Abstract
I denne artikkelen har vi utviklet en kvantitativ modell av biologiske membraner ved deponering av planar lipid membranene på faste substrater (kalt støttede membraner), og immobilisert biotinylerte oligomerer av hyaluronsyre (oligo-HA, 6-8 disakkaridenheter i lengde) til membranoverflaten via neutravidin kryssbindere. Ved å styre den selvbygging av biotinylert lipid ankere, kan den midlere avstand mellom de oligo-HA-molekyler på membranen kontrolleres for å nm nøyaktighet. Adhesjonen og motilitet av pankreas adenokarsinom-celler som uttrykker forskjellige spleisevarianter av HA-bindende celleoverflate-reseptoren CD44 på disse flater ble undersøkt kvantitativt. Kombinasjonen av etikett-fri, time-lapse avbildning av levende celler og statistisk analyse tyder på at det statiske morfologi (global form og cytoskjelett remodellering) av celler, deres stokastiske morfologiske dynamikk, og sannsynligheten for å rettet bevegelse reflektere den metastatiske adferd av kreft celler
Citation:. Kaindl T, Rieger H, Kaschel LM, Engel U, Schmaus A, Sleeman J et al. (2012) rom-tid-mønstre for kreft i bukspyttkjertelen celler som uttrykker CD44-isoformer på Støttede Membraner Viser hyaluronsyre Oligomers Arrays. PLoS ONE 7 (8): e42991. doi: 10,1371 /journal.pone.0042991
Redaktør: David Holowka, Cornell University, USA
mottatt: 7 mai 2012; Godkjent: 17 juli 2012; Publisert: 14. august 2012 |
Copyright: © Kaindl et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Helmholtz Association innenfor rammen av «BioInterface» -programmet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de senere årene har CD44 dukket opp som en viktig mediator av celle-matriks-interaksjoner som integrerer signal aktiviteten til vekstfaktorreseptorer gjennom dens ko-reseptor-funksjon [1]. Ekspresjon av CD44-genet gir opphav til en familie av transmembrane glykoproteiner hvis molekylvekt er svært heterogen (MW 80-200 kDa) på grunn av varierende N- og O-bundet glykosylering og alternativ spleising [2], [3], [4] . Spesielt innsetting av opp til 10 variant exons i løpet av alternativ spleising av det CD44-transkript innfører omfattende variabilitet i det ekstracellulære membran proksimale region av proteinet [5], [6], [7]. Disse variant ekson-holdige isoformer er betegnet CD44v, i motsetning til CD44s som ikke inneholder disse variant exons.
interaksjonen av CD44 med den ekstracellulære matriks glykosaminoglykanet hyaluronan (HA) er den mest intensivt studerte interaksjon mellom CD44 protein [8]. Dette samspillet er regulert på en rekke nivåer, inkludert glykosylering [4] og den gruppering av CD44 som er fremmet av inkluderingen av varianten ekson-kodede sekvensene [9]. HA blir syntetisert som en høymolekylær polymer som består av alternerende subenheter av N-acetylglukosamin og glukuronsyre [10]. I løpet av tumorvekst og inflammasjon, kan nedbrytning av HA bli forbedret, noe som resulterer i akkumulering av små HA oligosakkarider som utøver biologisk aktivitet ikke oppvises av høymolekylært HA [11]. To HA bindingsmotiv i den ekstracellulære del av CD44 protein medierer dens interaksjon med HA [12]. CD44 bindes til minst en HA heksasakkarid [13], og signalering via CD44 kan reguleres ved størrelsen av HA [1].
