Abstract
Evnen tetra
O
metyl nordihydroguaiaretinsyre (M
4 N) for å indusere rask celledød i kombinasjon med etoposid, Rapamycin eller UCN-01 var undersøkt i LNCaP-celler, både i cellekultur og dyreeksperimenter. Mus behandlet med M
4N medikamentkombinasjoner med enten Etoposide eller Rapamycin viste ingen tegn på svulst og hadde en 100% overlevelsesrate 100 dager etter tumor implantasjon. Til sammenligning alle andre kjøretøyer eller enkelt medikament behandlet mus ikke klarte å overleve lenger enn 30 dager etter implantasjon. Denne synergistiske forbedring av anticancer virkning ble også bekreftet i mer enn 20 cancercellelinjer. I LNCaP-celler, M
4N ble funnet å redusere cellulære ATP-innholdet, og undertrykke NDUFS1 uttrykk mens indusering av hyperpolarisering av mitokondriemembranpotensialet. M
4N-behandlede celler manglet autofagi med redusert uttrykk for BNIP3 og ATG5. For å forstå mekanismene for denne anticancer aktivitet av M
4N, virkningen av dette stoffet på tre kreftcellelinjer (LnCap, ASPC-1, og L428-celler) ble ytterligere undersøkt via transcriptome og metabolomikk analyser. Metabolomic Resultatene viste at det var reduksjoner på 26 metabolitter essensielle for energiproduksjon og /eller produksjon av cellulære komponenter felles med disse tre cellelinjene følgende 8 timer med M
4N behandling. Dyp RNA-sekvensanalyse viste at det var seksten gener hvis uttrykk ble funnet å være modulert etter 6 timer med M
4N behandling på samme måte i disse tre cellelinjer. Seks av disse 16 gener var funksjonelt relatert til de 26 metabolittene som er beskrevet ovenfor. En av disse up-regulerte gener koder for CHAC1, et viktig enzym som påvirker stress trasé gjennom sin degradering av glutation. Faktisk M
4N ble funnet å undertrykke glutation innhold og indusere reaktive oksygenarter produksjon. Dataene samlet indikerer at M
4 N har dyptgripende konkrete negative konsekvenser for et bredt spekter av kreft metabolisms som støtter bruk av M
4 N kombinasjon for kreftbehandling
Citation. Kimura K, Huang RCC ( 2016) tetra
O
metyl nordihydroguaiaretinsyre Grovt Undertrykker Cancer Stoffskifte og synergi fremkaller sterke Anticancer aktivitet i kombinasjon med Etoposide, Rapamycin og UCN-01. PLoS ONE 11 (2): e0148685. doi: 10,1371 /journal.pone.0148685
Redaktør: Han-Chung Wu, Academia Sinica, TAIWAN
mottatt: 22 oktober 2015; Godkjent: 20 januar 2016; Publisert: 17 februar 2016
Copyright: © 2016 Kimura, Huang. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i papir og dets tilleggsinformasjon filer. Studiene ble sendt til NCBI BioSample database og ble tildelt følgende BioSample Tiltredelser: SAMN04407347 (LNCaP-M4N-RNA), SAMNO4407348 (LNCaP-Ctrl-RNA), SAMN04407349 (ASPC-en-M4N-RNA), SAMN04407350 (AsPC- 1-Ctrl-RNA), SAMN04407351 (L42 8-M4N-RNA) og SAMNO 4407 3 52 (L428-Ctrl-RNA)
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health ( R01DE12165), Biocuremedical, LLC, og Dorothy Yen Trust (P 690-C25-2407) til RCH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Ru Chih C. Huang er en rektor oppfinner og Kotohiko Kimura er en oppfinner av en patentsøknad «Termeprocol med 7-Hydroxystaurosporine» (PCT WO 2011/103586 A2 – patent lov 1 april 2015). Dr. Huang er også en rektor oppfinner av flere JHU patenter på M4N. JHU har leid stoffet (M4N, Terameprocol) relaterte patenter, men ikke denne PCT WO 2011/103586 A2 til Erimos Pharmaceuticals fram til 2017. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Vi har tidligere rapportert at tetra
O
metyl nordihydroguaiaretinsyre (M
4 N), også kjent som EM1421 og terameprocol, besatt antiviral og anti-kreft aktiviteter [ ,,,0],1-4] og at M
4N kan være potensielt anvendelig som et anticancer medikament. Vi viste også at en av hoved farmakologiske aktiviteter av M
