Abstract
Vi tilbyr nye funksjonelle data som posttranskripsjonelt stanse av genet
RPL19
hjelp RNAi ikke bare opphever den ondartede fenotype av PC-3M prostatakreftceller, men er selektiv med hensyn til transkripsjon og oversettelse av andre gener. Redusere
RPL19
transkripsjon modulerer en undergruppe av gener, dokumentert av genekspresjon rekke analyse og Western blotting, men ikke kompromiss celleproliferasjon eller apoptose
in vitro
. Men veksten av tumorer inneholdende xenopodet den utslåtte
RPL19 in-vivo
er betydelig redusert. Analyse av de modulerte gener viser induksjon av ikke-ondartet fenotype i hovedsak å involvere perturbasjon av nettverk av transkripsjonsfaktorer og cellulære adhesjon gener. Dataene gir bevis for at utenom ribosomale regulatoriske funksjoner av
RPL19
, utover proteinsyntesen, er kritiske regulatorer av celle fenotype. Målrette sentrale medlemmer av berørte nettverk identifisert ved genekspresjonsanalyse øker muligheten for terapeutisk stabilisere en godartet fenotype generert ved å modulere uttrykk for en individuell genet og deretter begrensende en ondartet fenotype samtidig la ikke-maligne vev upåvirket.
Citation : Bee A, Brewer D, Beesley C, Dodson A, Forootan S, Dickinson T, et al. (2011) siRNA knockdown av ribosomalt protein Gene
RPL19
opphever den Aggressiv Phenotype of Human prostatakreft. PLoS ONE 6 (7): e22672. doi: 10,1371 /journal.pone.0022672
Redaktør: Steven R. Ellis, University of Louisville, USA
mottatt: 18 januar 2011; Godkjent: 04.07.2011; Publisert: 22.07.2011
Copyright: © 2011 Bee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av North West Cancer Research Fund (UK), Cancer Research-UK, National Cancer Research Institute (MRC-UK), en Specialized Program for fremragende forskning (SPORE) stipend fra US National Cancer Institute (USA), er Grand Charity av frimurerne, Rosetrees Trust, The Bob Champion Cancer Trust, The Orchid Appeal og David Koch Foundation. Finansierende organer hadde ingen involvering i utformingen og gjennomføringen av studien, i datainnsamling, analyse og tolkning av data, eller i forberedelse, gjennomgang og godkjenning av papiret
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
introduksjon til
ribosomale proteiner (RPS) omfatter en kompleks superfamilien av proteiner [1] svært konservert gjennom evolusjon, noe som indikerer deres funksjonelle betydning for levende organismer [2]. Denne påstanden støttes av antall RP pseudo og genduplikasjon sammen med felles regioner av identitet mellom homologe proteiner i prokaryoter og eukaryoter [3]. Eukaryote ribosomer inneholde ca 80 RPs sammen med fire ribosomale RNA (rRNA) og krever rundt 150 ikke-ribosomale faktorer for å bli organisert i sine bestanddeler små (40S) og store (60s) subenheter [4]. Til å begynne med antas å være involvert i proteinsyntese bare er visse RPs anerkjent som pleiotropisk og til å mediere en rekke ekstra-ribosomale regulatoriske funksjoner [5], [6]. Slike RPs, omfatter L5 [7], L11 [8], L13 [9] og S7 [10]. I sebrafisk (
Danio rerio
) en kraftig rolle for RPs som tumor-suppressorer er demonstrert hvorved mutasjon eller undertrykkelse i en hvilken som helst av flere RP-gener svekker kontroll av p53, og dermed fremme malignitet [11], [12]. Nylig har begrepet «ribosomopathy» er blitt etablert, hvorved mutasjon av en bestemt RP er patogene for en bestemt sykdom [13]. Omtrent 25% av tilfellene av Diamond-Blackfan anemi skyldes mutasjon av ribosomalt protein genet
RPS19
mens i en annen 20%, mutasjoner forekomme i andre ribosomale proteiner gener [14]. Foreløpig noen 77 individuelle
RPS19
mutasjoner er blitt beskrevet [15]. I tillegg har haploinsufficiency for ribosomale proteiner er vist, i noen tilfeller for å være en underliggende årsak for Diamond Blackfan anemi [16].