HA og CD44 har begge vært implisert i regulering av tumorvekst og metastase [4], [14], [15]. Akkumulering av HA er assosiert med dårlig prognose, og pasienten har blitt foreslått for å øke tumor proliferasjon, invasjon og angiogenese bl.a. [8]. I tillegg, ekspresjon av forskjellige isoformer av CD44 har vært knyttet til dårlig prognose i en rekke forskjellige tumortyper [14], og studier i dyremodeller har gitt bevis for en funksjonell rolle i CD44-isoformer i metastase [16]. Viktigere, har samspillet mellom CD44 og HA vært forbundet med tumorvekst og metastasering [17], [18]. Men motstridende data finnes også. I enkelte sammenhenger opphopning av HA avtar tumorgenisitet [19], [20], [21], [22], mens ekspresjonen av hyaluronidases, enzymer som bryter ned HA, kan korrelere med tumorprogresjon [23]. Tilsvarende uttrykk for noen isoformer av CD44 i spesielle typer kreft kan korrelere med god prognose [15], og undertrykke metastase i dyremodeller [24]. Sammen disse observasjonene tyder på at en bedre forståelse av hvordan CD44 samhandler med HA er nødvendig for å forklare relevansen av disse komplekse interaksjoner til tumorprogresjon og metastasering, som igjen vil identifisere nye ruter for terapeutisk intervensjon.
rotte bukspyttkjertelen carcinoma modell BSp73 [25] gir en nyttig modell for å analysere både de metastase fremme funksjoner av CD44, så vel som interaksjonen mellom CD44 og HA. Den BSp73AS cellelinje (kalt 1AS i teksten) er svakt metastatisk, uttrykker CD44s men bare veldig lave endogene nivåer av CD44 varianter, og binder seg dårlig til immobilisert HA [26]. Transfeksjon av disse cellene med CD44v4-v7, en spleisevariant som finnes i svært metastatiske celler, produserte cellelinjen ASpSV14 som er meget metastatisk i rottemodeller [16]. Uttrykk for den CD44v4-v7 protein fremmer også bindingen av ASpSV14 celler til HA gjennom regulert clustering av CD44v4-v7 protein [9]. En R44L punktmutasjon i den N-terminale HA-bindende motiv av CD44v4-v7-proteinet gjør proteinet i stand til å binde til HA, mens en K162A, R166A dobbeltpunktmutasjon i den andre HA-bindende motiv av CD44v4-V7 resulterer i en redusert HA bindingsevne sammenlignet med villtype-CD44v4-v7-protein [26]. Følgelig trenger 1AS celler ectopically uttrykker R44L CD44v4-v7 protein (AS-R44 celler) ikke binder HA, mens 1AS celler ectopically uttrykker K162A, R166A CD44v4-v7 protein (AS-K162R166 celler) viser redusert binding til HA forhold til ASpSV14 celler [26].
Ved hjelp av disse fire cellelinjer, har vi designet eksperimenter for å undersøke samspillet mellom CD44 med nettopp romlig bestilt HA av definert lengde (6-8 disakkaridenheter). Nærmere bestemt ble adhesjon og motilitet av rotte kreft i bukspyttkjertelen celler som uttrykker forskjellige CD44-isoformer undersøkt på definerte side tettheten av HA. I stedet for ikke-spesifikk fysisorpsjon eller kovalent poding av oligo-HA-molekyler på plastsubstrater, ankret vi biotinylerte oligo-HA-molekyler via neutravidin kryssbindere til overflaten av plane lipidmembraner (såkalte «støttede membraner» [27], [ ,,,0],28]) som innlemmet biotinylerte lipid ankere. Dette tillot den ikke-spesifikk adhesjon av celler ved bruk av langtrekkende Van der Waals tiltrekning til å bli minimalisert, og den gjennomsnittlige avstand mellom forankret HA-molekyler til å styres nøyaktig innenfor nm nøyaktighet [29]. Ved å anvende en kombinasjon av time-lapse avbildning av cellene med etikett-fri mikro interferometri (RICM) [30], [31] og statistisk analyse [32], kunne vi kvantitativt vurdere styrken av celleadhesjon, stokastiske dynamikken i cellen morfologi, og utholdenhet og hastighet cellemotilitet.