4N var å inhibere aktiviteten av transkripsjonsfaktor SP1 ved binding til GC-rike regioner (SP1 konsensussekvenser) av gen-promotorer kompetitivt med SP1 [4]. Det ble også funnet at M
4N, på grunn av denne aktivitet, var i stand til å undertrykke SP1-regulert
CDK1
ekspresjon og for å forårsake cellesyklus-stans i G2-fasen av cellesyklusen [4], hvilken delvis gitt en forklaring på M
4N induserte anticancer aktivitet, som uregulert vekst anses for å være ett av kjennetegnene ved kreft. I tillegg til Wang et al. viste at overekspresjon av SP1 lettes utvikling og progresjon av magekreft [5], som tyder på at ytterligere undertrykkelse av SP1-regulerte transkripsjons kan indusere anticancer aktivitet. Annet enn disse studiene på transkripsjonshemming, har det vært, men få studier relatert til de farmakologiske aktiviteter M
4 N. Mest spesielt Pardini et al. viste at nordihydroguaiaretinsyre (NDGA, en forløperforbindelse M
4N) inhiberte den mitokondrielle elektrontransportsystem og undertrykt oksidativ fosforylering [6-7]. NDGA var en kandidat kreft agent, men det ble til slutt vist seg å være klinisk upassende på grunn av sin betydelig bivirkning. På grunn av likheten i molekylstruktur mellom M
4 N og NDGA (fig 1A), disse data om NDGA er relevant for våre studier på M
4 N. Samlet er disse tidligere funn av M
4 N synes å indikere at M
4 N kan ha flere farmakologiske aktiviteter.
A. Molekylstrukturene nordihydroguaiaretinsyre (NDGA) og tetra-O-metyl nordihydroguaiaretinsyre (M
4N). B: Synergistisk celledød induksjon i LNCaP vevskulturceller. C: kontroll, E: Etoposid (20 mm), Ra: Rapamycin (20 mm), U: UCN-01 (2 mm), M: M
4 N (80 mm), ME: M
4 N + Etoposide, MR: M
4 N + Rapamycin, MU: M
4 N + UCN-01. Den celledød ble målt ved TUNEL-analysen og Trypan blå eksklusjon assay ved 24 timer etter behandling. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD in triplo. C: En Chou-Talalay plott for TUNEL-positive celledød indusert av kombinasjonsbehandlinger i LNCaP-celler. Kombinasjon indeks (CI) 1, 1, og 1 indikerer synergisme, additiv effekt, og antagonisme. D: Effekt av kombinasjonsbehandlinger M
4N med Etoposide eller Rapamycin på overlevelse av nakne (nu /nu) mus implantert med orthotropically LnCap tumorer. Prosentandelen av mus som har overlevd ved datoen etter tumorinokulasjon ble vist for hver gruppe.
M
4 N er for tiden i fase I /II kliniske studier hos pasienter med forskjellige avanserte kreft [8 , 9]. Resultatene av disse kliniske forsøk hittil tyder på at M
4N har en viss grad av anticancer aktivitet, men var ikke i stand til å indusere remisjon i en hvilken som helst av slike pasienter med avansert kreft. En av de mest hyppig forsøkt strategi for å øke anticancer effekt av cytostatika er kombinasjonsbehandling med en eller flere passende valgte medikamenter [10]. Et viktig funn fra de kliniske studiene med M
4N er at giftigheten av medikamentet var meget lav [8, 9]. Pasienter som var i stand til å tolerere høye doser av M
4N med minimale bivirkninger, som gjør dette stoffet meget egnet til å brukes i multimedikament behandlinger (for eksempel LD
50 M
4N for mus er større enn 1000 mg /kg, mens det av NDGA er bare 75 mg /kg [11, 12]). Optimalisering av multimedikament behandlinger krever dyp kunnskap om farmakologiske mekanismer kreft virkninger av de legemidler som skal anvendes i kombinasjon. Men den nøyaktige mekanismen for anticancer aktivitet av M
4 N er fortsatt i stor grad ukjent. Vanskeligheten med å forstå farmakologi av M
4N er forankret i det faktum at dette stoffet kan forventes å påvirke flere biokjemiske aktiviteter siden den farmakologiske målet, SP1 transkripsjonsfaktor, styrer et stort antall hus-holde gener [13]. Som et spørsmål om faktum, en undersøkelse av 22,633 kjente gener i Ensemble Human Genome database (https://www.ensembl.org/index.html) indikerte at litt over halvparten (52,5%) inneholdt SP1 bindende motiv i deres umiddelbare (500bp) oppstrøms regioner.