For tiden mekanismer knyttet mutasjoner i RP gener til kreft er fortsatt ukjent [17]. For den proksimale lange arm region av kromosom 17 der
RPL19
genet ligger (VED BETJENING 17Q), store kreftspesifikke endringer er beskrevet. Disse inkluderer presiseringer og kopiere nummer endringer, spesielt de av regionen som omfatter onkogen
ErbB2
, dannelsen av isochromosome VED BETJENING 17Q, duplikasjoner, delesjoner, mutasjoner og andre genomiske rearrangements. Tidligere [18], identifiserte vi forbedret uttrykk for
RPL19
mRNA i prostata cellelinjer og vev å korrelere med en aggressiv malign fenotype. Siden forhøyet
RPL19
mRNA oppstått som en av et forholdsvis lite antall sekvenser over-uttrykt i prostata cancer, har vi antatt at dets virkning var sannsynlig å være selektiv i stedet for en del av en global ikke-spesifikk heving i genekspresjon . Ribosomalt protein L19e (RPL19) representerer L19E superfamilien av proteiner, og i eukaryoter, er en komponent av det ribosomale store 60S subenhet. Genet er uttrykt i store deler av utviklingen, spesielt i eukaryoter og archaea, men er fraværende fra bakterier [19], [20] selv om det er homologi mellom sekvensene i rotte L19 og
E.coli
ribosomale proteiner L18, L30 og S2 [21] Overraskende for en slik tilsynelatende viktig genet,
RPL19
har så langt fått liten oppmerksomhet. Hos mennesker
RPL19
kart på kromosom 17 ved 17q11.2-q12 hvor det koder 9 mulige spleisevarianter. I en serie av menneskelige brystkreft biopsier,
RPL19
har blitt rapportert som blir uttrykt og co-forsterket sammen med
ErbB2 Hotell og gener
PNMT
,
PSMB3
og
NR1D1 product: [22]. Dette komplekset region som inneholder flere gener har blitt foreslått som en mulig amplicon [23], [24] som strekker seg noen ~547 kb fra
RPL19
gjennom
STRAD3 Hotell og
erbB2
til
GRB7
i regionen 17q11.2-Q12. For tiden har ingen data begrunnet dette spekulasjoner. I prostatakreft, forsterkning av erbB2 er sjeldne, blir rapportert i bare 0,04% [25] til 2% [26] av tilfellene, og derfor ikke en felles mekanisme for RPL19 over-uttrykk. Siden vår første identifisering av RPL19 i prostata kreft [18], har sitt uttrykk vist seg å definere dårlig prognose tykktarmskreft [27] og som en roman svulst antigen i lunge adenokarsinom [28].
Globale endringer i gener modulert i human prostata cancer, er blitt profilert ved hjelp av DNA-ekspresjon rekke analyse [29] som har oppdaget at forandringer i gen-ekspresjon etter selektiv oppregulering av individuelle målgener [30], [31] eller etter gen-knockdown ved hjelp av antisense [32 ] eller RNAi [33] teknologi med påfølgende transformasjon av den ondartede fenotype. De forskjellig-uttrykte gener og deres tilknyttede nettverk har blitt vurdert som biomarkører for å skille ulike prostata kreft fenotyper i henhold til adferd og respons på behandling [34]. Men en endret nivå av genekspresjon ikke,
ipso facto
, bekrefter en primær rolle i ondartet prosessen. Genomisk ustabilitet er kjennetegnet av malign transformasjon [35] og effekten av gevinst eller tap av et enkelt gen er trolig bli overført hele genomet med den konsekvens at uttrykket av andre gener blir sekundært modulert [36]. Slike endringer enten kan ha umiddelbar og aktiv relevans til den resulterende cellulær fenotype eller deres endrede uttrykket er passiv og ubetydelig. For å vurdere den funksjonelle relevansen av et bestemt gen, undertrykkelse av sin transkripsjon tillater analyse av dens umiddelbare virkninger på genom-wide uttrykk. Tidligere har vi transfektert maligne prostata epitelceller PC-3M celler med en 436 bp lange antisensoligonukleotid å banke ned uttrykk for
FABP5 Hotell som bedres ondartet svulst fenotype både
in vitro Hotell og
in vivo product: [37]. heri, har vi benyttet det mer kirurgiske teknikken av RNA-interferens (RNAi) med potensielt større spesifisitet og effektivitet, avhengig av det spesielle genet blir målrettet [38].
