) ble også brukt til å få en pseudocolor bilde representerer bioluminesens intensitet (blå, minst intens, og rødt, mest intense). Regioner av interesse ble trukket rundt i.p. tumorer, og de totale tellinger (fotoner) ble summert for hele tumorområdet. De totale tellinger ble normalisert til bilde oppkjøpet tid (fotoner /sek). Statistiske forskjeller i tumorstørrelse mellom gruppene ble vurdert av Student t-test. En
p
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Data ble presentert som middelverdier ± SD.
Immunohistochemistry
Mus ble ofret på høy tumorbelastning ved forhåndsbestemte parametere som er definert som ovenfor. Ved tidspunktet for avlivelse, ble obduksjon på 3 mus fra hver behandlingsgruppe, hvorfra tumorer og viktige organer ble høstet og fiksert inn i parafinblokker. Kort fortalt ble parafinsnitt av xenopodet menneskelige ovarietumorer deparaffinized i xylen og hydrert gjennom gradert alkohol. Antigen gjenfinning ble utført i citrat-buffer (pH 6,0), i henhold til damp i 20 min. Snittene ble avkjølt til romtemperatur, og endogen peroksidase ble fjernet ved anvendelse av 0,3% H
2o
2 i metanol i 30 min og blokkert med 5% BSA i 30 minutter. Vevssnitt ble deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Snittene ble vasket i fosfatbufret saltløsning inneholdende 0,05% Tween-20 (PBST) og på nytt inkubert ved værelsestemperatur med biotin-konjugert geite-anti-geit /anti-muse-sekundært antistoff i 2 timer. Etter vasking ble snittene inkubert med streptavidin-konjugert pepperrotperoksidase i 1 time ved romtemperatur. Etter nok en vask med PBST, ble immundeteksjon utføres ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin-H
2o
2 (Vector Labs) og kontra med hematoksylin.
Resultater
Tilkobling med TIMP2 forsinket tumorvekst
in vivo
for å evaluere den terapeutiske effekten av Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 i en klinisk relevant
in vivo
modell, vi genererte orthotopically spres eggstokkreft kreft ved injisering av hunn nakne mus med humane SKOV3-Luc-celler intraperitonealt (IP). En luciferase-uttrykkende stabil cellelinje ble anvendt til å overvåke den terapeutiske effekt av behandling av ikke-invasiv avbildning
in vivo
. Åtte dager etter tumorcelle administrasjon, mus ble re-fotografert for å sikre implantasjon av svulstene og delt inn i fire behandlingsgrupper, med 10 mus per gruppe. Kontrollgruppene mottok PBS, et replikasjonsmanglende vektor som uttrykker TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), eller en CXCR4 promoter-regulert crad med et chimerisk Ad5 /3-fiber (Ad5 /3-CXCR4). Den terapeutiske gruppen mottok en TIMP2-armet CXCR4 promotor basert crad med et chimerisk Ad5 /3-fiber (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) (Fig. 1). Alle mus ble fotografert etter i.p. injeksjoner av D-luciferin på en ukentlig basis. Et panel av representative bilder er vist i fig. 2A, mens kvantitativ bestemmelse av bioluminescerende signaler som er vist på fig. 2B. Lave bioluminescent signaler om SKOV3-Luc celler ble oppdaget så tidlig som 8 dager etter tumorcelle injeksjon, og var relativt konsekvent mellom de fire gruppene. Ved dag 22, var det betydelig tumorvekst i PBS-gruppen og Ad-ΔE1-TIMP2 behandlede gruppen. I motsetning til dette, grupper behandlet med Crads hadde signifikant hemming i tumorvekst. Gruppen behandlet med målet virus, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, viste tumor regresjon på dag 22. Ved dag 30, var det betydelig tumorbyrde i PBS-gruppen, som mus viste en betydelig økning i abdominal omkrets og begynte å viser tegn til sykdomsbyrde. I motsetning til dette, ble tumorvekst signifikant hemmet i alle gruppene som ble behandlet med virus (p 0,001). Ved dag 36, hadde de fleste av mus i PBS gruppen døde av en tung tumorbyrde. På dette tidspunktet, mus behandlet med Ad-ΔE1-TIMP2, begynte å vise stor tumorbyrde. Men begge gruppene behandlet med Crads hadde betydelig mindre bioluminescent signal (p 0,001), noe som indikerer en lavere hastighet for tumorutvikling. Videre tumorbelastning i kohort av mus behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, den armerte crad, var signifikant mindre sammenlignet med tumorbelastning i mus ble behandlet med både Ad5 /3-CXCR4 og den uarmerte crad (p 0,01 fig. 2B). En lignende trend i overlevelse etter behandling med forskjellige vektorer ble observert i to pilotstudier med mindre dyr tall per gruppe (data ikke vist). Sammen er disse data tyder på at både virusreplikasjon og armerings med TIMP2 bidratt til å forsinke utbruddet av tumorvekst.