Materialer og metoder
Material
1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DOPC) og en , 2-dioleoyl-sn-glysero-fosfo-etanolamin-3-N- (cap biotinyl) (biotin-DOPE) ble anskaffet fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA), og deglykosylert neutravidin fra Invitrogen (Karlsruhe, Tyskland) . Den vidt røde fluorescerende DNA-fargestoff DRAQ5 fra biostatus begrenset (Leicestershire, UK) ble anvendt for å farge cellekjerner, og Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) ble benyttet for visualisering av aktin cytoskjelettet. Vedheft ble utført i bunnløs plast fluidic kanaler (μ-lysbilde I) fra ibidi (München, Tyskland) forseglet med mikroskopisk klasse 25 × 75 mm
2 glassplater fra Menzel (Braunschweig, Tyskland). Alle andre kjemikalier av P.A. kvalitet ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Neu-Ulm, Tyskland), hvis ikke annet er spesifisert. I denne studien ble de-ionisert ultrarent vann (Genpure, TKA Niederelbern, Tyskland) som brukes for utarbeidelse av alle bufferløsninger.
Micro-interferometriteknikker bilder av 1AS celler på støttede membraner viser (A) poly-HA og (B) oligo-HA til en gjennomsnittlig avstand på
d
~ 5,5 nm på
t
= 2 timer. Skala: 8 mikrometer
brøkdel av 1AS celler festet til de angitte støttes membraner plottet som funksjon av tiden.. De tre membraner studerte var ren DOPC membraner (svart linje), og membraner viser oligo-HA på
d
~ 11 nm (grønn linje) og
d
~ 5,5 nm (blå linje).
HA Prøvepreparering
Hyaluronsyre polymer (poly-HA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Neu-Ulm, Tyskland). Hyaluronsyre oligomer (oligo-HA, GE Healthcare, Heidelberg, Tyskland) ble fremstilt ved enzymatisk nedbrytning med storfe testis hyaluronidase [33] og fraksjonering med en ÄKTA renser (GE Healthcare, Heidelberg, Tyskland) for å oppnå oligomerer av 6-8 disakkaridenheter i lengden. For immobilisering til membranoverflaten, både poly- og oligo-HAS ble modifisert ved kobling med (+) -. Biotin-hydrazid (Sigma-Aldrich, Neu-Ulm, Tyskland) [34], [35]
HA Forbehandling
Før liming, glass underlag ble renset ved hjelp av en modifisert RCA-protokollen [36]. Nærmere bestemt ble substratene sonikert i 5 minutter i aceton, etanol, metanol og vann, deretter nedsenket i en oppløsning av H
2o
2 (30%) /NH
4OH (30%) /H
2O (01:01: 5 volumdeler) og ultralydbehandlet i 5 min ved romtemperatur før dyppe dem i ytterligere 30 minutter ved 60 ° C. Etterpå ble de intensivt skyllet med vann, tørket ved 70 ° C, og som er lagret i et vakuumkammer. Lipidblandinger med forskjellige molforhold av biotin-DOPE ble først utsatt for en nitrogenstrøm, og deretter holdt i et vakuumkammer ved 25 ° C i 12 timer. Etter suspendering av de tørre Lipidfilmene i de-ionisert vann, små unilamellære vesikler (SUV) ble fremstilt ved sonikering med en spiss sonikator (Misonix, New York, USA) i 30 minutter ved 1,0 W. støttede membraner ble fremstilt ved avsetning av SUV-suspensjoner på rengjort underlag. Etter 20 minutters inkubering, ble kamrene intensivt skylt med deionisert vann for å fjerne de gjenværende blærer. Den gjennomsnittlige avstanden mellom lipid ankere (biotin-DOPE) som derfor avstanden mellom HA molekyler kan estimeres fra molar brøkdel av biotin-DOPE χ
b-DOPE og området per lipider (
En
lipid ~ 60 Å
2 [37]), som. I det neste trinn, ble membranen inkubert i neutravidin oppløsning (1 pg /ml, i de-ionisert vann) i 20 minutter. Etter intensiv skylling, ble en vandig oppløsning av biotinylert HA (0,4 mg /ml) injisert inn i hvert kammer av de objektglass og inkubert i 20 min. Til slutt ble prøvene vasket med forvarmet cellekulturmedium og holdt ved 37 ° C før de vedheft eksperimenter.