Vårt tidligere data [18] indikerte at ekspresjonen av
RPL19
kan være funksjonelt viktig for å fremme prostata kreft. Vi har nå testet denne hypotesen ved å selektivt redusere
RPL19
uttrykk ved hjelp av RNAi. De resulterende PC-3M celler viser en avskaffet malign fenotype både
in vitro Hotell og
in vivo
da sendt til fenotypisk vurdering og analyse av genuttrykk. Dataene støtter muligheten for en funksjonell rolle for
RPL19
, som virker innenfor et spekter av forandret genekspresjon, i å opprettholde den ondartede fenotypen av humane prostatacancerceller. Bekreftelse av et slikt scenario ville tillate selektiv terapeutisk målretting av RPL19, enten immunologisk [28] eller ved hjelp av små molekyler, for å modulere diskrete undergrupper av cellulære proteiner som er viktige arrangører av ondartede fenotype.
Resultater
siRNA knockdown av RPL19 i foreldre PC-3M celler
Transient transfeksjon.
qPCR analyse av foreldre PC-3M celler ved hjelp av primere som er definert i tabell 1 viste sterk
RPL19
mRNA uttrykk, bekreftet ved nukleotid sekvensering.
Deretter transient transfeksjon av siRNA sekvenser til
RPL19
ekson 1 (tabell 2) viste Target # 1 for å være den mest effektive sekvensen for RNA stanse, noe som reduserer sitt uttrykk til bare 7% av sitt opprinnelige nivå (figur 1A). Mens de andre sekvensene var effektive, bare kombinasjonen av alle tre samtidig var bedre enn Target # 1, alene. Deretter ble Target # 1 brukes for alle etterfølgende eksperimenter.
A. qPCR analyse av
RPL19
uttrykk nivåer etter forbigående stanse av ulike mål i PC-3M
foreldre celler. Target # 1 (T1) var den mest effektive med bare 7% rest nivå detekteres. Denne reduksjonen var bare overgås av den samtidige kombinasjon av T1 + T2 + T3. B. qPCR analyse av
RPL19
uttrykk nivåer følgende stabil stanse av Target 1 #. Disse dataene er hentet fra eksperimenter utført i tre eksemplarer. Målinger står i forhold til uttrykk av RPL19 i si-PC-3M
krafse celler. Sammenlignbare nivåer i godartede PNT2 celler er også vist. C. Morfologisk skinn av (i) PC-3M
foreldre celler og flere av koloniene (ii-iv) etter stabil knockdown av
RPL19
. Enkelte kolonier (ii) var dårlig heftende med flertallet av celler som vokser i suspensjon. Andre (iii) inneholdt overveiende multinucleate former. De fleste (iv) består celler som var mindre enn foreldrenes. Klone ST-3-celler som brukes i alle etterfølgende eksperimenter er vist i dette panelet. (Forstørrelse × 200)
Stabil transfeksjon.
Nivåer av
RPL19
mRNA ble målt i PNT2, PC-3M
foreldre, PC -3M
krafse og si-
RPL19-
PC-3M
mål # 1 forbigående transfektant celler (Figur 1b). I samsvar med den tidligere undersøkelsen [33], ekspresjon i PC-3M
krypterings-celler ble satt til enhet og relative uttrykk i de andre cellelinjer ble sammenlignet som fold-forskjeller.