Adwt300, er den villtype Ad5 virus. Ad-ΔE1-TIMP2 er en E1-, E3-slettede replikasjonsdefekt Ad5 vektor som uttrykker TIMP2 under kontroll av CMV-promoteren i E1. Ad5 /3-CXCR4 er en uarmerte crad med en CXCR4 promoter i E1 for å begrense viral replikasjon til kreftcellene i forbindelse med et Ad5 /3 modifisert fiber som inneholder akselen og hale av Ad5 fiber og AD3 fiber knott. Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 er en crad med CXCR4 promoter i E1, bevæpnet med TIMP2 i E3B regionen og nevnte F5 /3 modifisert fiber.
Disseminert svulster ble etablert ved å injisere 5 × 10
6 SKOV3-Luc celler ip til kvinnelige atymiske hårløse mus på dag 0. På dag 8, ble musene behandlet med enten en i.p. injeksjon av PBS, eller 2 × 10
8 IE Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, og Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, henholdsvis. Bioluminesens nivåene ble målt ukentlig. (A), ble pseudocolor bilde representerer bioluminescence intensitet på dag 8, 22, 30 og 36. (B), bioluminesens intensitet fra mageregionen kvantifiseres og normalisert, og gjennomsnittlig foton tellinger per sekund for hver gruppe er vist for de gitte dager . Data rapportert som gjennomsnitt ± SD for hver behandlingsgruppe. * P. 0,05
Tilkobling med TIMP2 økt overlevelse
Alle mus ble deretter fulgt for å overleve som vist i fig. 3A. Median overlevelse økte fra 33 dager, for PBS årsklasse, til 39 dager i kohorten injisert med nonreplicating vektor uttrykker TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), denne forskjellen var statistisk signifikant (p 0,03). Kohorten behandlet med ubevæpnet crad (Ad5 /3-CXCR4) hadde median overlevelsestid på 52,5 dager, mens kohort behandlet med TIMP2-væpnede crad (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) hadde en median overlevelsestid på 63 dager ( figur 3B), er denne forskjell også statistisk signifikant (p . 0,002). I sammendrag, armering med TIMP2 synes å være anvendelig for behandling av disseminert eggstokkreft, da den økte overlevelse
in vivo
.
Mus ble overvåket for overlevelse. Overlevelsesdata blir plottet på et Kaplan-Meier-kurve (A). Behandling med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 betydelig forbedret overlevelse sammenlignet med behandling med Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4 eller PBS (p 0,05). (B), median overlevelse i dager for hver behandlingsgruppe.
