Abstract
Mål
pinnsvin signale pathway spiller en viktig rolle i EMT av kreft i bukspyttkjertelen celler, men de nøyaktige mekanismene fortsatt unnvikende. Fordi S100A4 som en nøkkel EMT moleculer markør ble funnet å være oppregulert ved Gli1 i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi fokusert på forholdet mellom Hysj-Gli1 signaler og S100 gener familie.
Metoder
På base av cDNA microarray data, undersøkte vi regulerende mekanisme Gli1 til noen medlemmer av S100A gener familie i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer for det første. Deretter ble reguleringen av Gli1 til S100A4 gen studert av molekylærbiologiske analyser og pro-metastase effection av Gli1-avhengig S100A4 ble undersøkt in vitro. Til slutt ble de uttrykk for Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin i kreft i bukspyttkjertelen vev studert ved hjelp av immunhistokjemi analyser.
Resultater
Fem medlemmer av S100 gener familien, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11, og S100A14 ble funnet å være nedregulert betydelig på Gli1 knockdown. Gli1 enhancer prediksjon kombinere med in vitro data viste at Gli1 regulerer primært S100A familiemedlemmer via cis-virkende elementer. Faktisk dataene indikerer S100A4 og vimentin genene ble oppregulert betydelig ved Shh /Gli1-ekspresjon økende og E-cadherin ble signifikant redusert på samme tid. Migrering av PC-celler ble økt signifikant i en dose-avhengig måte fra Gli1 uttrykket (P 0,05) og siS100A4 vesentlig tilbake responsen til PC-celler indusert av L-Shh transduksjon (P 0,01).
Konklusjon
Våre data etablere en ny forbindelse mellom Hysj-Gli1 signalering og S100A4 regulering, som innebærer at S100A4 kan være en av de viktigste faktorene i EMT mediert av Hysj-Gli1 signal i bukspyttkjertelkreft.
Citation : Xu X, Su B, Xie C, Wei S, Zhou Y, Liu H, et al. (2014) Sonic Hedgehog-Gli1 signalveien Regulerer epithelial Mesenchymale Transition (EMT) ved formidling av et nytt mål Gene, S100A4, i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 9 (7): e96441. doi: 10,1371 /journal.pone.0096441
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 9 mars 2013; Godkjent: 08.04.2014; Publisert: 29.07.2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra Natural Science Foundation of China (81072005, 81172312 og 81101839) National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen representerer en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødelighet i industrialiserte land [1]. Den dårlig prognose av denne sykdommen er hovedsakelig på grunn av den tidlige systemiske metastase [1] – [3]. Et stort antall studier har vist at den epiteliale mesenkymale overgangen (EMT) kan være en viktig mekanisme for kreft i bukspyttkjertelen celler å løsne fra det primære tumor-stedet, og sprer seg til fjerntliggende organer. Men EMT-initiere signalveier forblir unnvikende nå i kreft i bukspyttkjertelen celler. Nylig har pinnsvin (Hh) signalveien blitt demonstrert å være en viktig formidler av tumorvekst i flere i magetarmkanal som kreft [4], [5]. Når det gjelder kreft i bukspyttkjertelen, har det blitt demonstrert at avvikende aktivering av Hh signalveien ble ført fra Sonic hedgehog (Shh) overekspresjon i de fleste tilfeller [6] – [8]. Et stort antall studier har vist at de viktigste mekanismer for Hh signalveien i kreftceller var til å fremme epitelial mesenchymal overgang (EMT) prosessen [9] – [11]. Videre har det blitt vist at blokkering av denne reaksjonsvei signifikant hemmet metastase av tumorceller in vivo og in xenograft-modeller [12], [13].