RICM bilder (til venstre) og confocal fluorescens bilder (midten og til høyre) ( A) 1AS celler (B) AS-K162R166 celler (C) ASpSV14 celler, og (D) AS-R44 celler inkubert på støttede membraner viser oligo-HA på
d
~ 5,5 nm i 4 timer. Etter fiksering, DNA og aktin ble farget med DAPI og Alexa 488 phalloidin.
celle adhesjon Eksperimenter
1AS, ASpSV14, AS-R44 og AS-K162R166 celler ble dyrket som tidligere beskrevet [26], [38]. Cellene ble høstet ved trypsination og deretter resuspendert i forvarmet RPMI 1640 ved en densitet på 1,75 x 10
7 celler /ml. En 0,2 ml porsjon av cellesuspensjonen ble injisert i hvert kammer av de glassplater, og holdt ved 37 ° C og 5% CO
2. Non-invasiv levende celle bildebehandling ble utført ved hjelp av refleksjon interferens kontrast mikroskopi (RICM) på en Axiovert 200 invertert mikroskop (Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland) er utstyrt med en PlanNeofluar 63 × /1.25 Antiflex olje-nedsenking objektiv. For å beregne arealet av cellemembran kontakt, ble bilder med en Orca ER CCD-kamera (Hamamatsu Photonics, Ching, Tyskland). Etter subtraksjon av bakgrunnen, ble bildene binærisert for å bestemme kanten av klebesonen. Den fraksjon av overholdes celler ble bestemt ved å normalisere celler observert ved RICM (holdes celler) med totalt antall celler i den tilsvarende fase kontrast. Celler for tidsavhengig datainnsamling ble også inkubert i RPMI 1640-celle-medium ved 37 ° C og 5% CO
2. Bilder ble tatt på en fast stilling med tidsintervaller på 10 min og 15 min i 20 timer. Etter ekstraksjon av celle kote fra hvert binært bilde, ble massesenteret ekstrahert og anvendt for dokumentasjon av celle forskyvning og kote analyse. Begge verdier, vedheft område
A Hotell og celle kote lengde
L
, ble brukt for beregning av den dimensjons sirkularitet. Den elongeringsfaktor ble ytterligere utledes av forholdet mellom vinkelrett mindre til store akser, og således også resulterer i en dimensjonsløs område mellom 1 og 0.
(A) En snap skudd av en ASpSV14 celle på en oligo-HA -functionalized membran (
d
~ 5,5 nm,
t
= 9 h) fanget av RICM. Den perifere kanten av cellen ble bestemt ved kontrasten i pikselintensiteten. (B) Amplituden av svingningene amplitude plottet som en funksjon av
θ
. er den gjennomsnittlige radial avstanden over
θ
= 0-360 °. (C) Amplituden kartet som en funksjon av vinkel
θ
over tid (
t
= 140-1000 min). (D) autokorrelasjonen tilsvarende amplitude kartet i panelet (C).
Resultater
Klebe 1AS til poly- og Oligo-HA tjoret til Støttede Membraner
å sammenligne HA bindende egenskaper ved 1AS celler og deres derivater, må vi først undersøkte muligheten for 1AS å følge HA tethered til støttede membraner. Figur 1 viser representative RICM bilder av 1AS celler bindende i 2 timer til poly-HA og oligo-HA bundet til en gjennomsnittlig interavstand fra
d
~ 5,5 nm. I denne studien var den gjennomsnittlige inter avstand
d
kan styres av den molare konsentrasjon av fritt diffusiv forankrings molekylene i den understøttede membran. Som presentert i figur 1, 1AS celler viste en markert spredning på begge flater. De gjennomsnittlige forventede områdene følges celler på membraner funksjon med poly-HA og oligo-HA beregnet fra Figur 2A og figur 2B var sammenlignbare,
En
poly = 480 nm
2 og
En
oligo = 560 nm
2, henholdsvis. I kontrolleksperimenter, 1AS celler viste nesten ingen tegn til adhesjon til rene DOPC membraner (figur 1C), noe som bekrefter spesifisiteten av adhesjon til HA flater.
Representative amplitude-kart (A) 1AS og (B) ASpSV14 celler plottet som funksjon av
θ
registrert under den tidlige fasen av celle adhesjon (
t
= 0-200 min). De tilsvarende autokorrelasjonsfunksjoner for 1AS og ASpSV14 er presentert i panel (C) og (D), respektivt.