i denne studien, vi først utøves vårt beste for å finne visse medikamentkombinasjoner med M
4 N som oppnådde lovende kreft effekt i vevskultur og mus xenograft eksperimenter. Gjennom dette arbeidet lykkes oppdaget vi at M
4 N kombinasjonsbehandling med Etoposide og Rapamycin var i stand til å fullstendig utrydde orthotopically implantert LNCaP avledet svulster og metastaser i nakne mus. M
4 N kombinasjon behandlet mus hadde en 100% overlevelsesrate 100 dager etter tumor implantasjon. Til sammenligning alle andre kjøretøyer eller enkelt medikament behandlet mus ikke klarte å overleve lenger enn 30 dager etter implantasjon. Dette illustreres den ekstraordinære potensialet evne M
4 N for å forbedre kreft effekt av kombinasjonsbehandlinger. For å forstå de farmakologiske mekanismer som er involvert, undersøkte vi de biokjemiske og fysiologiske virkninger av M
4N behandling på kreftceller med hjelp av high-throughput screening metoder så som GC /LC-MS (gass-kromatografi /væske-kromatografi-massespektroskopi) -basert metabolitt analyse og dyp RNA sekvensering. Siden målet molekyler av M
4 N kan være mange på grunn av beskaffenheten av den farmakologiske aktivitet som en SP1-hemmer, til high-throughput screening med sin kraft samle inn informasjon om statusen for et stort antall metabolitter og mRNA på en gang var svært nyttig å dechiffrere den komplekse natur M
4 N aktivitet. Vår undersøkelse hittil har vist at det var en betydelig reduksjon av metabolitter essensielle for tumorvekst i alle tre cancercellelinjer undersøkt etter en kort periode med M
4N behandling, og som synergistisk induksjon av caspase spalting og hurtig reaktive oksygenarter produksjons skjedde da M
4 N ble brukt sammen med andre kreft narkotika i kombinasjon.
Resultater
Synergistic induksjon av anticancer effekt av M
4N-basert kombinasjonsbehandlinger
Vi evaluerte bruken av M
4 N i flere narkotikakombinasjonsbehandlinger ved hjelp av cellekulturforsøk og nude mus xenograft studier. I disse studiene har vi brukte LNCaP human prostatacancer-cellelinje som en hoved eksperimentelt materiale, siden det har blitt brukt i dyremodeller av metastatisk prostata kreft [14]. I tillegg har det blitt vist at kreft genetiske mutasjoner ofte forekommet i LNCaP-cellelinjen [15], som tyder på denne cellelinjen oppfører seg på samme måte som kreft i kliniske sammenhenger som ofte gjennomgår forskjellige genmutasjoner under progresjon [16]. Som et pilotforsøk for å bestemme den mest hensiktsmessige legemidler som skal anvendes i kombinasjon med M
4N for kliniske anvendelser, valgt vi tre anticancer medikamenter, nemlig Etoposide [17], rapamycin [18], og UCN-01 [19] og evaluert anticancer effekt av kombinasjonsbehandlinger med disse stoffene i LNCaP-celler ved anvendelse både TUNEL-analysen og Trypan blå eksklusjon assay. Resultatene (figur 1B) viste at M
4 N synergi indusert celledød med alle tre kreftmedisiner undersøkt. En Chou-Talalay tomten [20] bekreftet at alle kombinasjonsbehandlinger var sterkt synergistisk (fig 1B). I tillegg kan mengden av celledød detekteres av Trypan blå eksklusjon assay langt overskredet som påvist ved TUNEL assay (figur 1 A), noe som indikerer at TUNEL-negative celledød spilte en viktig rolle i den synergistiske celledød, spesielt i M
4N kombinasjonsbehandling med Rapamycin. Kombinasjonen behandlinger var effektive i et panel av kreftcellelinjer som ble valgt for deres genetiske mangfold (S1 fig). Synergistic død, ble imidlertid ikke observert i HL-1, en normal mus hjertemuskelcellelinje (vår upubliserte data). Dosereduksjon indeks (DRI) for LNCaP celler ble vist i S2 fig. Fordelen med kombinasjonsbehandlingene ble også evaluert med xenograft mus med LNCaP svulster. Overlevelsesraten kurve (Fig 1 D) indikerte at alle de LNCaP tumorbærende mus som mottok en kombinasjon av M
4N med Etoposide eller Rapamycin overlevde etter 100 dager etter tumor-implantering, mens ingen av de som ble behandlet med et enkelt medikament levde utover 34 dager på grunn av flere metastaser [21]. I tillegg flere andre xenograft mus eksperimenter bekreftet at M
4N-basert kombinasjonsbehandlinger var effektive i mange andre enn LNCaP celler [22] kreftcellelinjer. Dataene samlet viste en overlegenhet kombinasjonsbehandlinger i forhold til enkeltmedikamentelle behandlinger og også det viste at M
4 N syntes å fungere godt med ulike legemidler som farmakologiske mekanismer for sin anticancer aktivitet var svært forskjellige fra hverandre.