Siden målgener av Gli1 var de viktigste mekanismer Hh signalveien, vi forsøkt å forstå dens pro-metastatiske mekanismer identifing målene Gli1 i kreft i bukspyttkjertelen celler. Som en viktig pro-metastatisk target gen av Gli1 i bukspyttkjertelkreft må ha følgende egenskaper: Først, det er effektive Gli1 cis-virkende elementer i sin gensekvensen; For det andre ble det transkripsjon regulert positivt av Gli1; For det tredje ble det oppregulert i de fleste kreft i bukspyttkjertelen vev og dens uttrykk nivået var positivt korrelert med Hh signalering; Fjerde, må det være et viktig pro-metastatisk funksjonell faktor. I forrige undersøkelse, har vi utført en systematisk forskning om målet genet profilene ved Gli1 i høy metastatisk kreft i bukspyttkjertelen cellelinje gjennom cDNA microarray og fant at 5 medlemmer av dette genet familien ble oppregulert ved Gli1. Spesielt ble S100A4 som en nøkkel moleculer markør fremme EMT prosess i bukspyttkjertelkreft funnet å være oppregulert mer enn 3 ganger i denne undersøkelsen. På basis av disse studiene vi fokusert på forholdet mellom Hysj-Gli1 signaler og S100 genet familien.
I denne studien analyserte vi Gli1 avventende områder innen DNA-sekvenser av S100 gener familie med bioinformatikk og databaser. Videre forsøkte vi å finne nye forbindelser av Hysj-Gli1 signalveien med S100 gener familie og for å demonstrere pro-metastatisk funksjon av S100A4 genet mediert av Hysj-Gli1 signaler i bukspyttkjertelkreft.
Materialer og metoder
cellekulturer
den menneskelige PC cellelinjer, BxPC3, ASPC-en og Panc-1, ble alle kommersielle cellelinjer, og vi hentet disse cellelinjer fra institutt for Cytologi Chinese Academy of Science.These celle linjer ble utbredt i bukspyttkjertelkreft forskning [14] – [18]. Tre cellelinjer ble alle dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 i luft.
Vektorer konstruksjon og cellene infeksjon
Lentiviral overførings vektorer for menneskelig Gli1 shRNA eller Shh cDNA ble konstruert av Genechem Co., Ltd, Shanghai, Kina. Dette systemet inkluderer lentiviral vektor pLVTHM, innhylle plasmid pMD2G, og emballasjen plasmid pRSV-REV og pMDlg-pRRE. Lentivirus-Shh (L-Shh) inneholdt et 3,3-kb kodende sekvens for Shh og lentivirus-Gli1i (L-Gli1i) inneholdt Gli1 liten hårnål RNA (5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3 «) til den målsøkende sekvensen av shRNA så tidligere beskrevet [19]. Den lentivirus-kontroll (L-C) som ikke inkluderer de Gli1 forstyrrelser sekvenser eller Shh cDNA sekvenser fungerte som kontroll. Endelig lentiviral konstruksjoner ble bekreftet via DNA-sekvensering for å sikre nøyaktighet. Rekombinant lentivirus ble fremstilt ved forbigående transfeksjon av 293T celler etter en standard protokoll. Når BxPC3, ASPC-1 og Panc-1 celler var omtrent 50% konfluens i RPMI-1640 inneholdende 2% FCS, ble de infisert med lentivirus konstruksjonene på MOI 5. Cellene ble høstet etter 72 timer for ytterligere eksperimenter. For å identifisere funksjonelle L-Shh og L-Gli1i konstruerer, vi rutinemessig analysert Shh og Gli1 uttrykk ved QRT-PCR og western-blotting.
S100A4 Transient knockdown
Vi brukte en RNAi sekvens (siS100A4 ) og en negtive kontrollsekvens (siS100A4 MIS) som har vist effektiv knockdown av S100A4 i menneskelige tykktarmskreft HT29 celler i en tidligere rapport [20]. S100A4 knockdown ble overvåket ved å bestemme dets mRNA og proteinnivåer etter 48 timer ved siRNA transfeksjon, respektivt. Og deretter ble cellene anvendt for å transwell analyser. Celler ble lipofected med sirnas hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger.
RNA ekstraksjon og sanntid RT-PCR-analyser
Total RNA prøver ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen ) i henhold til produsentens protokoll og 100 ng total RNA ble revers transkribert i 20 ul volum og 2 ul cDNA anvendt for PCR i henhold til produsentens instruksjoner. (Takara bioteknologi, Dalian, Kina). Primersekvensene ble sett i tabell 1. CT (syklus terskel) verdier ble standardisert til CT verdier av GAPDH.