Analysen av klebeområdet, elongeringsfaktor og sirkularitet beregnet fra ni-celler (tabell 1) tyder på at 1AS celler spredt isotrop på både poly-HA og oligo-HA overflater. Faktisk, områder med tett adhesjon identifiseres ved lave bildeelementintensitetene (typisk separasjonsavstanden under 10 nm, [39]) ble funnet i nærheten av cellen periferien. Vi konkluderer derfor med at oligo-HA samt poly-HA kan virke som spesifikke ligander for 1AS celler. Som vi observert noen forskjell i binding av 1AS celler til poly-HA og oligo-HA overflater, i de påfølgende forsøkene vi brukt utelukkende oligo-HA med en smal størrelsesfordeling (6-8 disaccharide gjentatte enheter).
(A) Amplitude kartet representant 1AS og (B) ASpSV14 celler plottet som funksjon av
θ
registrert etter etablering av stabil adhesjon (
t
= 600-1000 min). Den tilsvarende autokorrelasjon av 1AS og ASpSV14 celler er presentert i panel (C) og (D), respektivt. Tre RICM RAW-bilder vises for (E) 1AS og (F) ASpSV14 celler på ulike tidspunkter. Skala barer:.. 10 mikrometer
Grad av cellen deformasjon av et enkelt, representant 1AS celle (svart linje) og en ASpSV14 celle (blå linje) i forhold til retningen av cellemotilitet
Neste vi undersøkt hvordan avstanden mellom forankrede HA oligosakkarider påvirker binding av 1AS celler til disse flatene. Andelen av 1AS celler som fester seg til den oligo-HA støttede membraner for forskjellige gjennomsnittsavstander mellom oligo-HA-molekyler ble evaluert som en funksjon av tid. Påfallende, bare en liten endring i
d
fra 5,5 nm til 11 nm resulterte i en signifikant forskjell i både kinetikk og effektivitet av celleadhesjon (figur 2). At
d
~ 11 nm, 1AS celler som trengs 90-120 minutter å nå metningsnivåer av adhesjon (40-50%), mens på
d
~ 5,5 nm for de samme cellene bare 30-60 minutter var nødvendig for å nå mye høyere metningsnivå adhesjon (mer enn 80%). Disse resultater antyder at spesifikk adhesjon av celler til 1AS oligo-HA er svært følsom for den romlige presentasjon av oligo-HA-molekyler på støttede membraner på nivå med nm nøyaktighet.
Neste vi undersøkt evnen til celler 1AS uttrykke forskjellige CD44-isoformer å binde seg til oligo-HA tethered til støttede membraner på
d
~ 5,5 nm i 4 timer. Under disse forholdene, ble RICM og confocal fluorescens bilder innhentet for 1AS celler, AS-K162R166 celler, ASpsV14 celler, og AS-R44 celler (figur 3). Parallelt gjennomførte vi kontrolleksperimenter for alle fire celletyper for å undersøke deres adhesjon til rene DOPC membraner, og bekreftet at uspesifikke vedheft er ubetydelig liten ( 10%) for alle celletyper (data ikke vist). Før bildebehandling, ble cellene fast, og aktin og DNA ble farget med Alexa 488 phalloidin og DRAQ5 hhv. For hver cellelinje, ble mellom 30 og 90 celler analysert, og et minimum på fem celler ble selektert for konfokal mikroskopi. Representative eksempler er vist i Figur 3. 1AS celler tar opp en femkantet eller heptagonal form, og oppviser en mer isotrop spredning enn med AS-K162R166 og ASpsV14 celler (figur 3A). I kontrast til AS-R44-celler forble nesten sfærisk (figur 3D), og den RICM bilde viste ingen tegn på signifikant adhesjonen av disse cellene til membranen (figur 3D, venstre kolonne).