TIMP2 er uttrykt i svulster væpnede virus
For å finne ut om den økte overlevelsen sett i TIMP2 væpnede crad når sammenlignet med den uarmerte crad var på grunn av modulering av mikromiljøet ved TIMP2, ekspresjon av TIMP2 ble først undersøkt på tumorer skåret ut fra hver behandlingsgruppe ved obduksjon. Som vist i fig. 4, tumorer skåret fra gruppene behandlet med PBS og Ad5 /3-CXCR4 var negative for TIMP2 uttrykk. Resultatet av immunhistokjemi indikerte at i tumorer skåret ut fra kullet behandles med Ad-ΔE1-TIMP2, TIMP2 ekspresjon var minimal og opptrådte begrenset til periferien av tumoren. Dette var ikke uventet, som Ad-ΔE1-TIMP2 er en ikke-replikerende vektor og var ikke ventet å spre innen svulsten effektivt. I motsetning til dette oppviste svulster fra mus behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 forbedret TIMP2 farging gjennom hele tumoren, noe som indikerer at dette onkolytisk viruset var effektiv i å infisere og replikere i hele tumoren.
Ved tidspunktet for avlivelse mus knyttet til tumorbyrde, ble svulster samlet inn fra angitte behandlingsgrupper og undersøkt for ekspresjon av TIMP2 ved immunhistokjemi.
TIMP2-væpnet crad redusert nivå av aktive MMP
TIMP2 er en kjent hemmer av MMP2 og MMP9. Derfor farging for aktiv MMP2 og MMP9 ble utført for å bestemme om nivåene ble berørt. Resultatene av denne analysen indikerte at svulster fra gruppene behandlet med PBS, Ad5 /3-CXCR4, og Ad-ΔE1-TIMP2, alle utstilt høye nivåer av aktive MMP2. I motsetning til dette, svulster fra gruppen behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 hadde svært lave nivåer av MMP2. En identisk mønster ble også påvist i MMP9 uttrykk ved immunhistokjemi. Grupper behandlet med PBS, Ad5 /3-CXCR4, og Ad-ΔE1-TIMP2, alt utstilt immunoreaktivitets for aktiv MMP9. I motsetning til dette, svulster fra gruppen behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 hadde svært lave nivåer av aktiv MMP9 ekspresjon (fig. 5). Disse dataene tyder på at TIMP2 utskilt av den armerte crad var også effektiv i å hemme MMP2 og MMP9 aktiviteter.
Ved avlivningstiden hos mus som følge av tumorbyrden, ble svulster oppsamlet fra angitte behandlingsgrupper og kontrollert for ekspresjon av MMP-9 ved immunhistokjemi.
TIMP2-væpnet crad hemmet angiogenese
til slutt, svulster ble undersøkt for ekspresjon av CD31, en markør for angiogenese. Kohorter behandlet med PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, og Ad5 /3-CXCR4, hadde stor diameter fartøyer med minimal immunoreaktivitets lining endothelial vegger i forhold til gruppene som ble behandlet med Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 (Fig. 6).
Tumor konsernene i mageområdet ble samlet inn under ofring av dyr fra angitte behandlingsgrupper og fast. Fem mikrometer deler av parafinblokker tumorvev ble farget med menneskelig CD31 antistoff for å oppdage blod blodkar.
Diskusjoner
Betydningen av samspillet mellom kreftceller og mikromiljøet i modulerende svulst progresjon har lenge vært anerkjent [25]. I patogenesen av kreft i eggstokkene, er MMP-2 og MMP-9 konsistent oppregulert [12]. Videre økte nivåer av disse MMP korrelerte negativt med overlevelse som de er forbundet med avansert stadium, høy grad av ascites og positive (metastatisk) lymfeknute [13]. Disse dataene tyder på at MMP er gyldige terapeutiske mål for behandling av eggstokkreft. En viktig regulator av MMP er deres endogene inhibitorer, TIMPs. Fire pattedyr TIMPs er blitt identifisert hittil, blant dem TIMP2 har blitt grundig undersøkt på grunn av sin evne til å hemme tumorvekst og angiogenese ved en rekke forskjellige mekanismer som er uavhengige av direkte MMP-hemning [15], [16], [17]. TIMP2 kan hemme endotelcelleproliferasjon gjennom induksjon av protein-tyrosin-fosfatase-aktivitet [17]. TIMP2 hemmer også tumorvekst og angiogenese ved å øke aktiviteten av mitogen-aktivert protein kinase fosfatase 1 [15]. I et forsøk på å utvikle en vellykket crad rettet mot behandling av disseminert eggstokkreft, foreslo vi at utruste den med TIMP2 ville øke den terapeutiske virkningen av det crad ved hemning av tumorprogresjon gjennom både MMP-avhengige og MMP-uavhengige retninger.