RPL19
ekspresjon i PC-3M var 4,9 ganger større enn den for PNT2 celler og i overensstemmelse med våre tidligere studier bekreftet ved Northern blot-analyse [18]. I lydpot-
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 transfektant celler, uttrykk for
RPL19
ble redusert til bare 1,3 ganger større enn de PNT2 celler. PC-3M
krafse-celler viste en 2,3 gangers reduksjon i
RPL19
i forhold til PC-3M
foreldre, selv om denne verdien var ikke statistisk signifikant. Enkelt celle kloning [33] etterfulgt av qPCR og Western blotting bekreftet si-
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 uttrykte de laveste nivåene av
RPL19
mRNA og protein. Denne klon av celler ble deretter ansatt for detaljert fenotypeanalyser.
Vekst kjennetegn ved SI-RPL19cells
in vitro
kloner av transfektert si-
RPL19
-PC-3M celler dyrket under standardbetingelser viste forskjeller i morfologi (figur 1C). Sammenlignet med PC-3M
foreldreceller, si-
RPL19
-PC-3M cellene var generelt mindre tilhenger til underlaget. Men disse cellene opprettholdt en evne til å proliferere og kan være vellykket subdyrkes, selv om en stor andel av cellene forble i suspensjon. Andre si-
RPL19
-PC-3M celler viste en økning i multinucleate former, noe som tyder på nedsatt ferdigstillelse av mitose. Spredningsanalyser (figur 2A) viste at i løpet av logaritmisk vekstfase, frekvensen av celledeling ved si-
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 transfektant celler ble ikke signifikant påvirket (
p
≥0.05) sammenlignet med PC-3M
foreldre og si-PC-3M
krafse. Evnen til si-
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 celler til å invadere et ekstracellulært collagenous matriks (ECM) ble sammenlignet med den PNT2, PC-3M
foreldre og PC -3M
rykke cellelinjer (figur 2B). Antall celler som invaderte gjennom ECM var: (PNT2) 0,6 ± 0,6, (PC-3M
foreldre) 279 ± 33,7 og (PC-3M
rykke) 317 ± 28,3 (
p
0,001). Lydpot-
RPL19
-PC-3M celler viste en relativt dårlig invasiv potensial bare 60 ± 10,7 transmigrating celler (
p
0,001). Dermed tie
RPL19
redusert invasiv potensialet i PC-3M celler ca. 5 ganger. Endogene (basale) nivåer av apoptose innenfor PC-3M
foreldre og PC-3M
krafse celler (Tabell 3 og Figur 2C) var lik de som ble oppnådd under sammenlignbare studier av
PRKCZ
genet [33]. Basale nivåer av apoptose i de fire cellelinjene var ikke statistisk forskjellig (
p
0,05). Selv om følsomheten til PC-3M
foreldre og si-
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 celler til camptothecin ble ikke endret, denne agenten økt apoptose i PNT2 og PC-3M
krafse celler (
p
0,0001)
A.. Relativ vekst av cellelinjer i enlagskultur avslørende ingen statistisk forskjell i graden av spredning mellom knockdown-celler (si-
RPL19
-PC-3M
klone ST-3) og den til PC-3M
foreldre celler. B. invasjon assay
in-vitro
sammenligner de samme populasjoner av celler som de som er vist i (A) og avslører en 83% nedgang i invasiv kapasiteten til
RPL19
knockdown-celler i forhold til PC- -3M
krafse celler. C. Resting nivåer av apoptotiske indeksene var ikke signifikant forskjellig i benign (PNT2), foreldre (PC-3M) eller knockdown celler. Etter utfordringen ved camptothecin, ble ingen endring identifisert i PC-3M
foreldre eller Si
RPL19
-PC-3M
klone ST-3 celler. Mens en økning i apoptose ble funnet i godartede celler og i krypterings-transfekterte celler, disse var ikke signifikant. D. Vekst av tumorceller
in-vivo
av estimerte volum viste en meget signifikant (
p
0,005) undertrykkelse av vekst av to av de stabile kloner transfektant, i forhold til PC- -3M
foreldre og PC-3M
krafse celler. Vekst av PNT2 celler er ikke inkludert siden vi allerede har vist [33] veksten av svulster å være sjeldne, særlig over tidsspenn av disse eksperimentene. E. Analyse av tumor vekter
in vivo
bekreftet kloner ST-1 og ST-3 for å generere svulster signifikant (
p
0,005) mindre enn PC-3M
foreldre eller si-PC-3M
krafse celler. F. Immunhistokjemisk analyse av tumorer som vokser som xenotransplantater
in-vivo
støttet mRNA-nivåer dataene (figur 1B) at mens den opprinnelige PC-3M
foreldre (i) og Si-PC-3M
krafse (ii) cellene uttrykte proteinet RPL19 på høyt nivå. Lydpot-
