Abstract
Integrative analyser av flere genomiske datasett for utvalgte prøver kan gi bedre innsikt i de samlede data og kan øke vår kunnskap om kreft. Målet med denne studien var å belyse sammenhengen mellom antall kopier variasjon (CNV) og genuttrykk i kolorektal kreft (CRC) prøver og deres tilsvarende ikke-kreft vev. Sixty-four sammenkoblede CRC prøver fra de samme pasientene ble utsatt for CNV profilering ved hjelp av Illumina HumanOmni1-Quad-analysen, og validering ble utført ved hjelp av multiplex ligation probe amplifiseringsmetode. Genome-wide uttrykk profilering ble utført på 15 parvise prøver fra den samme gruppen av pasienter ved hjelp av Affymetrix Menneskelig Gene 1,0 ST array. Betydelige gener hentet fra både array-resultatene ble deretter overlappes. For å identifisere molekylære stier, ble dataene kartlagt til KEGG database. Hele genomet CNV analyse som sammenlignet primærtumor og ikke-kreft epitel avslørt gevinster i 1638 gener og tap i 36 gener. Betydelige gevinster ble stort sett funnet i kromosom 20 i posisjon 20q12 med en frekvens på 45,31% i tumorprøver. Eksempler på gener som var knyttet til dette cytoband var
PTPRT
,
EMILIN3 Hotell og
CHD6
. Det høyeste antallet tap ble påvist på kromosom 8, posisjon 8p23.2 med 17,19% forekomst i alle tumorprøver. Blant de genene som finnes på dette cytoband var
CSMD1 Hotell og
DLC1
. Genome-wide uttrykk profilering viste 709 gener for å være oppregulert og 699 gener for å bli nedregulert i CRC sammenlignet med ikke-kreftprøver. Integreringen av disse to datasett er identifisert 56 overlappende gener, som ble plassert i kromosomene 8, 20 og 22. MLPA bekreftet at CRC-prøver hadde de høyeste gevinst i kromosom 20 i forhold til referanseprøvene. Tolkning av CNV data i sammenheng med transkriptomet via integrerende analyser kan gi mer inngående kunnskap om genomisk landskapet av CRC
Citation. Ali Hassan NZ, Mokhtar NM, Kok Sin T, Mohamed Rose jeg , Sagap jeg, Harun R, et al. (2014) Integrert analyse av Kopier nummer Variasjon og Genome-Wide expression profilering i tykktarmskreft vev. PLoS ONE 9 (4): e92553. doi: 10,1371 /journal.pone.0092553
Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA
mottatt: 04.07.2013; Godkjent: 24 februar 2014; Publisert: 02.04.2014
Copyright: © 2014 Ali Hassan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet ble finansiert av departementet for vitenskap, teknologi Innovasjon (07-05-MGI-GMB016) og høyere institusjon Centre of Excellence gi fra departementet for høyere utdanning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en stor helse bekymring, med mer enn en million personer diagnostisert hvert år over hele verden [1]. Dette kreft er blant de tre beste av alle krefttilfeller som fører til død på verdensbasis [2]. I Malaysia, rangerer den som den nest vanligste kreftformen hos begge kjønn [3].
En form for genetisk ustabilitet som er observert i minst 85% av sporadiske CRC tilfeller er kromosomal instabilitet (CIN) [4] . Aneuploidy er en konsekvens av CIN som fører til gevinst eller tap av hele eller deler av kromosomale regioner [5], og det kan føre til strukturell kompleksitet som fører til genomisk ustabilitet. En vanlig form for strukturelle varianter på grunn av CIN er kjent som kopinummervariasjoner (CNVs), som er definert som gevinst eller tap av kopier av DNA-segmenter som er større enn 1 kb i lengde i forhold til en referansegenom [6]. CNVs kan påvirke genekspresjon og har blitt assosiert med sykdom følsomhet. Det har vært antydet at transkripsjons endringer tilsvarer CNVs og endringer i genet dosering kan være korrelert med endringer i uttrykk nivå [7].