Protein utklemming og vestlige-blotting analyser
Totalt proteinprøver ble hentet med RIPA buffer i henhold til standardmetoden, og prøvene ble normalisert for proteininnhold med et kommersielt tilgjengelig kit (Bio-Rad Company). Like mengder protein ble brukt for vestlige-blotting analyser i henhold til standard protokoll for Shh, Gli1, S100A4, E-cadherin, VIM (vimentin) og GAPDH deteksjon.
Transwell analyser
Cell invasjons assay-24 prøver kits (Chemicon, Bedford, MA) ble benyttet for å studere invasjon /migrering av PC-cellelinjer. Etter 24 timers inkubering, ble migrerings tellinger av PC-celler erholdt ved å fotografere membranen gjennom mikroskopet. Tellinger ble foretatt i 5 høyeste celler områder ved en høy effekt forstørrelse (x 200). Gjennomsnittsverdien av feltene regnet ble ansett som migrasjon telling av PC-celler.
Den Formaldehyd Cross-linking Chromatin Immunoutfellingsunder (XChIP) analyser
XChIP analysene ble utført som tidligere studier [21]. I korte trekk, kromatinet av ASPC-1 celler (3 x 10
7) ble samlet inn med 1 ml IP buffer som inneholder proteasehemmere cocktails. Kromatin ble skåret ved anvendelse av en sonikator i en isboks (6 runder med 10s pulser, 350 W, 60 sekunders intervaller) og Tverrbinding ble reversert ved tilsetning av 20 ul av 5 M NaCl over natten ved 65 ° C. DNA ble ekstrahert ved hjelp av fenol /kloroform analysen. 20 ul av DNA ble underkastet elektroforese på en 1,5% agarosegel, og resten ble brukt som input DNA. Spon grad geitepolyklonalt Gli1 antistoff (0,1 ug /ml) (Santa Cruz Company) ble anvendt for immunopresipitering, ble mus IgG (0,1 ug /ml) (Santa Cruz Company) tilsatt som en tilfeldig kontroll, RNA polymerase II-antistoff (0,1 ug /ml) som en positiv kontroll og β-aktin-antistoff (0,1 ug /ml) som en negativ kontroll. Primeren til promoter-regionen av GAPDH (Santa Cruz Company) ble anvendt som en negativ kontroll. (Tabell 2).
luciferaserapportørplasmid vektorer analyser
S100A4 promoter luciferaserapportørplasmid vektorer ble konstruert av Genechem Co., Ltd, Shanghai, Kina. I korthet ble et 1,5-kb cDNA-fragment (-766 til 734 av human S100A4-gen) med Xhol og Hindlll setene syntetisert og klonet inn i Xho I og Hind III områder av pGL3 grunnleggende luciferase vektor for å produsere pGL3-1.5 S100A4 innehold tre Gli1 avventende nettsteder [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)]. I mutagenese vektorer, ble Gli1 potensielle bindingsseter sekvenser erstattet av henholdsvis GATTCTTAA sekvens som har ingen kjente bindingssteder for noen transkripsjonsfaktorer [22]. Singelen Gli1 avventende språk mutagenese vektorer inkludert pGL3-1.5 S100A4 Mut en [GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)], pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 [ACCCACCAC ( -349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)] og pGL3-1.5 S100A4 Mut 3 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og GATTCTTAA (126~134)]. De mange Gli1 bindingssteder mutagenese vektorer inkludert pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2 [GATTCTTAA (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)], pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-3 [ ,,,0],GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og GATTCTTAA (126~134)] og pGL3 1,5 S100A4 Mut 2-3 [ACCCACCAC (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235 ) og GATTCTTAA (126~134)]. De endelige vektorkonstruksjoner ble verifisert via DNA-sekvensering for å sikre nøyaktighet. ASPC-1-celler ble transfektert med 5 ug av enten pGL3-1500 S100A4 eller pGL3-1500 S100A4 mutante konstrukter og 2 mikrogram av den Renilla luciferase-konstruksjon (pGL4.75, Promega) som en intern kontroll for normalisering ved hjelp av Lipofectin-reagens-metoden protokoll. 48 timer etter transfeksjon, ble ASPC-1-celler anvendt for luciferase-analyser i henhold til protokollen fra den doble luciferase reporter kit (Promega) og volues ble readed ved hjelp av et luminometer. Hver Forsøket ble gjentatt minst 3 ganger, hver gang i tre eksemplarer.