i vår siste undersøkelse, vi preget og evaluert effekten av Ad5 /3-CXCR4-TIMP2
in vitro
. Vi har bekreftet at TIMP2 uttrykk ikke svekke viral replikasjon eller onkolytisk potens av viruset. Videre ble selektiv replikering oppnådd med CXCR4-promoteren. Validering av Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 på primærtumorprøver fra fem pasienter med bekreftet stadium III eller IV eggstokkreft, avslørte et konsistent høyt nivå av replikasjon sammenlignet med de andre styre virus. Sammen er disse dataene antydet potensialet av Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 for behandling av fremskreden ovariecancer [18].
I den foreliggende undersøkelse har vi ønsket å bestemme effekten av Ad5 /3-CXCR4- TIMP2
in vivo
. Invasiv bioluminescent avbildning gir et kraftig verktøy som tillater langsgående overvåking av tumorvekst i mus. Videre er det mulig for oss å bruke et modellsystem som er klinisk relevant. I de fleste tilfeller er eggstokkreft diagnostiseres på et avansert stadium, hvor kreften er utbredt i hele bukhulen, og dermed, ved hjelp av en subkutan dyremodell for å evaluere effekten av behandlingen, mens praktisk, ikke reflekterer den naturlige kliniske utviklingen av sykdom. Derfor etablere spres svulster med i.p. injeksjon av SKOV3-Luc celler sammen med bilde gjort oss i stand til å bruke en klinisk gyldig modellsystem som kan mer nøyaktig og effektivt forutsi overføringsverdi av Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Videre har flere studier vist følsomhet og gyldigheten av selvlysende avbildning i i.p. tumormodeller [26], [27], [28].
Behandling med en TIMP2-armet crad signifikant økt overlevelse sammenlignet med den uarmerte crad, men økningen var ikke robust. I den foreliggende undersøkelse ble virotherapy gitt med en enkel injeksjon med en lav dose virus på dag 8 etter tumorimplantering. I motsetning til dette mange
in vivo
eksperimenter som undersøker effekten startes behandling enten før eller på samme dag som tumorinjeksjon. Videre, de virale dosene som ble brukt var i det minste en til to stokker høyere og ble levert via multiple administreringer av viruset [29], [30], [31], [32]. Hovedformålet med å begrense vektoren dose i denne studien var å etablere en trygg terapeutisk indeks. Siden det nakne musemodeller som brukes i prekliniske evaluering av eksperimentelle behandlingsformer på eggstokkreft ikke har et funksjonelt immunsystem, øker vektoren dose til det høyeste nivået mulig å oppnå en terapeutisk effekt kan ikke være hensiktsmessig for ekstrapolering til mennesker som høyeste vektor dose resulterer i aktivering av immunsystemet som forårsaker alvorlige bivirkninger. Imidlertid, ut fra data i denne studien, er det tenkelig at med en høyere dose, eller en multippel doseringsregime, terapeutisk effekt kunne bli ytterligere forbedret. En mulig ulempe med gjentatt administrasjon av viruset er at immunitet kan bli et betydelig problem og hemme terapeutisk effekt. Nylig publikasjon av
Hemminki et al
tyder på at selv i nærvær av sterk immunitet mot Ad5, kunne man omgå denne immunitet ved å bruke en serotype som er mindre utbredt i befolkningen, for eksempel AD3 og dermed oppnå terapeutisk effektivitet uten behov for å øke den virale dosen. Dette prinsippet kan lett brukes til å gjenta administrasjoner av virus, der hvis immunitet utvikler til serotype brukt, så kan man bare endre ryggraden av viruset til en mindre utbredt serotype [33]. I tillegg kan forøkning av viral effekt også oppnås ved en fler modalitet tilnærming ved hjelp av stråling eller kjemoterapi, som adjuvant terapi [34], [35], [36]. Med vår nåværende plattform av viruset målretting gjennom Ad5 /3 kan det tenkes at det potensielt kan infisere og kopiere i menneskelige immunceller, omfanget av disse kan ikke fastslås i denne modellen, som menneske Adenovirus ikke gjenskape i mus vev og atymiske nakne mus mangler T-celler. Men dette potensielle sideeffekt kan reduseres ved å endre tropisme av viral plattformen. Perreau
et al
viste redusert infeksjon av dendrittiske celler med adenovirus serotype 2 (CAV-2) fiber knott [37]. Dermed ved å bytte fiber knott fra Ad5 /3 til Ad-CAV2, kan vi hindre transduksjon av dendrittiske celler. Videre gjør dette for å beholde CXCR4 arrangører som det viser høy aktivitet i tumorceller.