Tusenvis av CNV nettsteder har blitt dokumentert ved hjelp av mikromatriseteknologi. Tidligere studier på kolorektal kreft har avslørt gevinster på kromosom 8Q, 13 og 20Q og tap på kromosom 8p, 17p og 18q [8], [9], [10], [11], [12]. Disse aberrasjoner fører til sletting eller amplifisering av tumorsuppressorgener, onkogener, eller ikke-kodende RNA som mirnas, noe som resulterer i unormal ekspresjon av gener som påvirker kreft-relaterte biologiske prosesser [13], [14].
et gen som har en duplisert allel (et kopiantallet av 3) har et høyere nivå av ekspresjon enn villtype [15]. Omvendt vil et gen som har en allel slettet (et kopiantallet av 1) har et lavere nivå av ekspresjon [15]. Integrative analyser i CRC viste at uttrykket nivåer av visse onkogener og tumorsuppressorgener var knyttet til CNV [16]. For eksempel, forsterkning eller gevinst på
MYC
genet i posisjon 8q24 resulterer i over-uttrykk for dette genet i CRC. Videre sletting eller tap av
APC
genet i posisjon 5q21 fører til sin deregulert uttrykk i CRC [17]. Lignende mønstre av korrelasjon er også blitt observert i bryst og lunge kreft. Omtrent 12% av endringer i genekspresjon nivåer ble rapportert å være i overensstemmelse med kopiantall i brystkreft [18], og ca 78% gener viste en positiv korrelasjon mellom CNV og genekspresjon nivå i en lungekreft studie [19].
målet med denne studien var å få et innblikk i de molekylære mekanismene for CRC via analysene av CNV og genom-wide uttrykk profilering av en primærtumor og dens tilsvarende ikke-cancerous colonic epitel. Vi ønsket også å identifisere forholdet mellom CNV profil og transkriptom i CRC.
Materialer og metoder
Pasient rekruttering
Studien ble utført med godkjenning fra etisk komité av Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM 1.5.3.5/244/UMBI-004-2012), og skriftlig informert samtykke ble tatt fra hver av de 64 pasienter som gjennomgikk kirurgi. Ingen av pasientene hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Primærtumor og ikke-kreft vev (10 cm fra tumor) ble oppnådd umiddelbart etter operasjonen og snap-frosset i flytende nitrogen for lagring.
Genomisk DNA og RNA isolering
Frozen seksjonering ble utført på alle prøver ved å bruke et skjære tykkelse på 5 til 7 pm. Seksjonene ble montert på glassplater og farget med hematoxylin og eosin (H E). De fargede objektglass ble deretter evaluert av en histopathologist for å bekrefte tilstedeværelsen (mer enn 80% kreftceller) eller fravær av tumorceller og deres tilsvarende ikke-kreftceller. DNA ble isolert ved anvendelse av Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit ifølge produsentens protokoll. Total RNA ble ekstrahert fra 15 parede prøver ved å bruke Qiagen QIAmp Mini Kit Plus. Kvaliteten av det isolerte DNA og RNA ble kvantifisert ved anvendelse av et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), og bare prøver med en renhet på 1,8 2,1 (A260 /A280) ble valgt. Integriteten til de isolerte DNA-prøvene ble evaluert på 1,0% agarosegeler, og integriteten av det isolerte RNA ble bestemt ved anvendelse av en Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA). Prøver med en RNA Integrity Number (RIN) på 6,0 og over ble valgt for genekspresjon profilering.
CNV og genuttrykk profilering
Alle 64 parvise prøver ble analysert ved hjelp av Illumina HumanOmni1-Quad Perlene chip, som inneholder 1140419 enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) loci, basert på Illumina infinium II analyseprotokollen (Illumina, San Diego, CA, USA). Genekspresjon profilering ble utført på 15 parede prøver ved hjelp av Affymetrix Genechip menneskelige genet 1,0 ST array, som inneholder 36,079 utskrifter med 28,869 godt kommenterte gener (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). RNA ble dannet ved hjelp av Applaus WT-Amp ST System protokollen før hybridisering prosessen (Nugen Technologies Inc., San Carlos, CA, USA). Arrays var farget og skannet basert på Genechip Whole Avskrift (WT) Sense Target merkingsassay protokollen som ble skissert av Affymetrix.