den kombinerte behandlingen med M
4 N induserer caspase-7 cleavage
for å utforske mulige involvering av caspases i celledødsmekanismer M
4 N kombinasjonsbehandlinger [23], vi undersøkte caspase cleavage profilen LNCaP celler etter enkeltmedikament (M
4 N, Etoposide, Rapamycin eller UCN-01) og M
4 N kombinasjon (M
4 N /Etoposide, M
4 N /Rapamycin, og M
4 N /UCN-01) behandlinger av Western blot analyse. Etter single-medikamentelle behandlinger, UCN-01, men ikke Etoposide eller Rapamycin aktivert sterkt caspases-9, -3 og -7 (Fig 2AA og 2AB). På den annen side ble bare en liten mengde av caspase-9 og -3-aktivitet påvist etter en hvilken som helst av M
4N kombinasjonsbehandlinger (fig 2AA). Tilsynelatende M
4N blandet med evnen til å UCN-01 for å aktivere caspase-9 og -3. Tvert imot, det western blot analyse av caspase-7 (Fig 2AA) viste at M
4N ikke hindre spaltning av dette caspase ved UCN-01. Videre spaltning av caspase-7 har også forekommet følgende M
4 N /Etoposide behandling og i mindre grad følgende M
4 N /Rapamycin behandling (Fig 2aa og 2ab). Den kolorimetriske analysen for caspase-7-aktivitet (figur 2B) bekreftet resultatene av Western blot-analyse (Fig 2aa og 2ab). Disse data samlet indikerer at kombinasjonsbehandlingene aktivert kaspase-7 mye mer enn en enkelt behandling. Interessant enten UCN-01 behandling eller noen av M
4N kombinasjonsbehandlinger gitt to forskjellige caspase-7 fragmenter, en stor (P30) og en liten (p17) fragment (Fig 2AA og 2AB). Boucher
et al
. viste at en av de viktigste funksjoner av kaspase-7 var å spalte og inaktivere poly-ADP-ribose polymerase (PARP) [24]. Av denne grunn vi undersøkte spalting av PARP i cellene behandlet med M
4N-basert kombinasjonsbehandlinger. Dataene (fig 2AA) viste at alt i alt en betydelig større PARP-spaltning ble observert for cellene som ble behandlet med kombinasjonsbehandlinger enn én medikamentbehandlinger. I tillegg viser dataene også at kombinasjonsbehandlingen av M
4N med Etoposid eller UCN-01 ga en større mengde av både p89 og p24 fragmenter enn det med Rapamycin. Denne informasjonen avtalt med caspase-7-relaterte data (Fig 2A og 2B) som indikerer at caspase-7 aktivitet var større med kombinasjonsbehandling som inneholder Etoposide eller UCN-01 enn med Rapamycin
AB. Analyse av caspase -avhengige celledød mekanismene indusert av kombinasjonsbehandlinger M
4 N med Etoposide, Rapamycin eller UCN-01. Aa Ab: Spalting av caspase-3, -4, -7, -9 og sammen med poly-ADP-ribose polymerase (PARP) i LNCaP-celler behandlet ved kombinasjonsbehandlingene i 17 timer. p-aktin ble benyttet som en kontroll. B: Caspase-7 enzymatisk aktivitet i LNCaP-celler behandlet ved kombinasjonsbehandlingene i 13 timer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD in triplo. A B: C: kontroll, E: Etoposid (10 mm), Ra: Rapamycin (10 mm), Ra30μM: Rapamycin (30 mm), U: UCN-01 (2 mm), M4N: M
4N (80 mikrometer ), og Casp: caspase. C: Effekt av kombinasjonsbehandlinger på mitokondriemembranen potensial (ΔΨ
m). LNCaP-celler ble behandlet med M
4N (80 pM) i kombinasjon med Etoposid (10 uM), Rapamycin (10 uM), eller UCN-01 (2 uM) i 4 timer. Den ΔΨ
m ble målt ved hjelp av JC-1 fargestoff. Bildet viser hvordan forholdene oppnås ved å dele intensiteten ved 568 nm-eksitasjon lys (J-aggregater) ved at ved 488 nm-eksitasjon lys (J-aggregater + monomer). Fargen søylen vises på høyre side av figuren (H: høy, L: lav ratio).