RPL19
-PC-3M
klone ST-3 celler (iii) uttrykt RPL19 heterogent og bare svært lave nivåer. (Forstørrelse × 350)
tumorigenitet og RPL19 protein uttrykk
in vivo
I alle grupper av dyr, ble klart på dag to svulster følgende vaksinasjon (tabell 4). Men mer dukket opp tidligere i PC-3M
foreldre (3/8) og PC-3M
rykke ut (4/8) grupper. I de to transfektant klone grupper, svulster tok lenger tid å vises (2/8 svulster hos dyr som bærer lydpot-
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 celler og 1/8 svulster hos dyr som bærer lydpot-
RPL19-
PC-3M
klon # 2 celler). I utgangspunktet alle svulster var like i størrelse. Etter 7 dager på PC-3M
foreldre og PC-3M
krafse grupper utviklet større svulster enn to transfektant grupper (figur 2D). Ved obduksjon, 15 dager etter vaksinasjonen, en signifikant forskjell (
p
0,001) var tydelig i gjennomsnittsvekter for kontroll og
RPL19-
knockdown tumorer (figur 2E). PC-3M
foreldre utstilt et bredt spekter i tumor vekt, ett dyr å produsere en svulst på 810 mg i 15 dager, maksimalt tillates av prosjektet License. Motsatt, et annet dyr utviklet en svulst på kun 10 mg. Et lignende fenomen inntraff innenfor PC-3M
rykke gruppe med svulster som spenner 10-140 mg. De endelige vekter av PC-3M
foreldre svulster var ikke signifikant forskjellig fra PC-3M
rykke gruppe (Mann-Whitney U-test,
p
0,05). Således si-RNA undertrykkelse av
RPL19
påvirket av størrelsen av svulstene genererte
in-vivo plakater (
p
0,05), men ikke på deres tidsforsinkelser. Ingen mikrometastaser ble identifisert ved obduksjon eller på påfølgende histopatologisk undersøkelse av skåret vev.
Immunohistochemistry av tumorxenotransplantater oppdaget sterkt uttrykk av RPL19 protein i både PC-3M
foreldre og si-PC- 3M
krafse celler (figur 2F). Knockdown cellelinjer Si
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 og si-
RPL19-
PC-3M
klone ST-en viste relativt lite flekker, som indikerer fortsatte undertrykkelse av
RPL19
genet i de fleste kreftceller. Påvisning av små mengder av RPL19 protein i enkelte kreftceller er ansett å representere klonal variasjon som følge av fortsatt lavt-nivå ekspresjon av genet, snarere enn dens total inhibering, som er identifisert ved qPCR av cellene
in vitro
og resultatene av Western blotting-studier. Mens uttrykk av mRNA og tilsvarende protein i prostata epitel er ikke alltid konkordant [39], tilsynelatende uoverensstemmelser mellom
in vitro Hotell og
in vivo
studier kan være på grunn av
i -vivo
effekter av et området stromal matrise som påvirker tumor celle adhesjon eller til andre påvirkninger, inkludert vekstfaktorer moduler individuell lavt nivå genuttrykk [40] -. [42]
Comparative genuttrykk profilering av si- RPL19-PC-3M
klone ST-3 celler
Genome-wide uttrykk profiler fra DNA oligonukleotid mikromatriser (umodifisert Agilent human Genome 44K) ble benyttet for å identifisere gener modul følgende
RPL19
slå ned. Sammenligning av gener uttrykt av PC-3M
foreldre og PC-3M
krafse cellelinjer viste ingen statistisk signifikante forskjeller (
p
≥0.05), noe som indikerer at transfeksjon teknikken ikke var ansvarlig for nevne off-target effekter som kan skjevhet eksperimentelle data. Totalt 916 DNA-sekvenser, som representerer 768 gener ble identifisert som forskjellig uttrykt (
p
≤0.05, Benjamini og Hochberg multippel testing korreksjon brukt). Av disse 404 ble forbedret og 364 nedregulert. Innenfor denne datasettet, ble 184 forskjellige gener modulert minst fire ganger, 62 blir oppregulert og 122 nedregulert. De 50 beste differensielt-uttrykte gener i disse to kategoriene er oppsummert i saksdokumenter Tabeller S1 og S2 og grafisk (figur 3). Ekspresjonsplasmider data utledet fra gruppene ble validert ved qPCR tilveiebringe uavhengig kvantifiserbare bevis for størrelsen og retningen av forandring av enkeltgener. Observasjonen at bare 768 gener ble modulert følgende
RPL19
knockdown, med nivåene av mRNA for et bredt spekter av proteiner enten opprettholdt eller forhøyet, antyder at ribosomalt protein RPL19 differensielt involvert i proteinsyntese i stedet for å påvirke alle cellulære proteinsyntese i en ikke-spesifikk måte.