Innlevering av microarray data til ArrayExpress databasen
Den rå og normalisert microarray data ble lastet inn i ArrayExpress database: https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress. Den ArrayExpress tiltredelse er E-MEXP-3980.
Statistisk analyse av CNV profilerings
De binære filer (.
idat
) som ble produsert av Illumina skanneprogramvare (Perlene Scan Array Reader) ble analysert ved hjelp av Illumina Genome Studio Genotyping Modul versjon 3.2.33 (Illumina, San Diego, CA, USA) for å få normalisert genotype data. Genotypen takst terskelen ble satt til ≥90%, og den endelige rapporten fra normalisert genotype data ble overført til et tredjepartsprogram, Partek Genomisk Suite versjon 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA), til bestemme CNV profilene.
parvise CNV analysen ble utført ved å sammenligne intensiteten av hver hybridisering signal fra en tumorprøve til at den er tilpasset ikke-kreft epitel. Den genomisk segmentering algoritme ble brukt til å oppdage CNV gevinster og tap. De følgende strenge parametre ble satt for å redusere eventuell falsk-positiv endring: hvert segment må inneholde minst 10 påfølgende filtrerte probe-sett, en p-verdi terskel på 0,001 i forhold til de nærliggende tilstøtende områder og et signal-til-støyterskelen 0,5. Cut-off verdi for gevinsten ble satt på over 2,3, mens tap ble satt til under 1,7. CNV ble kalt for gevinster eller tap som har oppstått i minst 10% (7 prøver) av den totale prøvene. En full oversikt over alle CNV gevinster og tap er inkludert i tabell S1. De kromosom plasseringene av kopitall gevinster og tap på de 22 autosomer er vist ved karyograms (figur 1).
Gevinst er vist i grønt og tap er vist i rødt. Lengden av den horisontale linje svarer til antallet prøver som er involvert ved den respektive cytoband. Mesteparten av gevinsten ble funnet på den lange arm av kromosom 20 og tapene ble hovedsakelig observert på den korte arm av kromosom 8.
Statistisk analyse av genuttrykk profilering
Affymetrix CEL filer ble importert til Partek Genomisk Suite 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA) for å utføre genuttrykk profilering analyse. Rå CEL filene ble behandlet for bakgrunnskorreksjon og quantile normalisering (median skalering) ved hjelp av robust multi-matrise gjennomsnitt (RMA) -metoden. Et hovedkomponentanalyse (PCA) plottet ble generert som kvalitetskontrolltrinn (figur 2A), og den satsvise virkning ble fjernet som en kilde til variasjon. En tre-veis ANOVA ble utført på alle prøver. Statistisk signifikant uttrykte gener ble identifisert ved hjelp av den blandede modellen variansanalyse med en falsk funnrate (Benjamini-Hochberg test) justert p verdien av ≤0.05 og fold-endring verdier på -2 til 2. hierarkisk clustering ble generert å visualisere mønstre av uttrykk i dataene (figur 2B). Gene ontologi berikelse analyse ble utført ved hjelp av DAVID (Database for kommentering, visualisering og integrasjon Discovery) bioinformatiske verktøy.
(A) PCA punktplott av CRC data. Hvert punkt representerer prøven. Poeng blir farget av gruppen status med blå representerer ikke-kreft epitel og rødt representerer svulstvev. (B) Hierarkisk clustering av mRNA profiler. Prøver er angitt langs den horisontale aksen og gruppert etter den fargelinjen mellom dendogram og kart varmen. Blå representerer ikke-kreft epitel og rødt representerer svulstvev. Totalt var det et klart skille mellom ikke-kreft epitel og svulstvev gruppe når undersøkt av både PCA (figur 2A) og hierarkisk clustering (figur 2B).
