Abstract
Prostatakreft er fortsatt den vanligste kreftformen blant menn i USA, og det er ingen kur for tiden tilgjengelig for avansert stadium hormon-ildfast kreft. Dette er delvis på grunn av ufullstendig forståelse av androgen regulerte proteiner og deres kodede funksjoner. Hel-celle proteom av androgen-sultet og androgen-behandlet LNCaP celler ble analysert ved semi-kvantitativ mudpit ESI ionefelle MS /MS og kvantitativ iTRAQ MALDI- TOF MS /MS-plattformer, med identifisering av mer enn 1300 høy grad av tillit proteiner. En berikelse basert sti kartlegging av androgen-regulert proteomikk datasett avdekket en betydelig feilregulering av aminoacyl tRNA syntetaser, noe som indikerer en økning i protein biosynthesis- et kjennetegn ved prostatakreft progresjon. Denne observasjonen er støttet av Immunoblotanalyse og transkripsjons data fra LNCaP-celler og prostata kreftvev. Dermed data fra flere proteomikk plattformer og karakterutskrift data kombinert med informatikk analysen gir en dypere innsikt i de funksjonelle konsekvensene av androgen action i prostatakreft
Citation. Vellaichamy A, Sreekumar A, Strahler JR, Rajendiran T, Yu J, Varambally S, et al. (2009) proteomikk Interrogation av androgen action i prostata kreft celler avslører Roller av aminoacyl tRNA syntetaser. PLoS ONE 4 (9): e7075. doi: 10,1371 /journal.pone.0007075
Redaktør: Lennart Randau, Yale University, USA
mottatt: 03.07.2009; Godkjent: 29 juli 2009; Publisert: 18.09.2009
Copyright: © 2009 Vellaichamy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert delvis ved Michigan Technology Tri-Corridor, Michigan Economic Development Corporation tilskudd 687 for Michigan Proteomics Alliance for Cancer Research (GSO, AMC, AS, aV), National Institutes of Health gir U54DA021519 for National Center for Integrative Biomedical informatikk (GSO, AMC), R01CA126239 (AN), RO1CA133458 (AS, AMC) U01 CA111275 (AMC), 1K99CA129565-01A1 (JY), og P50 CA69568 (AMC, AS), Department of Defense PC080665 (JY), og Fond for Discovery ved University of Michigan Comprehensive Cancer Center (AS). AMC er støttet av en klinisk translasjonell Science Award fra Burroughs Velkommen Foundation og er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i prostata (PCA) er den vanligste diagnosen kreft blant menn i USA, med anslagsvis 200.000 nye tilfeller og 29.000 dødsfall i 2008 [1]. Mange rapporter tyder på at androgener som er nødvendig for normal utvikling av prostata støtter også veksten og utviklingen av PCa. Androgener utøve sine cellulære effekter via binding til androgen reseptor (AR), et medlem av den kjernefysiske hormon reseptor (NR) super familie. AR, i sin tur binder seg til androgen responselementer (Ares) i promoter- og forsterker regioner av målgener, som virker som en transkripsjonsregulator av transduse beslektet hormonet signalet i kjernen [2], [3]. Prostatakreft terapi gjennom androgen ablasjon utgangspunktet oppnår regresjon av svulster; imidlertid, kan en mer aggressiv, hormon ildfast form av tumor (HR-PCA) utvikles, med påfølgende dødelighet. Selv om flere grupper har avhørt androgen-regulert endringer på transkriptom og proteom nivåer ved hjelp av genuttrykk arrays og massespektrometri, henholdsvis [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10 ], er det fortsatt en betydelig mangel på forståelse for den funksjonelle konsekvens av hormonet aksjon under prostata kreftutvikling. Delvis denne mangel er en refleksjon av lav i proteomikk data; på grunn av begrensninger i proteomic teknologi, er det totale antall proteiner som er identifisert og kvantifisert i en enkelt studie beskjeden. I tillegg er det tekniske utfordringer fra en slik underrepresentasjon av proteiner og ved vurdering av statistisk signifikans av forskjeller i proteinuttrykk.
