Abstract
Den ekstremt dystre prognose av kreft i bukspyttkjertelen (PC) er tilskrevet, i hvert fall delvis, av mangel på tidlig diagnose. Derfor identifisere differensielt uttrykte gener i flere trinn av tumorigenesis av PC er av stor interesse. I denne studien ble en 7,12-dimethylbenzanthraene (DMBA) -indusert PC-modellen etablert i Sprague-Dawley rotter. Den genekspresjon profilen ble screenet ved anvendelse av et oligonukleotid microarray, etterfulgt av sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) og immunhistokjemisk farging validering. Totalt 661 differensielt uttrykte gener ble identifisert i stadier av bukspyttkjertelkreftutvikling. Ifølge GO klassifisering ble disse genene er involvert i flere molekylære stier. Ved hjelp av to-veis hierarkisk klyngeanalyse, normale bukspyttkjertel, akutt og kronisk pankreatitt, Panin, tidlig og avansert kreft i bukspyttkjertelen ble helt diskriminert. Videre 11 oppregulert og 142 downregulated gener (prober) ble funnet ved Mann-Kendall trend Mono test, noe som indikerer homologe gener av rotte og menneske. Den QRT-PCR og immunhistokjemi analyse av CXCR7 og UBe2c, to av de identifiserte gener, bekreftet microarray resultater. I humane PC-cellelinjer, knockdown av CXCR7 resulterte i redusert migrering og invasjon. Samlet våre data identifisert flere lovende markører og terapeutiske mål av PC basert på en omfattende screening og systemisk validering
Citation. Guo JC, Li J Yang YC, Zhou L, Zhang TP, Zhao YP (2013) oligonukleotid Microarray Identifiserer gener uttrykt forskjellig i løpet tumorigenesis av DMBA-indusert kreft i bukspyttkjertelen i rotter. PLoS ONE 8 (12): e82910. doi: 10,1371 /journal.pone.0082910
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: 02.08.2013; Godkjent: 29 oktober 2013; Publisert: 23.12.2013
Copyright: © 2013 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av forskning eget fond for offentlig velferd industrien for helse, translasjonsforskning av tidlig diagnose og omfattende behandling i bukspyttkjertelkreft (nummer 201 202 007). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en menneskelig solid ondartet svulst med svært dårlig prognose [1]. Flere kliniske og patologiske faktorer for PC har blitt identifisert, inkludert T scenen, lymfeknute /fjernmetastaser, karbohydrat antigen (CA) 19-9 nivå og perinevral /intraneural invasjon; Men de faktorene som påvirker prognose for PC gjenstår å avklare [2], [3], [4], [5]. I tillegg molekylære hendelser som er involvert i patogenesen og progresjon av PC, for eksempel Kras mutasjon, har blitt oppdaget som hot spots [1]. Imidlertid mer forskning er nødvendig å identifisere de cellulære faktorer som påvirker prognosen.
En av de store ulempene med tidligere studier i humane prøver og cellelinjer er problemer med å samle inn prøver i alle faser av tumorigenesis. Derfor dyremodeller presentere unike fordeler i dette aspektet. Kjemiske induserer PC omfatter N-nitrosobis (2-oksopropyl) amin, azaserin, og 7,12-dimetylbenzantracen (DMBA) [6], [7], [8], [9], [10]. Disse modellene kan indusere hele spekteret av kreftutvikling, gjennom avansert stadium og metastasering. DMBA har vært mye brukt i etableringen av rotte PC-modeller [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. I våre tidligere studier, har vi funnet at akinærceller kan transdifferentiate til ductal celler i tumorgenese prosessen i DMBA-indusert PC rottemodell [18]. I dag har begrepet og betydningen av acinar å ductal metaplasi (ADM) blitt gradvis akseptert [19]. Tidligere studier har undersøkt ulike funksjoner av disse PC-modeller, inkludert histologiske /histochemical funksjoner [11], [12], [14], høy fett /høy-protein diett som en pådriver for kreftutvikling [13], glukosemetabolismen [15] og endringer i ulike proteiner [16]. En fersk undersøkelse utført proteomikk analyse i PC rottemodellen [17]. Hittil har screening av forskjellig uttrykte gener i denne modellen ikke blitt rapportert.
I denne studien, vårt mål var å screene differensielt uttrykte gener i PC ved hjelp av DMBA-indusert PC rottemodellen.