Integrering av kopiantall variasjon og genome- bredt uttrykk analyserer
data~~POS=TRUNC fra CNV og genom-wide uttrykk analyser ble analysert individuelt. For å identifisere de betydelige gener som viste CNV og genuttrykk endringer, overlappet vi de to datasettene som presenteres i Venn-diagrammet (figur 3A). Den kromosomale steder i de overlappende gener mellom de to datasettene er vist i en sirkulær kart (figur 3B).
(A) Venn-diagram som representerer de vanlige gener i CNV og genekspresjon datasett avslørte 56 overlappende gener. (B) Rundskriv kart som viser oversikt over CNVs og genuttrykk data. Kromosomer er vist i fargekodet på den ytterste ring. Den andre ringen viser fordelingen av genekspresjon profil. (Rød indikerer oppregulert gener og grønn indikerer nedregulert gener). Den indre ring representerer CN endringer (rød betegner gevinst i CN og grønt betegner tap i CN). Den innerste ringen viser fordelingen av de to overlappende datasettene.
Sub-analyse av data fra kopiantall variasjon og genom-wide uttrykk microarray for de 15 sammenkoblede tilfeller
analysert data som ble hentet fra kopiantall og genom-wide uttrykk profilering av de 15 parvise prøver ved hjelp Partek Genomisk Suite 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Den genomiske segmenteringsalgoritmen ble påført med parametrene som ble nevnt i kopiantallet analyse delen. Den resulterende arket inneholdt individuelle markører som viste de avvikende nivåer av DNA i hver tumor i forhold til dens normale sammenkoblet. Expression data ble normalisert til grunnlinjen og forholdene var log2-transformert før analyse. Begge datasett ble korrelert ved hjelp av Pearsons lineær korrelasjon metode og vi generert et spredningsdiagram for å se resultatet (figur 4A og 4B).
Scatter plott av genuttrykk (y-aksen) korrelere å kopiere nummer (x-aksen ) med differensial uttrykk CN endring i CRC for
ARGLU1 plakater (figur 4A) og
UGGT2 plakater (figur 4B) gener. Hver prikk representerer en prøve.
Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA)
For å validere CNV profilering resultater, valgte vi kromosom 20 for MLPA analysen bruker SALSA MLPA P157 20Q probe bland i henhold til produsentens protokoll (MRC-Holland, Amsterdam og Nederland). Sonden mix inneholder 34 prober for 26 ulike gener som er plassert på 20Q. Fragment analyse av PCR-produktene ble utført ved anvendelse av Genescan-500 LIZ størrelse standard på den Applied Biosystems 3130 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fluorescens data ble samlet inn under fragment separasjon og importeres til Coffalyser.Net programvare (MRC-Holland, Amsterdam og Nederland) for analyse.
Resultater
Demografiske data
av de 64 pasienter, 39 (60,94%) var kvinner og 25 (39.06%) var menn (tabell 1). De fleste var malayer (48,44%), etterfulgt av kinesisk (46,88%) og indere (4,69%). Basert på Dukes «klassifisering, 33 pasienter (51,56%) var av Dukes» B, 27 pasienter (42,19%) var av Dukes «C og 4 pasienter (6,25%) var av Dukes» A. Gjennomsnittsalderen var 56 ± 13,35 år gammel.
Kopier nummer gevinster ble ofte funnet i q arm av kromosom 20
av de 8722 genomiske segmentene i alle prøvene, vi snevret ned vår analyse til 2212 CNV regioner som tilsvarte autosomer som viste presiseringer (Tabell S1). De CNVs ble spredt over kromosom 1-22 med den høyeste forsterkning funnet i kromosom 20, som hadde 388 segmenter som representerte 17,5% av alle gevinster. Den nest høyeste antallet gevinster ble dokumentert på kromosom 7, med 369 genomiske segmenter, etterfulgt av kromosom 8, med 338 genomiske segmenter. Den lengste lengde for de CNV gevinst segmentene var mellom 8q22.1 og 8q22.2 tilsvarer 4.070.488 bp. Totalt 1,638 gener ble amplifisert i alle prøver og 765 av disse var unik eller ikke-redundante gener. Cytoband 20q12 hadde den høyeste frekvensen av gevinster som involverer minst 45,31% av tumorprøver. Åtte gener ble identifisert på denne locus og tre av dem, nemlig
PTPRT
,
CHD6 Hotell og
EMILIN3
, har tidligere blitt beskrevet i tykk- og endetarmskreft. Figur 1 viser fordelingen av disse genene på kromosom 20, med gevinster som vises i grønt. Detaljer om de 10 viktige gener i henhold til RefSeq databasen er gitt i tabell 2.