Tilstedeværelsen av en tett nettvaren av perifer aktin og dannelse av stress fibre som observert for de paren 1AS celler har vært assosiert med celler som ikke er mobil [40]. På den annen side, AS-K162R166 celler (figur 3B) og ASpSV14 celler (figur 3C) celler viser karakteristiske trekk ved høy mobilitet, migrerende celler, slik som tett lamellipodial actin i å spre forsiden (indikert ved piler), og stress fibre langs den store akse av cellene. Det skal bemerkes at arealet av adhesjonen er sammenlignbar mellom 1AS, AS-K162R166 og ASpSV14 celler, til tross for de betydelige forskjellene i cellemorfologi mellom 1AS celler og deres CD44v4-V7-uttrykkende AS-K162R166 og ASpSV14 derivater (figur S1).
Morfologiske Dynamics of 1AS og ASpSV14 Cells
for å markere tidsutviklingen av celle morfologi som svar på oligo-HA overflater, må vi først hentet den perifere kanten av celler fra time-lapse RICM bilder. Totalt fem 1AS og syv ASpSV14 celler ble analysert på denne måten. Figur 4A viser et representativt eksempel på en ASpSV14 celle på en støttet membran funksjon med oligo-HA (
d
~ 5,5 nm,
t
= 9 h). Etter avgrensning av omkretskanten av cellen ved hjelp av kontrasten i pikselverdiene, den radielle avstand
r
mellom kanten av cellen (gul linje) og massesenteret ble plottet som et polart koordinatsystem (
r
,
θ
), som vist i figur 4B. Her,
θ
= 0 er definert som vertikal retning i laboratoriesystemet. Dette gjort oss i stand til å spore retning av cellen bevegelse og for å identifisere den morfologiske anisotropi i en celle ved tidspunkt
t
. Amplituden av formen svingninger er definert som, hvor er den gjennomsnittlige radial avstanden over
θ
= 0-360 °. Ved å plotte merket med en fargekode som en funksjon av vinkelen
θ
over tid
t
(figur 4C), den dynamiske morfologiske endringer i målcellen kan bli avbildet. Videre kan rom-tid-mønstre skjult bak den stokastiske støy av morfologiske dynamikk skal trekkes ut ved å analysere deres korrelasjonsfunksjoner [32]. Autokorrelasjonsfunksjonen av amplituden kart kan beregnes ved: (10)
Som vist på figur 4D, autokorrelasjonsfunksjonen beregnet fra kartet amplitude (figur 4C) tyder på at cellen er lineært strekkes opp til Δ
t product: ~ ± 200 min, kontrakter for en runde kote på Δ
t product: ~ ± 300 min, og deretter er lineært strukket i en vinkelrett retning etter Δ
t product: ~ ± 400 min, som kan identifiseres ved et skifte av topp-posisjoner ved ~ 90 °.
5A og 5B representerer amplitude kart representative 1AS og ASpSV14 celler plottet som en funksjon av
θ
og
t
under tidligere stadium av vedheft (
t
= 0-200 min) til oligo-HA-funksjon membraner på
d
~ 5,5 nm. Som vist i figuren, begge cellene viser svært lite avvik fra den midlere radiale avstand fra midten av massen. De tilsvarende autokorrelasjoner til (C) 1AS og (D) ASpSV14 viser heller ingen karakteristiske trekk, noe som tyder på at både metastatisk og ikke-metastatiske celler spres isotropisk når de er i utgangspunktet i kontakt med oligo-HA-funksjonalismembraner. Denne eksperimentelle funn er i overensstemmelse med tidligere rapporter om den første spredning av kondrocytter [41] og fibroblaster [42].
På den annen side, en klar overgang i dynamisk celle morfologi ble observert etter at kreftceller etablert stabil vedheft. Overgangen ble observert rundt
t
= 300 min for både metastatisk ASpSV14 og dårlig metastatiske 1AS celler. Etter overgangen, viste cellene klare forskjeller i amplituder og autokorrelasjoner. De 1AS celler utstilt mer enn tre distinkte maxima med sammenlignbare amplituder på rundt 20 mikrometer ved t = 750 min (Figur 6A), noe som tyder på at overholdt cellen utviklet seg til en sekskantet form. Som figur 6A og 6E viser, er det meget vanskelig å skille karakteristiske mønstre bare fra de rå amplitude kartene, fordi de morfologiske dynamikken i biologiske celler er meget stokastisk. Intrinsic stokastisk støy fra dynamiske systemer ble overvunnet ved å beregne autokorrelasjonsfunksjonen (ligning 1). Som vist i figur 6C, tre stabile og tydelige autokorrelasjonstoppene for rotasjonssymmetri ved Δ
θ
max = -120 °, 0 ° og 120 ° ble identifisert. Tinning autocorrelation intensitet raskt forfalt for Ati ≠ 0 min, noe som tyder på at 1AS cellen roterer uten å endre sin form.