Materialer og metoder
Dyr
Voksen Sprague-Dawley (SD) rotter ble gitt av Experimental Animal Center, Peking Union Medical College Hospital, Beijing, Kina. Rotter ble plassert under standard betingelser, inkludert et patogen-fritt miljø og fri tilgang til mat og drikkevann. Tjuefire timers urinprøver ble samlet inn med metabolske bur der bare vann, men ikke mat ble gitt. Institutional Animal Care og bruk komité ved Peking Union Medical College Hospital spesielt godkjent denne studien og bruken av rotter. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Etablering av DMBA-indusert PC Model i Rats
DMBA-indusert PC-modellen ble etablert i SD hannrotter i henhold til vår forrige metoden [14]. Totalt 75 rotter ble delt i eksperimentelle, kontroll og sham-grupper. DMBA eller NaCl-krystaller (5 mg) ble anvendt for rotter i de eksperimentelle og kontrollgruppene, henholdsvis, mens ingen middel ble anvendt i sham-gruppen. I eksperimentelle og kontrollgrupper, ble rottene avlivet 7 dager 2 uker 1 måned og 3 måneder etter implantasjon. Fem rotter i humbug gruppe ble avlivet på en måned. Gruppering av alle rottene er vist i tabell 1.
RNA Utvinning og microarray analyse
Total RNA ble ekstrahert fra -80 ° C frosne bukspyttkjertelen vevsprøver tatt ved alle tidspunkter hjelp RNeasy mini kit (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA prøvekonsentrasjon og renhet ble undersøkt og beregnet ved hjelp av måling av optisk densitet ved 260/280 nm ved anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer og agarosegel-elektroforese. Den detaljerte måledata og kvalitetsevaluering er vist i tabell 2. Super II revers transkripsjon kit (Invitrogen, USA), Genechip kit (Affymetrix, USA) og One-Cycle Target Merking og kontroll Reagenser (Affymetrix) ble også brukt i analysene . Hybridisering ble utført ved hjelp av Genechip Rat Expression Set 230 (Affymetrix), i henhold til produsentens instruksjoner. Genuttrykk analysene ble utført ved hjelp av Affymetrix Rat Genome 230 A array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Sekvenser som brukes i utformingen av tabellen ble valgt ut fra GenBank, dbEST og RefSeq. Gene chip 230 A inneholder totalt 15166 probe sett representerer ca 4700 kjente rotte gener og 10460 Umerket uttrykt sekvens koder. Sjonsnummer i GEO er GPL1355.
Kvantitativ Reverse-transkripsjon Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol (Invitrogen). Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av Super II revers transkripsjon kit (Invitrogen, USA). Den TaqTM R-PCR SYBR grønn I sett (Takara, Tokyo, Japan) ble brukt for PCR. Forsterkertrinn var som følger: 95 ° C i 30 s (pre-denaturering), og 40 sykluser med 95 ° C i 5 s og 61 ° C i 31 s. Beta-aktin ble utpekt som den interne kontrollen. Alle eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Grunning er oppført i Tabell 3.
Immunohistochemistry og Farging Evaluering
Antistoffer mot CXCR7 og UBe2c ble kjøpt skjemaet R D og Abnova, henholdsvis, og PowerVisionTM to-trinns farging kit (PV-9000) var fra Beijing Zhongshan Biotech Co., Kina. Kort fortalt deler ble montert, deparaffinized av xylen og rehydrert av etanol. Antigen henting ble utført av mikrobølgeovnen prøver for 3 min. Etter blokking endogen peroksidase, ble objektglass og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff ved en fortynning på 1:200. Etter vasking i fosfatbufret saltvann (PBS), ble slides inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -merket sekundært antistoff i 30 minutter ved romtemperatur. Diaminobenzidin ble anvendt som et kromogen. Til slutt, lysbilder ble kontra med hematoksylin. Brun farge i cytoplasma eller kjernen ble definert som et positivt signal. Forholdet andel av flekker positive fargede celler mer enn 50% ble klassifisert som en sterk positivt signal.