Kopier nummer tapene ble i hovedsak funnet i p arm av kromosom 8
En sletting eller tap av kopitallverdi mindre enn 1,7 ble observert i hele kromosom 1 til 22 autosomer, med de fleste oppdaget på kromosom 8, som hadde 225 CNV påvirket segmenter. Den spesifikke region for det tap ble observert i posisjon 8p23.3 med 17,9% forekomst i alle tumorprøver. Den nest høyeste frekvens for tap ble påvist på kromosom 17, med 213 genomiske segmenter, etterfulgt av kromosom 19, med 184 genomiske segmenter. Den lengste tap fra et genomisk segment var ved 8p23.1 til 8p22, som besto av 3093282 bp. Vi identifiserte bare 14 unike og ikke-redundante gener (Tabell 3). Analyse av de individuelle gener i kromosom 8 viste at bare 5 av genene ble tidligere rapportert å være relatert til CRC; disse genene var
CSMD1
,
DLC1
,
TUSC3
,
SGCZ Hotell og
LONRF1
. Fordelingen av tapene, som vises i rødt, kan observeres i karyotype diagram som vist i Figur 1.
analyse av genuttrykk profilering
Analyse viste signifikante forskjeller i genuttrykk mellom det primære tumor og ikke-cancerøse epiteliale prøver. Klassifisering av PCA viste et klart skille mellom to karakteristiske grupper i henhold til vevstype (figur 2A). Totalt 1408 genene ble uttrykt forskjellig med minst to ganger med statistisk signifikans (p 0,05). Imidlertid er et enkelt gen representert ved flere probe sett kalt «søsken sonder «i Affymetrix Genechip. Derfor ble alle overflødige sondesett filtrert, noe som forlot 1191 unike gener for videre analyse. Av disse ble 584 gener funnet å være oppregulert, mens en annen 607 gener ble funnet å være nedregulert. Mesteparten av de opp-regulerte gener ble funnet i kromosomene 7 (n = 48, 8,22%), 2 (n = 44, 7,53%) og 12 (n = 42, 7,19%). Ned-regulerte gener ble i hovedsak plassert på kromosomer 1 (n = 73, 12%), 2 (n = 44, 7,25%), 3 og 4 (n = 43, 7,08%). Blant de oppregulert gener var
MYC
,
CD44
,
ABC22
,
TIMP1
, og
BIRC5
, mens nedregulert gener inkludert
FAS
,
KLF4
,
UGTIA1 Hotell og
CA2
. En fullstendig liste over de forskjellig uttrykte gener og deres tilhørende brette endringer i uttrykk og p-verdiene er gitt i tabell S2. Hierarkisk clustering ble generert og visualisert via et varmekart, der to karakteristiske uttrykk mønstre kan observeres (figur 2B). Den funksjonelle karakterisering av de vesentlige gener ble utført ved bruk av GO-analyse, og de ble funnet å være fordelt gjennom de fem klasser, som omfattet cellesyklus, celledelingen, kromosom segregering, nukleosid-binding og ATP-binding (p 0,05).
Effekt av CNV på uttrykk for kolorektal kreft-relaterte gener
Integrering av de to profilerings datasett viste 56 overlappende gener (figur 3A og 3B), og en fullstendig liste over disse overlappende gener er presentert i Tabell S3. Det ble observert totalt 1,135 gener med bare genuttrykk endringer og 723 gener med CNV endringer, men ingen endringer i transkripsjonsnivåer. Integrering av CNV og genuttrykk analyser viste en positiv sammenheng i 48 gener (85,7%) og en negativ sammenheng i de resterende 8 gener (14,3%) (tabell 4).