Pasientprøver
I dette arbeidet 102 banked parafininnstøpte kreft vev fra ulike PC-pasienter (fra 63 menn og 39 kvinner , gjennomsnittsalder 56,7 år, range 44-75 år) ble analysert ved immunhistokjemi. Alle pasientene har blitt enige om denne forskningen. Alle prøver ble hentet fra den tiende folks sykehus av Tongji University, Kina og alle pasienter har signert en samtykke dokument, der de ble enige om at kirurgisk fjerning av malignitet ville bli brukt i medisinsk forskning før sine operasjoner. De etikkomiteer i Tongji universiteter godkjent samtykke prosedyre og studier.
immunhistokjemi analyser
parafin-embedded PC vev ble brukt for identifisering av Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin. Shh polyklonale antistoff ble kjøpt fra R D Company og de andre (Gli1, S100A4 og E-cadherin) var fra Sant Cruz Company. De immunhistokjemi analyser ble utført som de foregående studier og uttrykket nivåer av Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin gener ble gradert basert på tidligere beskrevet retningslinjer [23].
Statistical Analysis
for alle statistiske analyser, ble en programvarepakke SPSS17.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA) benyttet. Kontinuerlige variabler ble uttrykt som middelverdier ± SE og en ikke-paret t-test ble anvendt for statistisk evaluering. Korrelasjonene mellom ekspresjon av Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin proteiner og forholdet mellom de kliniske karakteristika for pasientene og de fem proteiner ble analysert ved hjelp av Spearman Rank test.
P
. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Differensial uttrykk for S100 genet familie på Gli1 i ASPC-1 celler
Å avgrense genuttrykk indusert av Hysj-Gli1 signaler i kreft i bukspyttkjertelen celler, ble ASPC-1 celler brukes til cDNA microarray analyser som sammenligner lentivirus-kontroll vs lentivirus-Gli1i celler. Ved å fokusere på EMT-relaterte gener i cDNA data, fant vi den positive sammenhengen mellom Shh signaler og S100 gener familie [21]. I vår skjerm (uttrykket signaler inkludert 23 medlemmer av S100 gener familie unntatt S100A17 og S100A18) 10 gener, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P og TCHH, ble uttrykt og 13 gener, S100A1 , S100A12, S100A3, S100A5, S100A7, S100A15, S100A8, S100A9, S100B, S100G, S100Z, RPTN og FLG ble ikke uttrykt i ASPC-1 celler. Sammenligning analyse fra lentivirus-kontrollgruppe vs lentivirus-Gli1i gruppe celler viste at S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 og S100A14 ble oppregulert på Gli1. (Figur 1A). De ti gener, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P og TCHH, ble plukket for validering av real-time RT-PCR. Som vist i figur 1B, S100A2, S100A4, S100A6, ble S100A11 og S100A14 funnet å være oppregulert, uten vesentlige endringer i de fem andre gener. Disse dataene er i samsvar med det som ble oppnådd fra cDNA microarray
A:. CDNA microarray data om S100 genet familien; B: De differensial uttrykk nivåer av partielle medlemmer av S100 genet familie ved QRT-PCR. Ekspresjon av GAPDH-er som en kontroll. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Forut Gli1 avventende områder og mulige Gli1 målgener innenfor S100A genet familie
for ytterligere å studere mekanismen av Hysj-Gli1 signalveien på regulering av S100 genet familien, lastet vi DNA-sekvenser av S100A gener fra Genbank og analysert homologe sekvenser av Gli1 avventende hotellet (GACCACCCA) ved å utnytte Blastz bioinformatikk verktøy . De bioinformatikk data viste at nesten alle medlemmer av S100A genet familie inneholde mange høyt konserverte homologe sekvenser (forskjellen er ikke mer enn en base) og disse antatte Gli1 avventende nettsider utstilt egenskapene klyngen ordningen. Den Tabell 3 viser den antatte Gli1 avventende områder innenfor den proksimale reguleringsområdet inneholder intergeniske regioner, intragenic regioner, untranscripted regioner og uoversatt regioner (ikke mer enn 5,0 kb unna TSS). Dataene sannsynligvis confered en noe høyere samlet grad av bevis for at disse kandidatene er faktisk forskjellig uttrykt i innstillingen av kreft i bukspyttkjertelen, muligens som nedstrøms mål for et abnormt reaktivert.