Cell Kultur og knockdown av CXCR7
To menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (PANC-en og SU86.86) var snill gaver fra professor Helmut Freiss, Universitetet i Heidelberg, Tyskland [20], [21]. Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium og DMEM-medium. med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. -Celler utsådd i 6-brønners plater ble transfektert med CXCR7 eller kontroll (rykke) liten interfererende RNA begge ved en konsentrasjon på 40 nM ved bruk av Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Den CXCR7 RNAi ble kjøpt fra Invitrogen og sekvensen er som følger: AGAUGUAGCAGUGCGUGUCAUAGCC
Western blotting
Celler ble vasket med PBS og samlet ved å skrape i individuelle rør.. Proteiner ble hentet i henhold til protein utvinning protokoller, og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Pierce BCA protein assay kit (Thermo Scientific, Meridian Rd, Rockford). Proteinekstrakter (80 ug /felt) ble underkastet elektroforese på 10% polyakrylamidgeler (SDS-PAGE) etterfulgt av overføring til PVDF-membraner og blokkering med 5% fettfri tørrmelk i 2 timer. Membraner ble inkubert med primært antistoff mot CXCR7 (Abgent, San Diego, California) over natten ved 4 ° C. Sekundært antistoff (anti-kanin-IgG) ble inkubert i 1 time ved 37 ° C. Blottene ble vasket tre ganger med PBS, utsatt for Chemiluminescence reagenser (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), og utsatt for fotografisk film. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Cell migrasjon og invasjon Analyser
Transwell inserts (8,0 mikrometer pore størrelse) (Corning, Chelmsford St) ble brukt for migrasjon og invasjon analyser. Det nedre kammer ble fylt med 500 ul av RPMI 1640-medium eller i DMEM-medium med 10% FBS. PANC-1 og SU86.86 celler ble resuspendert i migreringsmedium (serumfritt RPMI 1640 eller DMEM) og 4 x 10
5 PANC-1 eller SU86.86 celler i 200 ul medium ble tilsatt til det øvre kammer etter blir vasket to ganger med PBS. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene på den øvre overflaten av membranen forsiktig og nøye skrapes ut ved hjelp av bomulls tips. De migrerende cellene som var vedheftende til den nedre overflate av membranen ble fiksert i 10% formalin ved romtemperatur i 30 minutter, og deretter farget med H E (hematoxylin og eosin farging). Resultatene av cellemigrering analysen ble evaluert ved å telle antall celler på den nedre overflate av membranen under et invertert mikroskop i fem forskjellige områder ved en forstørrelse på 200 x.
For celle invasjon assays, er undersiden av membranen ble belagt med ECM gel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i PBS i 5 timer ved 37 ° C. Panc-en eller SU86.86 celler (8 × 10
5 celler) i serumfritt RPMI 1640 medium eller DMEM medium ble sådd på ECM gel-belagte forkamrene, i henhold til produsentens instruksjoner. Celler som hadde krysset ECM og passerte gjennom porene i filteret ble telt i fem felter på 200 x. Resultatene er representative for tre ulike eksperimenter.
Statistiske analyser
For microarray resultater, bakgrunnskorreksjon og normalisering ble utført. Én-veis analyse av varians (ANOVA) og Student-Newman-Keuls (SNK) tester ble benyttet for å detektere statistisk differensielt uttrykte gener mellom ulike grupper. I bioinformatiske analyse, ble differensielt uttrykte gener utsatt for GO analyse hierarkisk clustering, prinsipal komponent analyse, SOM og Mann-Kendall test. Student-t og Chi-kvadrat tester ble brukt for å vise forskjeller i måling og kategoriske data. Den statistiske programvarepakken SPSS13.0 (SPSS Inc., Chicago, Ill) ble brukt. En statistisk signifikant
P
verdien ble definert som
P
. 0,05
Resultater
Vellykket Etablering av DMBA-indusert PC Model i rotter
akutt pankreatitt ble observert hos rotter (7 dager etter implantasjon) i både eksperimentelle og kontrollgruppene. Pankreas intraepitelial neoplasi (Panins) var til stede i 6 av 15 rotter (40%) i forsøksgruppen 2 uker etter implantering, mens ingen PC ble funnet i rotter i kontrollgruppen. En måned og 3 måneder etter implantasjon, 12 av 15 (80%) og 14 ut av 14 (100%) rotter i forsøksgruppen, henholdsvis, utvikles PC (fig. 1A, 1B). Fire rotter i 3-måneders gruppe utviklet tynntarmen metastaser eller levermetastaser (Fig. 1C, 1D). Imidlertid PC var fraværende i rotter i kontrollgruppene. PC-dannelseshastigheten i forsøksgruppen var høyere enn i kontrollgruppen (
P
0,05). En rotte døde før endepunktet (3 måneder), forårsaker en dødelighet på 6,7% (1/15).
(A) i bukspyttkjertelen svulst i en måned gruppe. (B) i bukspyttkjertelen svulst i 3-måneders gruppe. (C) Tynntarmen metastase knuter av bukspyttkjertelen svulst. (D) levermetastaser knuter i bukspyttkjertelen svulst.