For ytterligere å forstå videre biologiske funksjonen til disse genene, ble de 56 genene utsatt for funksjonell annotering og klassifisering analyse ved hjelp DAVID v6.7. Vi har funnet genene for å være relatert til biologiske prosesser og cellulære komponenter.
Disse genene ble videre kartlagt til KEGG sti-databasen for å bestemme vekselvirkningene til kandidat onkogener eller tumorsuppressorgener som ble identifisert ved CNV og uttrykket array. Analysen viste at cellesyklus var den mest betydelig beriket sti og
CDC25B
,
PCNA Hotell og
p107 /RBL1
var nøkkelen, involvert gener (figur 5).
Cell syklus ble funnet å være den mest betydningsfulle anrikede reaksjonsveien (p 0,05). Gener som er involvert (
CDC25B, PCNA og p107 /RBL1
) vist i rød farge boksen indikerer genene å ha gevinst i CN og økt nivå av uttrykk.
Korrelasjonen av CNV med genet uttrykk for kolorektal kreft-relaterte gener på en undergruppe av 15 parvise prøver
for å bestemme forholdet mellom DNA kopiantall og genuttrykk, vi anvendt Pearsons lineær korrelasjon modell (figur 4A 4B). Korrelasjonsverdiene ble funnet mellom -0,85 til 0,89. Ved hjelp av en cut-off av p 0,05, 2159 gener viste signifikante sammenhenger mellom kopiantall og genuttrykk. Totalt 914 transkripsjoner fra 616 gener viste god korrelasjon (r 0,6) mellom kopiantall og genuttrykk. De fem beste-korrelerte gener var
ARGLU1
,
UGGT2
,
CES2
,
FUT10 Hotell og
PAOX
. En fullstendig liste over de korrelerte gener med sine Pearsons korrelasjon og p-verdiene, kan sees i tabell S4.
Validering av CNV profilering ved hjelp av MLPA
Vi utførte MLPA analysen og målrettet 26 gener i 150 prøver (50 normale vev og 100 svulster) for å validere CNV profilering data. Vi valgte prober som dekket q arm av kromosom 20, og resultatene ble betraktet som akseptabel dersom styre toppen falt innenfor området fra 0,8 til 1,2. En delesjon ble scoret hvis den midlere dose av test til de interne kontroll toppene var mindre enn 0,7, og duplisering ble scoret hvis den gjennomsnittlige dosen var 1,3 eller større. En normal referanseprøve viste ingen kopi antall endringer i en hvilken som helst av genene, og MLPA analyse viste at kopi-antall forsterknings ble påvist i alle tjueseks testet gener. Tabell 5 oppsummerer MLPA analyse med gjennomsnittsverdiene av hvert gen.
Diskusjoner
Vi utførte en integrert analyse ved hjelp av flere datasett i kolorektal vev for å identifisere differensielt uttrykte gener med endring i genomiske segmenter. Vi analyserte CNVs og genuttrykk profilering i 64 paret og 15 sammenkoblede CRC vev hhv. Bruken av tilstøtende ikke-kreft vev fra samme individ redusert variantene som ble forårsaket av inter-individuell heterogenitet.
Denne studien identifisert en rekke knutepunkter genomiske gevinster og tap i CRC, som viste en viss overens med resultatene fra tidligere undersøkelser [20], [21], [22]. Individuell analyse av CNV datasett avdekket betydelige gevinster i kromosomet 20Q som også var svært konsistente med tidligere studier [23], [24]. Lignende gevinster hadde også blitt observert i brystkreft og primærmagekreft [25]. Cytoband 20q12 viste den høyeste frekvensen av gevinster som strakte 39239931-41684451 bp med involvering av åtte gener, inkludert
PTPRT
,
CHD6
,
EMILIN3
,
LPIN3
,
PLCG1
,
top1
,
ZHX3 Hotell og
MAFB
. Av de åtte gener,
Top1
,
PLCG1 Hotell og
PTPRT
var relatert til CRC.