For å overvinne disse utfordringene, og for å få en dypere innsikt i androgen-regulert proteomikk endringer i prostatakreft, søkte vi en todelt strategi. Først forbedret vi pusten av androgen-regulert proteom- profilert i denne studien ved å ansette to komplementære massespektrometri (MS) plattformer: en som involverer isotop merking av peptider med en iTRAQ reagens etterfulgt av 2D væskekromatografi (LC) MALDI- TOF MS /MS-analyse på en ABI 4800 MALDI tandem time-of flight (TOF /TOF) instrument [11], og den andre en etikett-fri tilnærming basert på spektrale telle [12], [13], [14], [15] Ved hjelp av multi-dimensjonale Protein Identification Technology (mudpit) [16] med elektro ionisering (ESI) – ionefelle MS /MS på en lineær ionefelle (LTQ) instrument. For det andre belyses vi proteomikk endringer i sammenheng med funksjonelle trasé ved hjelp Molecular Concepts Mapping (MCM, også kalt Oncomine Concepts Mapping (OCM)) [17], for å få dypere innsikt i biologien til androgen action i prostatakreft. Spesielt slike kombinatoriske analyser viste en påfallende økning i nivået av aminoacyl tRNA syntetaser (Aars) som kan ligge til grunn for økningen i proteinsyntese spådde i prostata kreft av ulike genuttrykkstudier.
Resultater
Vi benyttet en integrerende strategi (figur 1) for å forstå androgen action i prostatakreft. I korte trekk, utførte vi massespektrometri-baserte proteomet profilering av androgen-fratatt og androgen-stimulert LNCaP celler. Trypsin-fordøyd proteiner ble identifisert og kvantifisert ved hjelp av to massespektrometri plattformer: iTRAQ MALDI-TOF MS /MS og mudpit ESI ionefelle MS /MS. Dataene fra hver av disse plattformene ble normalisert uavhengig av hverandre og kombineres for å generere en liste over androgen regulerte proteiner. Androgen regulert proteom- ble avhørt for biologiske foreninger som bruker Molecular Concepts Mapping (MCM). Fra de mange molekylære konsepter, inkludert androgen-regulert og prostatakreft konsepter som ble beriket av vår androgen oppregulert datasett, ble begrepet som beskriver forhøyet aminoacyl tRNA syntetaser (aaRSs) valgt for videre undersøkelse. En undergruppe av disse proteiner ble bekreftet ved immunblotanalyse. Bruke transcriptomic profilering og kromatin immunoprecipitation, viste vi at androgen driver uttrykk for aaRSs på karakterutskriften nivå. Til slutt viste vi eksistensen av forhøyet Aars nisje under prostata kreft progresjon ved hjelp av kliniske prøver.
Androgen-stimulerte LNCaP celler ble profilert ved hjelp av både kvantitative iTRAQ MALDI- TOF /TOF og semi-kvantitative mudpit ESI LTQ proteomikk plattformer. Data fra hver av disse plattformene ble normalisert uavhengig av hverandre og kombineres for å generere en liste over androgen regulerte proteiner. Denne listen ble avhørt for biologiske foreninger som bruker Molecular Concepts Mapping (MCM). Konseptet beskriver aminoacyl tRNA syntetaser ble valgt for videre behandling; utvalgte proteiner ble validert ved hjelp av immunoblot og immunfluorescens farging. Transcriptomic profilering og kromatin immunoprecipitation viste at androgen driver uttrykk for aminoacyl-tRNA synthases på karakterutskriften nivå. Dette ble ytterligere bekreftet ved hjelp av kreftvev genuttrykk data og immunoblotanalyse av prostata vevsprøver, som viste eksistensen av den forhøyede aminoacyl-tRNA-syntetase nisje i løpet av prostatakreft progresjon.
Identifikasjon og kvantifisering av relativ LNCaP proteiner ved iTRAQ MALDI-TOF MS /MS
ved hjelp iTRAQ MALDI-TOF MS /MS-plattformen, identifiserte vi 904 proteiner med høy tillit score som bestemmes med SEQUEST [18], PeptideProphet [19] og ProteinProphet [20] dataverktøy. Av disse 879 ble kvantifisert etter data normalisering (figur 2A), med den samlede protein identifikasjon FDR på mindre enn 1% (se Materialer og Metoder for detaljer).