Det nye målet genet og dets effektiv Gli1 bindingssteder identifikasjon i ASPC-en
PCR primere for XChIP analyser ble utformet i henhold til 1,5 kb lange promoter sekvenser av S100A2, A4 og A6 gener, som inneholder flere spådde Gli1 avventende sider (64~72 , 326~334, 418~426 for S100A2, -349~-357, -227~-235, 126~134 for S100A4,. -246~-254, 786~794 for S100A6 homologi av hvert område er 89%. ). (Tabell 3). Resultatene av XChIP analysene viste at transkripsjonsfaktor Gli1 bundet til arrangører av S100A2, 4 og 6 genene henholdsvis i de dyrkede ASPC-1 celler (figur 2)
M. DNA Marker; PC: RNA polymerase II antistoff for XChIP positiv kontroll; IP: Gli1 XChIP; IGG: mus IgG for XChIP tilfeldig kontroll; NC:. P-aktin antistoff for XChIP negativ kontroll
Resultater av luciferase analysene viste at promotor aktiviteter pGL3-1500 S100A4 økt med uttrykk nivåer av Gli1 genet på en doseavhengig måte (
P
0,05). Den pGL3-1.5 S100A4 Mut to eller tre hadde ingen signifikant effekt på luciferase aktivitet (
P
0,05), men pGL3-1.5 S100A4 Mut en redusert luciferase aktivitet vesentlig sammenlignet med pGL3-1.5 S100A4 (
P
0,05), noe som tyder på at området en kan være forsterkere av Gli1. Luciferaseaktiviteten av plasmider inneholder nettstedet en økt betydelig (
P
0,01), og at av plasmider inneholder nettstedet to eller tre ikke endres vesentlig (
P
0,05). (Figur 3A, B, C). Sekvensen av området 1, ACCCACCAC hadde også vist seg å bli anerkjent og sis-aktivert av Gli1 proteiner tidligere [24], [25]
A:. S100A4 luciferase aktivitet øker med økende uttrykk nivå Shh i ASPC-1 celler. De pGL3-1.5 S100A4 og Renilla luciferasepreparater vektorer ble transient transfektert inn i L-Gli1i infisert, L-C smittet eller L-Shh infisert ASPC-1 celler henholdsvis. Resultatene ble normalisert for transfeksjonseffektivitet ved hjelp av Renilla luciferase og den L-C infisert gruppe ble vilkårlig gitt en verdi på 1. B: Relativ luciferase-aktivitet av de S100A4 promoter Gli1 bindingssete mutanter. ASPC-1 celler transfektert med L-Shh ble transient transfektert 5 mg hver reporter konstruere inkludert pGL3-1.5 S100A4, pGL3-1.5 S100A4 Mut1, Mut2 og Mut3 hhv. Den pGL3-1.5 S100A4 ble vilkårlig gitt en verdi på 1 og aktivitetene til andre transfections var justert i forhold til denne aktiviteten. C: Site 1 var ansvarlig for Gli1 transkripsjon. Relativ luciferase aktivitet fra ulike ASPC-1 cellegrupper, L-Gli1i infeksjon, L-Shh infeksjon eller LC infeksjon, transfektert med ulike konstruksjoner, pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2, Mut 2-3 og Mut 1-3 med Renilla luciferasepreparater vektorer . Resultatene var normalisert etter transfeksjon effektivitet ved hjelp Renilla luciferase og LC infiserte gruppen ble vilkårlig gitt en verdi på 1. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Regulering av Hysj-Gli1 signaler til uttrykk av S100A4 og til invasjon /migrasjon av PC cellene gjennom formidling av S100A4 in vitro