tumorbiologi, natur peritoneal spredning av eggstokkreft, samt paradoksale rollene som MMP og TIMPs i kreft progresjon videre legger kompleksitet til effektiv behandling av sykdommen. Det er godt etablert at økt MMP-2 og MMP-9-ekspresjon i eggstokkreft korrelerer negativt med prognose og overlevelse [12], [13], [38], [39], [40], [41]. Imidlertid er de spesifikke roller av MMP i progresjon av kreft i eggstokkene ikke godt definert. Studier indikerer at MMP-2 er hovedsakelig viktig i tidlig tumorgenesis ved å initiere metastase gjennom å forbedre vedheft av eggstokkreft celler til bukhinnen [42]. Dermed terapi for å blokkere den når metastasering er etablert er ineffektive. Men andre rapporter støtter rollen til MMP-9 i tumorvekst og angiogenese [43]. Rollene som MMP og TIMPS i eggstokkreft er videre vist av immunhistokjemiske studier som ser på uttrykk for TIMP2 i eggstokkreft vev. Mens noen grupper har rapportert lav uttrykk for TIMP2 i grunnskolen ovarietumorer [38], mens andre har sett økt TIMP2 uttrykk i eggstokkreft vev, noe som tyder på at TIMP2 bidrar til tumorprogresjon, blant annet gjennom aktivering av pro-MMP2 og hemming av anti- tumoraktiviteter av MMP’er [39], [41]. Derimot har flere dyrestudier utnytte viral levering av TIMP2 vist sin nytte å undertrykke tumorvekst, migrasjon og metastase i ulike kreft modeller [44], [45], [46], [47], [48]. Samlet indikerer disse studiene at kanskje effekter av TIMP2 på tumorvekst eller undertrykkelse er avhengig av tidspunktet og den spesifikke type av tumor. Snarere enn uspesifikke hemming av MMP, er det kanskje mer nyttig å spesifikt hemme ulike MMP under stadier av tumorprogresjon.
Emerging data fra kliniske, patologiske, og molekylærgenetiske studier foreslår en ny modell for eggstokkreft kreftutvikling, der eggstokkene kreft er klassifisert i to grupper, type i og II [49]. Type I svulster er klinisk lat, som de er langsomt voksende og generelt begrenset til eggstokken ved diagnose. I motsetning til type II svulster er klinisk aggressiv, til stede på et avansert stadium og antas å oppstå
de novo
, som forstadier ikke er identifisert. Den type II svulstene, sto for 70% av eggstokkreft, er preget av mutasjoner i TP53 i 80% av tilfellene. Denne nye data tyder på at p53 kan potensielt være et terapeutisk mål å ruste viruset for eggstokkreft terapi. Crads bevæpnet med p53 har vist
in vitro
å forbedre oncolysis i livmorhalskreft [50], og en rekke andre kreftcellelinjer [51]. En annen potensiell terapeutisk mål er CXCR4, den eneste kjemokinreseptoren funnet å bli uttrykt på kreft i eggstokkene [52].