A) Venn-diagram som viser antall total og sub-sett av androgen regulerte proteiner identifisert fra iTRAQ MALDI TOF- MS /MS-analyse. Et minimum av 1,25 SD fra den globale middeltemperaturen i begge androgen-behandlede prøver og ikke mindre enn 1,5 SD i en av androgen behandlede prøvene ble satt. B) Venn-diagram som viser det totale antallet og androgen-regulert LNCaP proteiner identifisert i mudpit (ESI ion felle MS /MS) analyse. Proteiner i parentes ble ikke ansett for differensial analyse på grunn av deres lavere spektrale teller. C) Venn-diagram som viser det totale antall proteiner som er identifisert fra to masse-spektrometrisk plattformer og deres overlapping. D) Venn-diagram som viser det totale antall androgen opp-regulerte proteiner identifisert fra to masse-spektrometrisk plattformer og deres overlapping. E. Venn-diagram som viser det totale antall androgen nedregulert proteiner identifisert fra to masse spektrofotometrisk plattformer og deres overlapper hverandre.
Prosedyremessig ble androgen proteomet vurdert av iTRAQ bruke to uavhengige biologiske replikat. En dobbel duplex iTRAQ eksperiment ble utført hvori androgen-behandlede prøvene i hvert replikat ble merket med 115 og 117 isobariske koder mens de tilsvarende kontrollprøver ble merket ved hjelp av 114 og 116 isobariske koder. For å utlede en terskel for å definere proteinekspresjon endringer, normalisert vi den relative proteinforholdet for hver av de androgen-behandlede prøver og en av kontrollene (merket med isobar merkelappen 116) til proteinet uttrykket i kontrollprøven som er merket med 114 isobar tag. Fordelingen av alle protein forholdstall for androgen-behandlede prøve (tag 115) versus kontroll (tag 116) er vist i Tilleggs Figur S1A. Mer enn 80% av proteinene hadde forhold i området fra 0,8 til 1,2. Median-sentrert normalisering resulterte i en gjennomsnittlig nær enhet for alle prøver, og standardavviket av styre replikere (merkelappen 116, SD = 0.16) ble brukt som en målestokk for å sette terskelforholdet for differensielt uttrykte proteiner. Følgelig endringer med et minimum på 1,25 SD (ratio på 1,2 for oppregulert og 0,83 for nedregulert) ble betraktet som signifikante (se Materialer og metoder for detaljer). Listene over alle 70 androgen oppregulert og 39 nedregulert proteiner identifisert fra denne analysen er gitt i Utfyllende Tabell S1 og analytiker Tabell S2, henholdsvis.
Semi-kvantitativ sammenligning av proteiner ved hjelp mudpit analyse
ved hjelp av mudpit ESI ionefelle MS /MS proteomikk profilering tilnærming 857 proteiner ble identifisert med den minimale protein sannsynligheten score på 0,9 (beregnet FDR på mindre enn 1%); 67% (574) av dem ble identifisert i felles mellom kontroll og androgen-behandlede prøver, mens 126 og 157 proteiner proteiner ble påvist bare i kontroll og androgen-behandlede prøver, henholdsvis (figur 2B). I tillegg til bestemmelse av nærvær eller fravær av proteiner, utførte vi en statistisk analyse for å sammenligne de relative spektrale teller for proteiner i hver behandling. Det totale antall spektra fra enten kontroll eller androgen-behandlede data var uavhengig normalisert, og de normaliserte kumulative spektrale tellinger av alle peptider for hvert protein ble anvendt som et mål på protein overflod. Basert på statistisk analyse av data, ble proteinene betegnet som uttrykkes differensielt om de bare ble identifisert i enten kontroll (nedregulert) eller androgen behandlede prøve (oppregulert) med fire eller flere peptider. For proteiner identifisert i begge prøver ble normalisert spektrale telleforhold av to standardavvik over eller under gjennomsnittet av alle proteinene i den gruppe (som tilsvarer fire ganger endring) anvendt som cut-off (se Materialer og Metoder; se Tilsetnings Figur S1B for fordeling av de normaliserte spektrale telleforhold for proteiner identifisert i kontroll og androgen behandlede prøver). Basert på disse kriteriene, ble 65 og 57 proteiner utpekt som androgen oppregulert og nedregulert, henholdsvis (Supplementary tabell S3, upplementary tabell S4).