Histologiske forandringer ble vurdert ved hjelp av HE flekker og lysmikroskopi. Normal bukspyttkjertelen (Fig. 2A), akutt pankreatitt (Fig. 2B), kronisk pankreatitt (Fig. 2C), Panin 2a (fig. 2D), Panin 2 (Fig. 2E), Panin 3 (Fig. 2F), godt differensiert PC (fig. 2G) og dårlig differensiert PC (fig. 2 H) ble observert.
(A) Normal bukspyttkjertelen (opprinnelig forstørrelse × 60). (B) Akutt pankreatitt (opprinnelig forstørrelse × 150). (C) Kronisk pankreatitt (opprinnelig forstørrelse x 150). (D) Panin 1a (opprinnelig forstørrelse × 60). (E) Panin 2 (opprinnelig forstørrelse × 150). (F) Panin 3 (opprinnelig forstørrelse × 60). (G) Godt differensiert PC (opprinnelig forstørrelse × 60). (H) Dårlig differensiert PC (opprinnelig forstørrelse × 60).
Forskjellig uttrykte gener i Rat DMBA-indusert PC Modell
Det er totalt 661 differensielt uttrykte gener ble påvist i normal bukspyttkjertel fra kontrollgruppen og forsøksgruppene (tabell 4). Ifølge GO klassifisering, ble genene som er involvert i ulike funksjonelle kategorier og multiple biologiske prosesser, herunder transport av gass, karbohydrat-metabolisme, antigen prosessering og presentasjon (Fig. 3A). Ved to-veis hierarkisk klyngeanalyse, normale bukspyttkjertel, akutt og kronisk pankreatitt, Panins og tidlig og avansert kreft i bukspyttkjertelen prøvene ble diskriminert helt (fig. 3B). Det var 11 oppregulert gener (probe) og 142 downregulated gener (probe) med Mann-Kendall trend Mono test (
P
0,05) (Fig. 3C). De øverste 20 oppregulert og downregulated gener i DMBA 3 måneders gruppe hvis uttrykk nivåer ble endret ved to-ganger sammenlignet med kontrollgruppen (P
0,01) er vist i tabell 5. I tillegg, homologe gener i rotte og menneske på ulike stadier av rottemodellen ble vellykket vist (tabell 6, fig. 3D).
(A) GÅ klassifiserings viser gener involvert i ulike molekylære funksjonskategorier. (B) To-veis hierarkisk clustering analyse. (C)
P
verdier i Mann-Kendall trend Mono test. (D) homologe gener i rotte og menneske på ulike stadier av rottemodellen.
Validering av forskjellig uttrykt gener
Vi valgte tre av de differensielt uttrykte gener, CXCR7, ATP6v1g2 og UBe2c, for videre undersøkelse. Først undersøkte vi deres uttrykk profiler ved QRT-PCR. De ΔCt verdier av CXCR7 gradvis redusert, sammen med langvarig DMBA-behandling (
P
0,05) (tabell 5), som indikerer oppregulert uttrykk. Det var ingen signifikante forskjeller for ATP6v1g2 og UBe2c (
P
0,05) (Tabell 7). Ved hjelp av immunhistokjemi, gjennom en patolog diagnose og konfirmasjon, betydelig forbedret CXCR7 og UBe2c ekspresjon ble påvist, sammen med progresjonen av PC i rotter (
P
0,05). (. Tabell 8, fig 4)
(opprinnelig forstørrelse × 200). (A), (C) Normale rotte bukspyttkjertel, farging HE. (B), (D) Rat PC, flekker HE. (E), (G) Normal rotte bukspyttkjertelen, CXCR7 immunhistokjemi flekker. (F), (H) Rat PC, Ube2c immunhistokjemi flekker.
Redusert migrasjon og invasjon etter Transfeksjon av CXCR7 siRNA i Panc-1 og SU86.86 cellelinjer
uttrykk for CXCR7 ble vellykket nedregulert i de to menneskelige PC cellelinjer, PANC-en og Su86.86 (fig. 5A), etter transfeksjon med CXCR7 siRNA, sammenlignet med transfeksjon med kontroll siRNA. Det ble ikke observert signifikante forskjeller i celle migrasjon og invasjon i CXCR7 siRNA transfekterte celler sammenlignet med kontrollceller (P 0,05). (Fig. 5B og 5C)
(A) knockdown av CXCR7 av siRNA transfeksjon. (B) Migrasjon etter transfeksjon av CXCR7 eller kontroll sirnas. (C) Invasion etter transfeksjon av CXCR7 eller kontroll siRNAs.