Topoisomerase 1 (
Top1
) er et onkogen som katalyserer avvikling av DNA og gir enkelt-tråd-molekyler, som er nødvendig i en rekke biologiske prosesser slik som DNA-replikasjon, transkripsjon og DNA-reparasjon [26]. En studie av
Top1
bruker matrise CGH funnet gevinster i sin kopiantall i CRC prøvene [9]. Et økt kopiantall av
Top1
ble også påvist i trinn III i CRC pasienter med et gjennomsnitt av fire genkopier for hver celle ved hjelp av et fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) metoden [27], [28].
Det andre genet som var relatert til CRC identifisert i denne studien var fosfolipase C gamma 1 (
PLCG1
), som er et signalmolekyl og er en nabo gen av
top1
.
PLCG1
blir aktivert som respons på vekstfaktor stimulering og er involvert i regulering av en rekke cellefunksjoner slik som cellemigrering, invasjon og metastase [29], [30], [31].
Protein tyrosin fosfatase reseptor-T (
PTPRT
) ligger innenfor den forsterkede regionen 20q12 mellom 39344635-41684451 bp. Det er et tumorsuppressorgen, og har vist seg å spille en integrert rolle i celle-adhesjon og intracellulær signalisering [32]. Gevinst av kopiantall involverer
PTPRT
genet har blitt identifisert i en tidligere studie på eggstokkene klar cellekreft ved hjelp av matrise CGH [33]. Gevinsten i kopiantall i dette genet kan være som et resultat av «passasjer genet» effekt fordi vi ikke kunne oppdage eventuelle endringer i genuttrykk.
Andre vesentlig forsterket cytobands i q arm av kromosom 20 kodet veletablert onkogener som var knyttet til CRC, og disse inkludert 20q11.21 (
BCL2L1
), 20q13.2-20q13.31 (
AURKA
), 20q11.23 (
SRC
CTNNBL1
), 20q11.21-20q11.22 (
DNMT3B
) og 20q11.22 (
DYNLRB1
). Disse funnene tyder viktig involvering av flere kandidat gener innenfor den lange arm av kromosom 20 i kreftutvikling og progresjon. Den MLPA synes å være en pålitelig og effektiv metode for å evaluere DNA-kopi nummeret endres fordi flertallet av disse testet gener avslørt samsvar med microarray resultater.
Kopier nummer tapene ble i hovedsak funnet på p arm av kromosom 8. høyeste tapet ble funnet på cytoband 8p23.2 4008230-4027339 bp. Blant de genene som ligger i denne regionen er CUB og Sushi flere domener 1 genet (
CSMD1
), som er en tumor suppressor genet som koder for flere domene utfylle regulatoriske og heft protein. Focal kopiantall tap av
CSMD1
genet har blitt observert i CRC [34], brystkreft [35] og magekreft, [36], og redusert nivå av
CSMD1
ekspresjon ble rapportert å bli betydelig forbundet med høy tumor klasse og redusert total overlevelse i en brystkreft studie [37]. Et annet område som var kjent for å vise kopiantall tap som ble identifisert i denne studien ble cytoband 8p23.1-p22, som inkluderte en region som dekket 12601480-15694761 bp. Et gen som ligger innenfor denne regionen er slettet i Liver Cancer 1 (
DLC1
), som ble rapportert å være en tumor suppressor gen og har vist seg å gjennomgå kopiantall tap i flere kreftformer, som hepatocellulær karsinom og brystkreft [38], [39].
Vi gjorde en sub-analyse av 15 parvise prøver av CRC for å vurdere forholdet mellom kopitall endringer og genekspresjon. Gener involvert i CRC, for eksempel
MYC plakater (v-myc avian myelocytomatosis viral onkogen homolog) [40]
CCNB1 plakater (cyclin B1) [41] og
PLK1 product: ( polo-lignende kinase 1) [42], var oppregulert og concordantly forsterkes i kopiantall i vår studie. Syv gener ble funnet å være nedregulert med tap i kopiantall, men bare to gener,
MUC17 plakater (mucin 7) [43] og
CES plakater (karboksylesterase 2) [44] har vært vist seg å være relatert til CRC.