Heat kart over topp 50 gener oppregulert og Top50 genene nedregulert følgende uttrykk-profilering av mRNA uttrykkes ved si-
RPL19
-PC- 3M
klone ST-3 celler sammenlignet med PC-3M
foreldre celler ved hjelp av PC-3M
krafse celler som fellesnevner. Hierarkisk clustering vises. Grønn indikerer gener over-uttrykt i en prøve i forhold til å rykke ut-transfekterte celler. Rødt indikerer genene nedregulert i utvalget i forhold til å rykke ut-transfekterte celler. Tilsvarende numeriske data er presentert i saksdokumenter Tabeller S1 S2
Funksjonell berikelse analyse identifiserer noen 20 Gene ontologi (GO) biologiske prosessbetingelser og tre molekylære funksjon vilkår (saksdokumenter Tabell S3) som skal signifikant assosiert (
p
0,001) med knockdown (
p
0,001). I tillegg 13 KEGG trasé hadde en betydelig overrepresentasjon av gener differensielt uttrykt mellom
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 og PC-3M
scramble (Hjelpemiddel Information Table S4). Oppfinnsomhet sti-analyse ble brukt for å identifisere signifikante biologiske nettverk og stier der genene som uttrykkes differensielt som en konsekvens av
PRKC-ζ
knockdown var involvert. Den øverste fem rangeres sammenhengende trasé (Hjelpemiddel Information Table S5) og tre Gene ontologi (GO) molekylære funksjon vilkår (Hjelpemiddel Information Table S6) er svært signifikant (
p
≤10
-27) med respekt gener forskjellig uttrykt etter
RPL19
knockdown.
ribosomalt protein gener.
hypotesen om at siRNA-indusert nedregulering av
RPL19
kan bli kompensert ved modulering av andre ribosomale proteiner ble løst ved vurdering av den relative ekspresjon av mitokondrie stor ribosomalt protein gensekvenser (n = 71) og de cytoplasmiske stor ribosomalt protein gensekvenser (n = 136) til å oppdage hvorvidt opp-regulering av et gen som allerede uttrykt eller neoexpression av en tidligere taus ribosomalt protein genet hadde skjedd. Av sistnevnte årsklasse, 44 gener kodet kjente RPs, 7 var RP-lignende og 5 var RP pseudo. Antall sekvenser som representerer hvert gen varierte fra en (19 gener) til 14 (
RPL21
). RPL19 ble identifisert ved et enkelt sekvens. Ifølge SCOP (Structural Klassifisering av proteiner, siste versjon 9
th November 2010, https://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop) er RPL19 medlem av protein superoversettelses proteiner inneholder SH3-lignende fat strukturelt domene innenfor klasse bestående av alle beta proteiner. Familien inneholder også ribosomale proteiner RPL14e, RPL21e og RPL24p og C-terminale domenet til RPL2 (https://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?sunid=50104). Alternativt kan RPL19 protein erstattes av RPL29 eller RPL39e, å være strukturelt lignende medlemmer av α-heliks gruppe av globulære RPs med utvidet haler i stand til å binde mRNA [43]. Selv om svingningene skjedde i nivåene av uttrykk for individuell RPL gensekvenser følgende
RPL19
knockdown, disse var ikke signifikant, blant annet som ribosomalt protein genet
RPL23A
også plassert på kromosom 17q11.2. Bare uttrykk for mitokondrie
MRPL42
var signifikant nedregulert (
p
0,05). Ingen ekspresjon i alle RP-genet ble påvist. Dermed hemming av
RPL19
med tap av RPL19 protein ble ikke kompensert av en annen RP genet. Derimot er virkningen av å redusere
RPL19
kan være mediert av kodingen-uavhengig funksjon av genet eller dets mRNA-pseudogen [44].