Kombinert liste over differensielt uttrykte proteiner identifisert fra de to MS plattformer
med den forståelse at listen over peptider profilerte ved massespektrometri er påvirket av ionisering kilde og massen analysator [21] (i dette tilfellet MALDI- TOF vs. ESI-ionefelle), vi kombinert protein lister som stammer fra de to MS plattformer for å utlede et sammensatt liste. Dette ble forenklet ved det faktum at de to plattformene identifisert tilsvarende antall av høye pålitelighets proteiner (857 og 879 proteiner fra mudpit og iTRAQ, henholdsvis med tilsvar FDR på mindre enn 1%). Som et første skritt i prosessen, ble ikke-redundante proteiner hentet fra hvert forsøk ved å konvertere sine IPI deponeringsnummer til genet IDer. Tre proteiner (lektin, mannose-bindende 2, LMAN2; CLPX, kaseinolytisk peptidase X homolog, og 40S ribosomalt protein S9, RPS9) ble som viste uharmoniske trender i sitt uttrykk mellom de to plattformene fjernes. Disse prosedyrer ga en total av 844 og 875, henholdsvis proteiner, for mudpit og iTRAQ datasett (figur 2B, 2A). Sammen 1306 proteiner ble observert i det kombinerte datasettet (figur 1 og figur 2C). Av disse ble 126 unike proteiner forhøyet ved androgen behandling. Spesielt, 9 av disse androgen-up regulerte proteiner overlappet mellom de to proteomikk plattformer (figur 2D): KLK3, ACSL3, FASN, FKBP5, Aars (alanyl-tRNA syntetase), FDFT1 (farnesyl-difosfat famesyltransferase 1), UAP1 (UDP- N-acteylglucosamine pyrophosphorylase 1), ENDOD1 (endonuklease domene som inneholder en), og NDRG1. Den kombinerte nedregulert liste inneholdt 95 proteiner, og en (HNRPL, heterogen kjernefysisk ribonucleoprotein L isoform a) var vanlig mellom iTRAQ og mudpit plattformer (figur 2E).
Vår liste over oppregulert proteiner inkluderte fem proteiner som har vist seg tidligere å være forhøyet ved androgen action: ACSL3 (iTRAQ ratio 2,76), FKBP51 (iTRAQ ratio 1,91; mudpit spektral teller 17:00), FASN (iTRAQ ratio 1,85; mudpit spektral teller 417:45), NDRG1 (iTRAQ ratio 1,76; mudpit spektral teller 05:00), og KLK3 (også kjent som PSA, prostataspesifikt antigen [22], iTRAQ ratio 1,44; mudpit forholdet 11:00). En direkte kvantitativ sammenligning av proteiner identifisert på både MS plattformene viste en høy positiv korrelasjon (R2 = 0,92) for tre proteiner (ACSL3, FASN, og Aars, se Utfyllende figur S1). Disse funnene uavhengig bekreftet vår normalisering prosedyre og tersklene som ble brukt til å bygge den kombinerte listen over androgen regulerte proteiner. Videre ble immunoblotanalyse anvendt for å bekrefte den androgen-reguleringen av en undergruppe av opp-regulerte proteiner (Figur 3A). Spesielt, i tillegg til å validere massespektrometri resultater, immunoblot-analyse viste sterk kompresjon i gangers endring av proteinekspresjon avgrenses av iTRAQ eksperiment (figur 3A). En tilsvarende verifiserings ortogonale utført for androgen opp-regulert protein fettsyre syntase av immunofluorescence- mikroskopi er vist i figur 3B.