I kontrast, amplitude kartet over metastatiske ASpSV14 celler viste to uttales maxima opp til
R
max ~ 11 mikrometer (Figur 6B). Den tilsvarende autokorrelasjons oppviser to positive korrelasjoner atskilt av ~ 180 ° (Δ
θ
max = 0 ° og ± 180 °), som er stabile over lang Δ
t plakater (figur 6D ). Dette indikerer at cellen var lineært strukket og beveget i mer enn to timer i den samme retning. RICM bilder av ASpSV14 celler til faste bilde steder (Figur 6F) illustrere bevegelse og forlengelse av cellen før du endrer sin orientering. Dette funnet er i kontrast til den isotropisk spredning observert ved tidligere tidspunkter (figur 5C og 5D).
motilitet av kreft celler som uttrykker CD44s og CD44v4-v7
I neste trinn, vi studerte motiliteten av ASpSV14 og 1AS celler ved å spore forskyvningen av massesenter, bestemt fra det projiserte areal av vedheft. Her ble den midlere hastighet av cellen definert som forskyvning av cellen
dx
samplet innenfor et tidsintervall på hver
dt
= 30 min for ni ASpSV14 celler og fire 1AS celler. Den midlere hastighet holdt seg nesten konstant i begge celletyper enn 20 timer. Gjennomsnittlig hastighet på ASpSV14 celler,
v
psV14 = 5 ± 0,2 mikrometer /t, var bare litt større enn 1AS celler,
v
1AS = 4 ± 0,2 um /h, hvor feil representerer standardavviket til gjennomsnittsverdier.
For å utlede forholdet mellom retningen av motilitet og den morfologiske forandring, vi også beregnet sannsynlighetsfordelingsfunksjonen til graden av celle deformasjon og retningen av celle motilitet: (14)
Merk at
θ
= 0 er definert som retningen av cellen motilitet. Hastigheten og DEFORMASJONS- endring av kreftceller ble evaluert for seks 1AS og fire ASpSV14 celler. Som presentert i figur 7, kan et klart tegn på brudd av symmetri for en enkelt, representative ASpSV14 celle identifiseres som et distinkt sub-topp som avviker fra senteret av 8 um i retning av celle motilitet. Dette er i motsetning til den av 1AS celler som innehar maksimal i nærheten av sentrum, noe som tilsvarer tilfeldig, isotropisk bevegelse. For begge cellelinjer, ble histogrammet beregnet for mer enn 55 celle konturlinjer.
diskusjon
Selv om interaksjonen av CD44 med HA er klart viktig i sammenheng med kreft [4], den rollen av disse molekylene i tumorvekst og metastase trenger videre undersøkelser for å forstå noen ganger motstridende resultater når det gjelder innholdet i dette samspillet. Spesielt analyse ved hjelp av definerte avstanden mellom HA av en homogen størrelse har manglet hittil. Her har vi brukt HA tethered til støttede membraner for å undersøke biofysiske parametere forbundet med celle binding til HA. Vi har funnet at mens CD44s-uttrykkende celler bundet til 1AS like godt til poly-HA og oligo-HA overflater, binding var utsøkt følsom for den romlige fordelingen av HA. På celle-nivået, ble ektopisk ekspresjon av CD44v4-v7 i disse celler ikke forandre innledende binding til oligo-HA flater, men senere indusert endret cellemorfologi og forbedret kjøre migrasjon.