glykosyltransferase-genene.
Transformasjon av epitelceller fra et godartet til en malign fenotype er ofte ledsaget av strukturelle endringer i oligosakkarid-domenene av cellulære glykoproteiner og glykolipider [45]. Spesielt uttrykk for sialylert og
β-1,6
forgrenet N-koblede oligosakkarider er nødvendig for kreft celle invasjon og metastasering [46]. Nøkkelenzymet i denne prosessen er mannosyl (
α-1,6
-) – glykoprotein
β-1,6
-N-acetyl-glucosaminyltransferase kodet av genet
MGAT5
og regulert av signalveien RAS-RAF-MAPK. Sammen med
PTEN
,
MGAT5
regulerer membran dynamikken i PI3K /Akt signal å fremme invasiv ondartet fenotype [47]. I det tilfelle at malignitet blir redusert etter manipulering av cellulær fenotype, endringer i celleoverflatestrukturer oligosakkarid postulert å forekomme. Slike endringer, mediert av glycosyltransferases kan bekreftes ved endret ekspresjon av de tilsvarende gener. Av de 768 genene forskjellig-uttrykt, ble bare to glykosyltransferase gener betydelig påvirket følgende
RPL19
knockdown (Hjelpemiddel Information Table S7). I motsetning til spekteret av glycosyltransferases modulerte følgende si-RNA knockdown av
PRKC-C,
i PC-3M celler [33], var det ingen endring tydelig i silayl- eller fucosyl-transferase gener. Men en 4-fold reduksjon ble identifisert i nivået av
MGAT4A product: (
p
0,05) som koder enzymet mannosylaglykon (
α-1,3 -) –
glykoprotein
β-1,4-
N-acetylglucosaminyltransferase og er involvert i formidling glykosylering av proteiner kodet av
SLC43A3 plakater (proteoglykan 2), SLC14A1 (urea transporter) og
SLC8A1 product: (natrium /kalsium exchanger), for derved å styre deres celleoverflate-ekspresjon. Faktisk ble alle de tre sistnevnte gener modulert følgende
RPL19
knockdown. Motsatt ble en 2~3 ganger økning identifisert i nivået av
GALNACT-to plakater (
p
0,05) som koder enzymet chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2 og overføringer N- acetylgalactosamine (GalNAc-) fra UDP-GalNAc [48] for å chondroitin, chondroitin sulfate, fortrinnsvis til komplekse oligosacfocharides inneholder
β1 → 4
sammenhengene [49], slik som de som genereres av
MGAT4A
.
ionekanaler og tilhørende genene
ondartet fenotype av prostata epitelceller kan moduleres av differensial uttrykk for ionekanaler [50] -. [52]. Undersøkelser fra dette laboratoriet [52] og andre steder [53] har etablert et funksjonelt forhold mellom spenningsstyrte ionekanaler og invasive fenotype av prostatakreftceller [50]. Avhør av uttrykket arrays avdekket flere ionekanaler og noen tilhørende gener som skal moduleres følgende
RPL19
knockdown (Hjelpemiddel Information Table S3). Kaliumkanaler viste en blandet respons. Spenningen-gated K
+ kanal alfa- og beta-underenheter (
KCNQ2 Hotell og
KCNAB2
) ble nedregulert 3,5- og 2,25 ganger, henholdsvis (
p
0,05 for begge). Den innadlikeretter K
+ kanaler (
KCNJ6 Hotell og
KCNJ12
) viste en blandet respons, blir oppregulert 5,5 ganger og nedregulert 2,5 ganger i henholdsvis (
p
0,01 for begge). To spenningsstyrte Na
+ kanal gener (
SCN3A Hotell og
SCN9A
) var begge oppregulert, 9 ganger (
p
0,005) og 2,3 ganger (
p
0,05), henholdsvis. Til slutt, to spennings gated Cl
– kanaler /Cl
– H
+ antiport transportører (
CLCN4 Hotell og
CLCN5
) var begge oppregulert, 2.1 og 1,8 ganger, henholdsvis (
p
0,05 for begge).