for å studere pro-metastase funksjon av Gli1-avledet S100A4 i bukspyttkjertelen videre kreftceller, fem grupper av PC celler, L-Gli1i, LC, L-Hysj, L-Shh + siS100A4 MIS og L-Shh + siS100A4, ble brukt til å analize reguleringen av Hysj-Gli1 signaler til S100A4, E-cadherin og VIM gener ved real time RT-PCR og vestlige-blotting analyser. Og da de samme fem gruppe celler ble brukt for å evaluere invasjon /migreringen av PC-celler
in vitro
av Transwell-analyser. Resultatene av QRT-PCR og western-blotting viste at uttrykket nivåer av S100A4 og VIM genene ble økt betydelig etter Shh /Gli1 utfoldelse øker. I motsetning til dette ble uttrykket nivåer av E-cadherin betydelig redusert på samme tid. (Figur 4A, C). Videre S100A4 slått ned signifiantly reverseres downregulated E-cadherin og oppregulert VIM indusert av L-Shh transduksjon. (Figur 4B, D). Resultatene av Transwell analyser viste migrasjon av PC celler ble betydelig redusert i L-Gli1i gruppe og økt i L-Shh gruppe henholdsvis sammenlignet med L-C gruppe (
P
0,05). (Figur 4E). Videre siS100A4 vesentlig tilbake responsen til PC celler indusert av L-Shh transduksjon (
P
0,01). (Figur 4F). Dermed ser det ut til at S100A4 formidlet av abnomal aktivert Hysj-Gli1 signalveien kan være en av nøkkel pro-migrasjon faktorer i kreft i bukspyttkjertelen celler
A:. De relative transkripsjonsnivåer Shh, Gli1, S100A4, E- cadherin og vimentin ble regulert av L-Gli1i /L-Shh transduksjon. B: De relative transkripsjonsnivåer S100A4, E-cadherin og vimentin i L-Hysj transfekterte celler ble reversert av siS100A4 transduksjon. C: Uttrykket nivåer av Gli1, S100A4, E-cadherin og vimentin proteiner regulert av L-Gli1i /L-Shh transduksjon. D: Uttrykket nivåer av S100A4, E-cadherin og vimentin proteinene ble reversert av siS100A4 transduksjon. E: Invasjonen /migrasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler som reguleres av L-Gli1i /L-Shh transduksjon ble analysert ved Transwell analyser. F: Invasjonen /migrasjon av L-Hysj transfekterte celler ble reversert av siS100A4 transduksjon. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Sammenheng mellom uttrykket av Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin proteiner PC vev
resultatene av immunhistokjemi viste at de positive stainings av Shh. Gli1 og S100A4 proteiner lokalisert nesten utelukkende til de neoplastiske cellene ved svakt positiv farging av Shh i øyen celler og kroniske pancreatitic kanalen komplekse og til å bli sett i bukspyttkjertelen vev bortsett fra kreft. I motsetning til dette ble det protein ekspresjon av E-cadherin markert nedregulert i PC-vev, sammenlignet med normale tumor-tilstøtende vev. De fargemønstre av Shh og S100A4 var diffuse cytoplasmatiske type, som av E-cadherin var diffus cytomembrane type og at av Gli1 vise perinukleær cytoplasma og nukleær farging. Fordi Gli1 ble aktivert bare etter inn i kjernen, ble prøvene med bare cytoplasma farging regnet som negative uttrykk. (Figur 5). Immunreaktiviteten forholdstall var 78,43% for Shh (80 av 102), 51,96% for Gli1 (53 av 102), 81,37% for S100A4 (83 av 102) og 48,04% av E-cadherin (49 av 102) i PC-prøver. Den Spearman rank test analyse viste at betydelige positive korrelasjoner ble oppdaget mellom Shh, Gli1 og S100A4 på proteinnivået i PC (Shh vs Gli1: CC = 0,697,