Integrert analyse ved hjelp av et Venn diagram viste at 85,7% av genene hadde en positiv sammenheng. Når kartlagt til KEGG vei, ble cellesyklus identifisert som den mest betydelig anriket pathway (p 0,05). Cellesyklus er en viktig regulator av celleproliferasjon, og vekst og celledelingen etter DNA-skade. Cellesyklusen veien er hovedsakelig drevet av cyclin-avhengig kinase (CDK) familie og deres regulatoriske subenheter, de Cykliner. Cellecyklusen har fire faser og de to store sjekkpunkter på G1-S og G2-M-overganger for å opprettholde den riktige rekkefølge av hendelser [45]. Tapet av cellesyklus sjekkpunkt kontroll fremmer genetisk ustabilitet, noe som fører til ukontrollert celledeling og kan fremme kreftutvikling [46].
Celledeling syklus 25B (
CDC25B
) er et medlem av celledeling syklus (CDC) fosfatase familien som fungerer som aktivatorer av CDK og cyklin-komplekser for å regulere progresjonen av cellesyklusen [47].
CDC25B
er ansvarlig for den første defosforylering og aktivering av CDK, og dermed initiere sekvens av hendelser som fører til inntreden i mitose [48], [49]. Over-ekspresjon av
CDC25B
har blitt observert i 43% av pasientene og CRC er korrelert med dårlig prognose [50]. Økt
er tilstrekkelig til å svekke DNA skade sjekkpunkter, noe som i sin tur øker spontan mutagenese og forstyrrer trer i mitose [51] CDC25B
nivå, [52], [53].
prolifererende cell nuclear antigen (
PCNA
) ble rapportert å være avgjørende for DNA replikasjon, DNA-reparasjon og cellesyklusregulering [54]. Retinoblastom-lignende en (
p107 /RBL1
) er et medlem av retinoblastomagenet familien (RB), og genene i denne familien har blitt identifisert som kreftdempere. RBL1 og andre RB-proteiner samvirker for å regulere cellesyklusprogresjon gjennom G1-fasen av cellesyklusen [55]. Imidlertid er mekanismen av PCNA og RBL1 engasjement i cellesyklusen sti CRC fremdeles uklart og krever videre undersøkelser.
Vi har også funnet gener med negative assosiasjoner mellom kopi nummer og genuttrykk nivåer. Genene har
BCAS1
,
EDN3
,
FABP4
,
MATN2
,
SDCBP2
,
SPTLC3
TRPA1 Hotell og
WFDC2
. Dette paradokset i en negativ sammenheng mellom kopiantall status og genekspresjon har også blitt observert i en tidligere studie på CRC [56] og kan tilskrives flere mekanismer som er ansvarlig for normal og unormal kontroll av genekspresjon, inkludert de som er relatert til mutasjon, arrangøren metylering og miRNA uttrykk [57]. For å forstå dette fenomenet, en tilnærming ved hjelp av dyp sekvenseringsteknologi vil mest sannsynlig sannsynligvis gi et svar på disse uventede funn.
I konklusjonen, ved å integrere de datasett fra to forskjellige profilering studier, vi får identifisert 56 overlappende gener med endringer i kopiantall og genuttrykk. Cellesyklus ble identifisert som nøkkelen signalveien fra denne integrerte analysen. Men fremtidige studier er nødvendig for å fastslå effekten av disse genene på utfallet av sykdommen.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1. .
Fullstendig informasjon om kopiantall variasjon profil av 64 pasienter med kolorektal kreft
doi: 10,1371 /journal.pone.0092553.s001 plakater (XLSX)
Tabell S2. .
Fullstendig informasjon om genuttrykk profilen til 15 pasienter med kolorektal kreft
doi: 10,1371 /journal.pone.0092553.s002 plakater (XLSX)
tabell S3.