A) Ekspresjon gangers skifte av androgen-regulerte proteiner i masse-spektrometrisk kvantifisering sammenlignet med immunblot vurderings . Vist er immunoavtrykket band og deres intensitet for androgen oppregulert proteiner og deres beregnede intensitetsforhold samt iTRAQ forholdstall og mudpit spektrale teller de tilsvarende proteiner. Beta-tubulin blir brukt som en prøve lastekontroll. B) Immunfluorescens farging av AR (rød) og FASN (grønn) ved å følge bærer (etanol) og 1 nM R1881 behandlinger for 48 h på LNCaP-celler. Behandlingen ble gitt etter 48 h av androgen deprivasjon.
Analyse av androgen oppregulert biologiske prosesser og stier av MCM analyse
For å få innsikt i den funksjonelle konsekvensen av androgen-action, En stor-skala krets analyse ble utført som sammenligner vår androgen oppregulert protein datasett av 126 proteiner med hver av de 13364 begreper i MCM [23]. Fremgangsmåten som er involvert i valg av viktige molekylære konsepter er beskrevet i «Materialer og metoder» -delen. Anrikningen nettverk resulterte i MCM analyse med det kombinerte sett av androgen oppregulert proteiner er vist i figur 4. Det er viktig å analyse viste berikelse av kjente prostata cancer-spesifikke og androgen-regulert begreper, og dermed gi en validering av proteomikk data som genereres i dette arbeidet (figur 4, rødfargede kanter). Nestet innenfor disse tidligere kjente prostata-spesifikt konsepter var en som beskrev et sett med co-beriket genene nedregulert i pasienter med prostatakreft etter post-neoadjuvant (anti-androgen) terapi [17]. Andre begreper av betydning inkludert de for aminoacyl-tRNA biosyntese og ER til Golgi transport (både GO biologisk prosess), aminoacyl-transfer RNA syntetase klasse II (Interpro), og RSRFC4 (MEF2A) og NKX3A (begge Transfac). Vi var fascinert av disse konseptene som nevnt aminoacyl tRNA syntetaser (KEGG pathway: https://www.genome.jp/kegg/[24], [23]), som de potensielt gjenspeiler en økning i aminosyre utnyttelse og dermed en økning i nedstrømsproteinsyntese ved androgen behandling (figur 4, blå farget kanter). Denne observasjonen er i overensstemmelse med vår tidligere genuttrykk-basert prediksjon av økt proteinsyntese som ett av kjennetegnene ved prostatakreft utvikling [17]. Forhøyet Aars aktivitet var også blant de viktigste begrepene beriket av matchet transkriptom data for androgen behandlet LNCaP celler (data ikke vist). Dermed slike observasjoner førte oss til å velge aminoacyl tRNA syntetase konsept for videre analyser.
Nettverk visning av molekylære konsepter eller sett av biologisk beslektede gener beriket i androgen up-regulert protein sett oppnås gjennom Molecular Concepts Mapping (MCM) analyse. Hver node representerer et biologisk begrep; noden størrelse er proporsjonal med antall gener i hvert konsept. Hver kant representerer en statistisk signifikant berikelse. P-verdien av hvert konseptet og MCM antall av konseptet er gitt i parentes. Den mest anrikede konseptet er angitt med en tykk kant. Rødfargede kanter tyder på anrikning av kjente prostatakreft-spesifikke og androgen-regulert konsepter. Sammenhengende aminoacyl tRNA syntetase begrepene er angitt i blå kanter nederst i nettverket.