Tidligere har vi vist at i kontrast til ASpSV14 celler, 1AS celler binder svært dårlig til immobilisert HA overflater [26]. I disse cellebindingsanalyser, ble absorpsjonen av HA til plastoverflater anvendes, hvor ingen kontroll over tetthet eller romlig fordeling av HA-molekylene var mulig [26]. Men i denne studien, begge celletyper bundet til oligo-HA tjoret membraner, selv om ASpSV14 celler reagerte annerledes når det gjelder morfologi og motilitet etter innledende binding til overflaten. Vi fant også at binding av 1AS celler til oligo-HA overflater ble sterkt påvirket av avstanden mellom HA molekyler. Det er derfor mulig at den romlige fordelingen av HA i tidligere analyser var ikke optimal for binding av 1AS celler, men latt bli for binding av ASpSV14 celler som uttrykker i tillegg det CD44v4-v7 protein. Videre arbeid vil være nødvendig for å fastslå om ASpSV14 cellene er mindre følsom for den romlige fordelingen av HA enn 1AS celler. Dette synes sannsynlig på grunn av den gruppering av CD44 på overflaten av cellene som fører til forbedrede HA-bindende egenskaper [9].
1AS derivatet AS-R44 ectopically uttrykker en mutant form av CD44v4-v7 som kan ikke binde seg til HA [26]. Overraskende, selv om AS-R44-celler uttrykker CD44s ligner foreldre 1AS celler som kan bindes til oligo-HA flater, AS-R44-celler var ikke i stand til å samhandle med disse flater (figur 3). Disse data tyder derfor på at det ikke-HA-bindende mutert form av CD44v4-v7 kan påvirke HA-bindende aktivitet av den endogene CD44s protein. I samsvar med dette begrepet, AS-K162R166 celler som uttrykker en mutert form av CD44v4-v7 som viser bare en delvis redusert bindingskapasitet til HA [26] oppførte seg på samme måte i bindingsmålingene til ASpSV14 celler som uttrykker villtype-CD44v4- v7 protein
Under den romlige fordelingen av oligo-HA benyttet i denne studien, var gjennomsnittlig transhastigheten ASpSV14 celler ( .
v
psV14 = 5,0 ± 0,2 mikrometer /h) var sammenlignbar med den for 1AS celler (
v
1AS = 4,4 ± 0,2 pm /time) i løpet av 20 timer, til tross for en betydelig forskjell i deres morfologiske dynamikk (figur 6). Imidlertid analyse av adresserte celle deformert (figur 7) viser at mens 1AS celler bare tilfeldig migrerer på oligo-HA overflate, oppviser ASpSV14 celler forbedret kjøre motilitet. Disse forskjellene kan reflektere høyt metastatisk oppførselen til ASpSV14 celler
in vivo
forhold til den svake metastatisk oppførselen til 1AS celler [7], [16]. Videre, selv om 1AS celler oppviser cytoskeletal funksjoner som tidligere var knyttet til immobile celler [40], det faktum at deres hastighet ble observert å være lik ASpSV14 celler tyder på at disse funksjonene snarere gjenspeiler de dynamiske morfologiske egenskapene til cellene.
i denne studien, benyttet vi kvantitativt funksjonalisert støttede membraner og studerte adhesjonen, morfologiske mønstre, og motilitet av pankreas adenokarsinom-celler som uttrykker forskjellige CD44-isoformer. Å diskriminere de karakteristiske rom-tid-mønstre fra stokastisk støy fra dynamiske cellesystemer, innførte vi en relativt enkel, men grei statistisk bildeanalyse som autokorrelasjonsfunksjoner. Tidligere Maeda et al. undersøkte morfologi og orienterings korrelasjon av slim mold
Dictyostelium discoideum
på glass underlag [32], rapportering som
D. discoideum
gjennomgår stokastiske overganger innenfor et tidsvindu på 10-20 min. Våre resultater tyder på at morfologiske dynamikken i kreft i bukspyttkjertelen celler er mye tregere, med karakteristiske tidsvinduer i flere timer. Dette kan tilskrives delvis det fremtredende spredning og adhesjon av cancerceller formidlet via spesifikke HA-CD44-interaksjoner og kan kreve både adhesjon til overflaten (grep) og etterfølgende spaltning av CD44 (release) i løpet av cellemigrering som foreslått av en tidligere studie [43].
dynamikken i «selvgående» partikler blir stadig større oppmerksomhet innen statistisk fysikk langt fra likevekt. J.P.S.