P
0,01; Shh vs S100A4: CC = 0,476,
P
0,01; Gli1 vs S100A4: CC = 0,510,
P
0,01). Omvendt, ble de betydelige negative korrelasjoner mellom de tre proteiner og E-cadherin bekreftet (Shh vs E-cadherin: CC = -0,278,
P
0,01; Gli1 vs E-cadherin: CC = -0,207,
P
0,05; S100A4 vs E-cadherin: CC = -0,285,
P
0,01)
A:. Sterk cytoplasma farging for Shh i kreft i bukspyttkjertelen celler (× 400); B: Svakt positiv farging for Shh i ductal kompleks av kronisk pankreatitt vev (× 400); C: Svakt positiv farging for Shh i øyceller av normal kreft side vev (× 200); D: Negtive farging for Shh i normale duktale epitel /akinærceller kreft side vev (× 200); E: Kreftceller vise sterke kjerne farging for Gli1 og normale kreft side vev ble negtive (× 400); F: Sterk positiv perinukleær cytoplasma og en del kjernefysiske farging for Gli1 i kreft i bukspyttkjertelen celler (× 400); G: Sterk positiv cytoplasma farging for S100A4 i kreft i bukspyttkjertelen celler (× 400); H: Positiv cytoplasma farging for E-cadherin i kreft i bukspyttkjertelen celler. Svarte piler peker positiv farging området og hvite piler peker på negtive flekker området.
Sammenhengen mellom uttrykket av fire proteiner og clinicopathological funksjoner av PC pasientene
Den statistiske analysen av data viste at uttrykket nivåer av Shh (CC = 0,245,
P
0,05 og CC = 0,254,
P
0,05) og S100A4 (CC = 0,265,
P
0,01 og CC = 0,220,
P
0,05) proteiner ble positivt korrelert med tumorstørrelse og lymfeknutemetastaser og som av Gli1 protein var positivt korrelert med lymfeknutemetastaser (CC = -0,370, P 0,05). Men ingen signifikant korrelasjon ble funnet mellom de fire proteiner og alder, kjønn, tumor beliggenhet og differensiering.
Diskusjoner
I løpet av vev morphogenesis aktivering av Hh signalveien nesten følge forekomsten av EMT og dette prosessen er nødvendig for migrering av Hh-responsive celler [26], [27]. Det ble rapportert at mekanismene for Shh-Gli1 signalveien fremme ondartede svulster som er involvert i mange aspekter av ondartede biologiske atferd, men dens viktigste rolle i tumorer er å fremme EMT og vedlikeholde tumor stamceller [28]. I denne studien, gir vi en systematisk forskning om mekanismen for Gli1 i en høy-metastase bukspyttkjertelkreft cellelinje, ASPC-1. Den ASPC-en cellelinje inneholder både Ki-ras genmutasjon og DPC4 genet sletting, noe som var typisk kreft i bukspyttkjertelen molekylær patologiske endringer [29], [30]. Videre var ekspresjonsnivået av Gli1 slått ned moderat ved hjelp av RNA-interferens system, som var mer i samsvar med de faktiske molekyl patologisk endring av kreft i bukspyttkjertelen enn kunstig genet utstansing. Så målet genet spekteret oppnådd i vår screening var mer i samsvar med den faktiske situasjonen for kreft i bukspyttkjertelen celler.