Androgen regulering av aminoacyl tRNA syntetaser
Det var 7 proteiner i Aars kategori som overskred den innstilte terskel i den kombinerte listen av proteiner definert ved hjelp av både MS plattformer: Aars for alanin (Aars), fenylalanin (FARSLA), glycin (GARS), histidin (hars), asparagin (NARS), treonin (TARS) og tryptofan (WARS). Av disse bare AARS og hars ble nominert av mudpit plattform (tabell S3) mens AARS og resten ble nominert av iTRAQ studien (tabell S1). Selv om det totale antall aars identifisert i iTRAQ og mudpit eksperimenter, var 14 og 13, henholdsvis flere av disse proteiner ble identifisert med mindre enn fire peptider i mudpit eksperiment som gjør det mindre egnet for deres spektrale telleverdi basert kvantifisering. Dette indikerer også den lave rike naturen av denne kritiske klasse av proteiner. Derfor fokuserte vi å ytterligere analysere iTRAQ identifisert aaRSs og undersøkt om det er kompresjon i uttrykk forholdet til tross for sin opphøyde uttrykk. Av de 14 aaRSs identifisert i iTRAQ studien, seks hadde iTRAQ forholdstall 1.2 og høyere, og tre av dem hadde forholdstall 1.1 og oppover i både androgen behandlede pasienter (115 og 117) replikere prøver. Over-uttrykk for flertallet disse (ni av 14) aaRSs er avbildet i et varmekart (figur 5A). En undergruppe av disse iTRAQ identifisert aaRSs (GARS, Kars, og WARS) ble validert ved hjelp av androgen-behandlet LNCaP celler ved immunoblot analyse (figur 5C). Videre undersøkte vi deres transkripsjonsnivåer ved hjelp matchet genuttrykk data for androgen-behandlet LNCaP celler (se Materialer og metoder). Ni av de fjorten proteiner identifisert av vår protein profilering ble forhøyet ved karakternivå på tvers av uavhengige genuttrykk eksperimenter (figur 5B). Denne viste potensiell regulering av disse proteiner ved transkripsjonen aktivering av androgen. Disse dataene støtter også observasjon av kompresjon i ganger endring av protein uttrykk i iTRAQ forholdstall.
A) Varme kart som viser forhøyet uttrykk av aminoacyl-tRNA syntetaser identifisert fra iTRAQ eksperiment. Bare proteiner i fet skrift er utpekt som androgen oppregulert i iTRAQ data basert på terskelen cut-off anvendt. B) Heat kart som viser konkordant overuttrykk av vitnemål målt ved bruk av oligonukleotid microarray (Affymetrix U133 Plus 2.0) for aminoacyl-tRNA syntetaser vist i A. C) immunoblotanalyse av aminoacyl t-RNA syntetaser GARS, Kars, og WARS svar på androgen behandling i LNCaP celler. Beta-tubulin er brukt som lasting kontroll. D) Immun analyse Kars og GARS i prostatakreft (PCA), og metastatisk prostatakreft (Met) sammenlignet med normale (godartet) prostata vev. Beta-aktin brukes som lasting kontroll. E) Arrangøren-belegg på AR på aminoacyl tRNA-gener. Chromatin immunoprecipitation (chip) -PCR analyse viser androgen-avhengige anrikning av AR-binding til målet arrangører av
GARS Hotell og
KARS
. Anrikning-forholdet ble beregnet basert på mengden av target forsterkning mot den innførte DNA med primere for
GAPDH
promoter anvendt som kontroll. Primersekvensene som spenner over de gen-promotorer er gitt i tabell S5. F) Meta-analyse av aminoacyl t-RNA syntetase gener (proteiner vist i A) over tre prostatakreft genuttrykk profilering studier. Oncomine varmen kartvisning som viser over-uttrykk for en undergruppe av aminoacyl-tRNA syntetase gener i prostatakreft sammenlignet med sine godartede kontroller. Gene symboler av proteiner som passerer gjennom cut-off verdi og ble tildelt som androgen oppregulert i iTRAQ data vises i fet skrift. P-verdien angir den betydning av uttrykket i to av de tre studiene. Rødt, hvitt og blått (ikke tilstede i figuren) indikerer relativ over, uendret, og i henhold til uttrykk, respektivt.