Diskusjoner
Ulike endringer i molekylære stier har vært kjent for å spille en viktig rolle i initiering og progresjon av PC [1 ]. Men en av de komplikasjoner i studier basert på humane prøver at funksjonene i hvert sykdomsfase kan ikke være lett vises. I dette aspektet, dyremodeller bære en unik fordel. I feltet for PC-forskning, har store modeller inkludert DMBA-induserte og transgene modeller [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [22]. Ved studier av DMBA-induserte rottemodell, har forskjellige DMBA doser og forekomst av PC utvikling er rapportert [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Den aktuelle studien, som var basert på våre tidligere rapportert metode [14], oppnår tilfredsstillende PC induksjons resultater. Derfor er disse funnene indikerer vellykket etablering av modellen.
Mikromatriser har vært mye anvendt i screening av differensielt uttrykte gener i PC [23], [24], [25], [26]. Imidlertid har denne teknikk ikke blitt benyttet i DMBA-indusert PC-modellen. Denne studien undersøkte genuttrykk profil i denne PC rottemodellen. Affymetrix microarray analyse identifisert totalt 661 gener som ble forskjellig uttrykt i normale bukspyttkjertelen fra kontrollgruppen og de eksperimentelle gruppene. Disse genene inkludert kritiske tilretteleggere av viktige funksjoner under bukspyttkjertel tumorigenesis [27], som Kras, CDKN2A, SMAD4, og TP53. Disse genene ble oppregulert eller nedregulert i løpet av svulstdannelse varighet bukspyttkjertelen. GO klassifisering, to-veis hierarkisk klyngeanalyse og Mann-Kendall trend Monotone test ytterligere identifiserte gener, inkludert nm23, cyklin B1 og FGFR3. En tidligere studie viste at nm23 var assosiert med metastatisk potensial menneske PC cellelinjer [28]. I denne studien, viste vi at nm23 uttrykk var signifikant forskjellig mellom normal bukspyttkjertelen og DMBA en måned gruppe, noe som tyder på at molekylet kan også være involvert i den tidlige fasen av patogenesen av PC. Lite informasjon er tilgjengelig om rollene til cyclin B1 og FGFR3 i PC [23], [29]. Dermed her gir vi ytterligere bevis på at begrunner sitt engasjement i denne sykdommen. Videre undersøkelser på de detaljerte mekanismene bak deres engasjement i PC er nødvendig.
Expression mønstre av tre forskjellig uttrykt gener, CXCR7, ATP6v1g2 og UBe2c, ble evaluert av QRT-PCR og immunhistokjemisk farging. Resultatene viste en gradvis oppregulert CXCR7 ekspresjon på mRNA-nivået, og forsterket positivt uttrykk for CXCR7 og UBe2c, sammen med langvarig DMBA-behandling. Disse funnene stort sett fulgt microarray data. CXCR7 ble tidligere vist å ha en innvirkning på vekst, apoptose, invasjon /metastase og prognose i mange kreftformer [30], [31], [32], [33]. En fersk studie viste at CXCR7 fremmet cellevekst i PC [34]. Imidlertid må det prognostisk betydning i PC kontroversiell [35], [36]. I rottemodellen og humane cellelinjer som benyttes i våre eksperimenter, ble foreningen av CXCR7 og progresjon, samt invasive proclivity av PC indikert. Derfor er ytterligere mekanistiske undersøkelser for de molekylære faktorer involvert i PC-verdi berettiget.
UBe2c ble etablert til å være forbundet med vekst og apoptose hemning i kreftceller, og dermed spiller en rolle i tumorigenese og viser potensialet til å være en biomarkør av både diagnose og prognose [37]. Imidlertid UBe2c som ikke tidligere er undersøkt i PC. I denne studien fant vi forbedret positivt uttrykk for UBe2c sammen med langvarig DMBA behandling, noe som tyder på sin potensielle rolle i utviklingen av PC. Spesielt, UBe2c mRNA-ekspresjon ble ikke signifikant endret, noe som indikerer at etter transkripsjonen regulering kan være involvert i forandringer av dets ekspresjon. Detaljerte mekanistiske data som ligger til grunn denne aktivering er nødvendig.
I sammendraget, våre data identifisert flere potensielle markører for PC basert på en omfattende screening og videre verifisering.