Andre gener og tilhørende nettverk
Ingen av cellesyklus kontroll gener, inkludert. 31 vi tidligere viste å være forbundet med en høy sannsynlighet for prostatakreft progresjon [54] ble modulert i deres uttrykk etter knockdown eller
RPL19
. På tilsvarende måte ingen av gener kjent for å mediere apoptose ble modulert på transfektanter. Av de 19 sekvenser som dekker caspase familie av apoptose gener,
CASP1
ble nedregulert ~ 7 ganger (
p
0,005) etter
RPL19
knockdown. Uttrykket av andre medlemmer av familien ble ikke endret. Til støtte for tabelldata, bekreftet Western blotting som spaltede caspases -3 og -9 ble ikke uttrykt enten i PC-3M
foreldre eller lydpot-
RPL19-
PC-3M
klone ST-3 transfektant celler. Disse funnene støtter forslaget om at å endre uttrykk for
RPL19
verken påvirker cellesyklus eller apoptotiske veier. Motsatt, de store banene påvirket følgende
RPL19
knockdown involvere nettverk av gener som regulerer homeostase og samspillet mellom de ondartede cellene og deres omgivelser (figur 4). Som et eksempel kan ekspresjon av regulatoren genet
AGR2
vi identifisert til å være forhøyet i prostata kreft i aggressiv fenotype [55] ble nedregulert ~11-fold (
p
0,02) følgende
RPL19
knockdown. Produktet av dette genet binder seg til reseptoren ErbB3 og er regulert av gaffelhode DNA-bindende transkripsjonelle regulatorer Foxa1 og Foxa2. Western blotting bekreftet avskaffelse av dette proteinet i knockdown celler (figur 5), som støtter tabelldata (Hjelpemiddel Informasjon Tabeller S1 S2). I kontrast, HOXB13 koder for en transkripsjonsfaktor som tilhører homeobox genet familie som vi viste å være en vev-spesifikk biomarkør for godartet og ondartet prostata epitel [56] ble forhøyet ~3 ganger (
p
0,001 ) etter
RPL19
knockdown.
Analyse av gener modulerte følgende
RPL19
knockdown identifisert fem sammenhengende trasé hovedsakelig påvirket (Hjelpemiddel Information Table S5). Fire av disse inkluderer gener som koder for MMP-enzymer (A); den ICAM1-inte kompleks (B); den NFkB kompleks (C) og PI3K regulering (D). Denne analysen bekreftet flere gener som moduleres av nedregulert uttrykk for
RPL19
til å være sammen, understreker de mange trasé for krysstale mellom tilsynelatende forskjellige biologiske prosesser.
I disse studiene sammenligningen ble gjort med si-
PRKC-ζ
-PC-3M
T1-6 [33] og si-
FABP5
-PC-3M
klone 3 [62] RNAi-knockdown celler for å bekrefte at endringer i proteinnivået var bestemt til
RPL19
knockdown og ikke en del av en generell respons på genet hemming ved hjelp av si-RNA. Etter farging med primære antistoffer, membraner ble re-farget for beta-aktin. Intensiteten til dette båndet ble anvendt for å normalisere de enkelte proteinnivåer. A. RPL19: Følger
RPL19
knockdown, nivåer redusert til ~ 5% av de som er i PC-3M
foreldre celler, mens nivåene ble opprettholdt i si-
PRKC-ζ-
PC -3M
T1-6 og si-
FABP5
-PC-3M
klone 3 celler. B. S11A4: Levels ble opprettholdt i alle cellelinjer, er upåvirket av
RPL19
knockdown.