Androgener medierer deres positive virkning på transkripsjon ved å bindes til androgen reseptoren, som i sin tur binder seg til androgen responselementer på arrangører av målgener [25]. Dermed fortsatte vi å undersøke androgen binding til arrangører av aminoacyl tRNA syntetaser bruker kromatin immunpresipitering (chip, se Materialer og metoder). Figur 5E viser representativt eksempel på økt belegg på AR på arrangøren av
GARS Hotell og
KARS
bekrefter androgen regulering av sitt uttrykk på karakterutskriften nivå.
neste utvidet vårt cellelinje observasjon til prostata kreft vevsprøver. Først brukte vi ONCOMINE database (www.oncomine.org) for å utføre en meta-analyse for aminoacyl tRNA syntetase transkripsjoner over flere prostatakreft studier [26]. En undergruppe av aaRSs ble funnet å være oppregulert i lokaliserte prostatakreftprøver i mer enn én studie (figur 5F). Denne observasjonen ble bekreftet ved hjelp av immunoblot-analyse av prostata-avledede prøver som inkluderte godartet tilstøtende, prostatakreft og metastatisk sykdom. Viktigere, fire av de fem lokaliserte PCa og fire av de fem metastatisk PCa viste forhøyet ekspresjon av KARS og GARS i forhold til tre av de fire godartede prøvene som ble testet (figur 5D). Disse låne troverdighet til en mulig rolle androgen-regulert aminoacyl tRNA syntetaser aksjon under prostatakreft progresjon.
Diskusjoner
For å avgrense de biologiske prosessene og stier som er feilregulert av androgen i prostatakreft, vi vedtatt en strategi for global MS-basert proteomikk profilering koblet til berikelse basert sti kartlegging i androgen-responsive prostatakreft cellelinje LNCaP. Vi profilert proteomet av LNCaP celler med og uten androgen behandling ved hjelp av to proteomikk plattformer: kvantitativ iTRAQ MALDI-TOF MS og semi-kvantitative mudpit ionefelle MS. Hver av plattformene uavhengig er identifisert i overkant av 850 med høy pålitelighet proteiner, noe som ga et totalt 1306. Gevinsten i kumulative protein teller er i overensstemmelse med tidligere rapporter som beskriver den fordel utspørrende globale proteom ved hjelp av komplementære massespektrometri plattformer [21], [27] . Vi var i stand til å identifisere 126 proteiner som ble oppregulert ved androgen behandling. Inkludert var kjent mål for androgen action: KLK3, FKBP5, FASN, AGR2 (anterior gradient homolog 2), Sord (sorbitol dehydrogenase), NDRG1, ACSL3 og FOLH1 (folat hydrolase 1). I tillegg nestet i kompendier av forskjellig regulert proteiner, var nye mål for androgen action som inkluderte PCID1 (PCI domene som inneholder en), RAB10 (ras-relaterte GTP-bindende protein RAB10), og PEA15 (phosphoprotein beriket i astrocytter 15).
en ytterligere fordel ved bruk av ione-felle-baserte profilering strategi i tandem med TOF-TOF basert kvantitativ profilering var at data fra det tidligere bidro til å kompensere tapet av oppløsningen som følge av iTRAQ forholdet kompresjon sett i sistnevnte. Dette tillater bruken av lavere terskelnivået fra iTRAQ-baserte kvantifisering for forstyrrelse analyse. Forholdet komprimering har blitt mye rapportert av andre, f.eks [28], og er godt illustrert ved direkte sammenligning av iTRAQ forholdstall for androgen-regulerte proteiner med tilsvarende uttrykk som bedømt ved immunoblotanalyse (figur 3). Som et eksempel, ble protein FASN identifisert med 17 peptider; blant dem de mest differensielt uttrykte peptid hadde en iTRAQ-forhold på 2,79. Spesielt i snitt alle iTRAQ forholdstall for 17 peptider resulterte i en ytterligere komprimert protein iTRAQ ratio på 1,85, mens densitometry basert analyse av sitt uttrykk av immunoblot avslørt ganger endring av åtte og immunfluorescens analyse viste også en svært forhøyet uttrykk. Denne konklusjonen understøttes av den spektrale telling av de mudpit data, karakterisert ved at FASN er representert ved 417 spektra i androgen-behandlede prøve sammenlignet med bare 45 spektra i kontrollprøven. Slike ratio komprimering, men sett i andre studier, var mer fremtredende i våre iTRAQ MALDI- TOF /TOF data sammenlignet med andre kvantitative MS plattformer som ICAT [9]. Denne forskjellen kan forklares ved en større masse toleransevindu for seleksjon av peptid-ioner for MS /MS-fragmenteringen i ABI 4800 TOF /TOF masse analysator anvendt her [29]. Vi tror at denne kompresjon i forholdet kan delvis forklare den dårlige overlapping mellom settene med androgen regulerte proteiner nominert fra hvert av de to MS plattformer. I tillegg faktorer som forskjeller i peptid behandling (merket versus umerket), peptid fraksjonering (on-line og offline), MS datainnsamling (ionefelle versus TOF /TOF masse analysator), data normalisering (prosenter av spektrale teller versus prosenter av iTRAQ etiketten peak intensitet), og egenskapene til peptider valgt for MS /MS-sekvensering kan spille sentrale roller i mangel på global samstemmighet. Disse faktorene, i tillegg til de biologiske varianter som flere skjøte skjemaer for en enkelt tiltredelse kan også ha bidratt til disse tre proteiner som viste uharmoniske tendenser mellom de to plattformene observert.