Til dags dato, minst 25 medlemmer har blitt rapportert å tilhøre S100 familie hos mennesker. Tjueen av dem er kodet av gener som smyger seg på kromosom 1q21 locus, kjent som epidermal differensiering kompleks (EDC) som omfatter i epitelial-avledede celledifferensiering [31]. Det har blitt rapportert noen medlemmer av denne familien ble overuttrykt i ulike krefttyper og deres funksjoner kan involvert metastase og EMT [32] – [34]. EDC inneholder to grupper av etter hverandre fordelte S100A gener. En gruppe inneholder S100A1, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2-S100A7, S100A15, S100A8, S100A12 og S100A9 og den andre inneholder FLG, HRNR (S100A18), RPTN, TCHH, TCHH1 (S100A17), S100A11 og S100A10. De andre gener som tilhører underfamilier av S100B, S100P, S100Z og S100G er henholdsvis lokalisert på kromosom loci 21q22, 4p16, 5q14 og Xp22. Det ble rapportert at S100A gener hadde en felles opprinnelse i molekylær evolusjon mens S100B, av S100P, S100Z og S100G hadde ulik opprinnelse, så S100A gener kan ha en universell konserverte regulatoriske sekvenser [35]. Gitt deres høyt konservert Gli1 bindende homologe sekvenser, er det spekulert i at de spiller samme rolle knyttet til Gil1, selv om vi ikke kan utelukke at de har forskjellige funksjoner som ikke er relatert til Gil1. Våre resultater antydet at uttrykket av S100A gener familie i PC-cellene har tre måter: For det første uttrykker og avhengig Gli1; andre, uttrykke, men ikke avhengig Gli1; tredje, ikke uttrykke. Combinating Gli1 enhancer prediksjon med microarray data, spekulerte vi at Gli1 regulert S100A gener gjennom cis-virkende elementer kan være en grunnleggende modus av regulering. Tidligere studie hadde rapportert at S100A7 og S100A9 transkripsjon ble indusert av GlI1 behandling i epidermale celler [25]. Under utviklingsprosessen noen S100A genene ekspresjonen kan være slått av på grunn av for å oppnå ukjent sekvens repressor og da noen av disse genene kan bli skrudd på igjen, men ikke lenger ble regulert ved Gli1 som et resultat av å skaffe ytterligere cis-virkende elementer. Denne hypotese kan delvis tolke hvorfor ekspresjonen av S100A familie er kjennetegnet ved vev-selektivitet selv om det fortsatt er mangel på tilstrekkelig bevis. Detaljerte komparative genomikk studier mellom ulike arter, samt ulike S100A gener kan bidra til lenger forstå de nøyaktige mekanismene. I vår mikroanalyse og den påfølgende real-time PCR studier, flere S100A gener, inkludert S100A2, S100A4, S100A6, S100A11, og S100A14, ble oppregulert i respons til Gil1. Flere av disse S100A gener som S100A2, A4 og A6 er blitt vist å være involvert i kreft i bukspyttkjertelen. I denne studien data av XChIP analyser viste at transkripsjonsfaktor Gli1 bundet til de regulatoriske sekvenser av S100A2, A4 og A6-genene henholdsvis i ASPC-1-celler, noe som antydet at disse genene kan være cis-regulert av Gli1.
studier har vist at funksjonene S100 genet familiemedlemmer var kompleks og mangfoldig, og så langt er det bare S100A4 ble funnet å være nært forbundet med EMT prosessen. Videre, i tidligere studier har vi foreslått en hypotese om at S100A4 genet kan være en av de viktigste faktorene i EMT molekylære nettverk regulert av Hysj-Gli1 signalveien i kreft i bukspyttkjertelen celler [19]. Derfor ble S100A4 gen anvendt som et eksempel for å utforske forholdet mellom Shh-Gli1 signaler og S100 genfamilien. Som et spørsmål om Faktisk har mange undersøkelser indikert at de S100A4 proteinnivå i kreft i vev, pankreatisk saft og serum av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen ble signifikant økt i [36] – [38]. Noen studier har antydet at S100A4 kan brukes som en potensiell biomarkør for kreft i bukspyttkjertelen [39]. Men hvorfor S100A4 genet ble overexpressed selektivt i PC var usikker. Kanskje S100A4 genet kan reguleres ved visse aktiveres selektivt signalveien samtidig i bukspyttkjertelkreft. I denne studien har vi for første gang funnet at uttrykket nivåer av S100A4 proteinet ble positivt korrelert med aktivitet av Hysj-Gli1 signaler kreft i bukspyttkjertelen vev og Gli1 protein oppregulert S100A4 mRNA gjennom cis-aktivering måten PC-celler som etablerte en presis molekylær vei fra Hysj-Gli1 signaler til S100A4 i PC-celler.
Selv om aktivering av Hh signaler nesten fulgt forekomst av EMT, til dags dato, var det ingen bevis for at Gli1 direkte regulert Snail /Slug transkripsjon.