Ja, det er fastslått at forskjellige proteomic plattformer viser betydelige forskjeller i de fysikalsk-kjemiske egenskapene til de identifiserte peptidene [30]. Dermed strategien for å bruke to forskjellige massespektrometre, som skiller seg både i deres ionisering kilde og prinsipp for peptid deteksjon, tillot oss å bygge en additiv liste av proteiner og få en dypere innsikt i androgen-regulert proteom. Med høyere nivå berikelse analyser, vår studie viste at undergrupper av proteiner, etter innstilling av hver av de to plattformer, kart til lignende begreper inkludert de som er androgen-avledet og prostatakreft-avledet. Med en streng terskel innstilling for spektral telling basert semi-kvantifisering, hadde mudpit eksperiment nominert bare to aaRSs kandidater som androgen regulert. Men på grunn av nominasjonen av høyere antall aaRSs fra iTRAQ eksperiment, molekylær konsept nettverk med kombinert datasett viste et sett av sammenkoblede Aars konsepter med betydelige score (figur 4). Enda mer interessant, var imidlertid at hver av de to uavhengige lister av proteiner, når det analyseres separat ved MCM analyse, anriket for begreper som var kjent for å være forbundet med prostatakreft progresjon, men ble ikke identifisert i analysen av det kombinerte datasettet (figur 4, Supplerende Figur S2). Et eksempel på dette var anriking av ETS (ETV1 og ERG) over-uttrykk konsepter av androgen-regulert proteiner nominert av mudpit analyse. Det var interessant i forbindelse med tidligere rapporter som beskriver eksistensen av tilbakevendende genfusjoner som involverer ETS transkripsjonsfaktorer for å være pathonomonic til prostata kreftutvikling [31], [32]. Disse genfusjoner har vist seg å bringe ETS transkripsjonsfaktorer i henhold til androgen kontroll, og ETV1 (kromosom 7p21) er kjent for å være over-uttrykt ved androgen gjennom omleiring til 14q13.3-14q21.1 region av kromosom 14 i LNCaP-cellelinje undersøkt her [31]. Ettersom antallet ETS regulert proteinene identifisert i mudpit var tilstrekkelig til å kartlegge ETS overekspresjon konsept, mangel på tilsvarende andel av denne klassen av proteiner i iTRAQ plattformen muligens resulterte i forsvinningen av det samme konseptet i den kombinerte analysen. Således bruken av flere massespektrometriske plattformer bidrar til å klargjøre flere roller av androgen virkning.
I tillegg til tidligere kjente androgen-regulert biologiske prosesser forbundet med prostatakreft progresjon, for eksempel NDRG1 [33] som bidro til å bekrefte vår proteomikk studien vår liste over androgen regulerte proteiner ble beriket for aminoacyl tRNA syntetaser. Flere aaRSs som er kjent for å spille en sentral rolle i proteinsyntese ble inkludert i dette konseptet. Dette funnet var interessant i sammenheng med tidligere genuttrykk baserte prediksjoner fra vårt laboratorium: en økning i proteinsyntesen i løpet av prostatakreft progresjon drevet av handlingene til ETS transkripsjonsfaktorer [17]. Disse observasjonene føre oss til validering av dette funnet på flere nivåer;