Aktivering av mitokondriene-assosiert caspase-9/3 avhengig celledød mekanismen er vanligvis forbundet med depolarisering av mitokondriemembranen potensial (ΔΨ
m) [25]. Av denne grunn neste gjennomførte vi forsøk med JC-1 fargestoff til å måle ΔΨ
m (Fig 2C). De JC-1-dye Forsøkene viste at UCN-01 behandling, men ikke Etoposide eller Rapamycin behandling indusert depolarisering av den ΔΨ
m i løpet av kort tid. Enda viktigere det viste også at M
4 N indusert hyperpolarisering av ΔΨ
m og hindret depolarisering av ΔΨ
M indusert av UCN-01.
M
4 N behandling nedregulerer autofagi
autophagy er en prosess som degraderer skadede eller unødvendige cellulære komponenter i den hensikt å resirkulere dem som ressurser, og aktiveres ved næringsmangel forhold som en del av cellulære forsvarsmekanismer [26]. LC3B-ll ekspresjon er allment kjent for å korrelere godt med autophagic aktivitet og benyttes som en indikator for autofagi [27] .western blot-dataene (figur 3A) viste at M
4N trykkes LC3B-II net dannelse nesten fullstendig, noe som indikerer at M
4 N hemmet autofagi. Neste undersøkte vi effekten av M
4 N på uttrykk for BNIP3 av nordlige og vestlige blotting. BNIP3 er et BH3-bare proteiner og er kjent for å være involvert i både apoptose og autofagi [28-30]. Fordi BNIP3 er induserbar ved hypoksi, var dens uttrykk undersøkt under både normoksisk og hypoksiske forhold. Behandling med M
4N i 6 timer effektivt reduserte både mRNA og protein ekspresjon av BNIP3 (figur 3B og 3C), noe som indikerer at M
4N trykkes
BNIP3
ekspresjonen på transkripsjonsnivået. Dataene viser også at M
4 N var i stand til å undertrykke basal samt hypoksi-indusert uttrykk for
BNIP3
til nesten null (Fig 3C). I tillegg Western blotting (fig 3C) viste at M
4N ikke endre ekspresjonen av BNIP3L, et protein relatert til BNIP3 [28]. Effekten av M
4 N på uttrykk for ATG5, en nøkkelkomponent for autofagi maskiner [31], ble deretter undersøkt og western blot analyse (figur 3D) viste at M
4 N undertrykte betydelig ATG5 uttrykk i mindre enn 18 timer . Dataene dermed vist at M
4 N trykkes autofagi ved å modulere flere cellulære komponenter avgjørende for autophagic mekanismer som ATG5 og BNIP3
A:. Effekt av M
4 N på autofagi i LNCaP celler. Ekspresjonen av LC3B-I og II ble undersøkt ved western blotting i LNCaP-celler ble behandlet med kombinasjonsbehandlinger M
4N med etoposid, rapamycin, eller UCN-01 i 18 timer i nærvær av bafilomycin A
1 ( 100 nM), en autophagosome nedbrytningsinhibitor. Bafilomycin A
1 ble tilsatt for å måle den netto aktivitet av autophagy. Konsentrasjonene av M
4N, etoposid, rapamycin, og UCN-01 var 80, 20, 20, og 5 uM, respektivt. C: Control, E: etoposid, Ra: rapamycin, U: UCN-01. B: mRNA uttrykk for
BNIP3
genet, undersøkt av Nord-blotting, i LNCaP celler behandlet med M
4 N (80 mikrometer) under normoksiske eller hypoksisk tilstand for 2 eller 6 timer. Hyp: hypoksisk tilstand. C: Uttrykket av BNIP3 og BNIP3L, undersøkt av den vestlige blotting, i LNCaP celler behandlet med M
4 N (80 mikrometer) under normoksiske eller hypoksisk tilstand for 6 eller 18 timer. D: Ekspresjon av ATG5, undersøkt ved Western-blotting, i LNCaP-celler ble behandlet med M
4N (80 uM) i 18 timer. β-Actin ble brukt som kontroll.
M
4 N bredt modulerer metabolske veier
For å forstå mekanismen av synergi i anticancer effekt (fig 1, S1 fig) , cellulære innholdet i biokjemiske metabolitter og profiler for mRNA ble undersøkt søker etter mulige fysiologiske endringer følgende M
4 N behandling i LNCaP human prostatakreft, ASPC-en menneskelig kreft i bukspyttkjertelen, og L428 menneskelige Hodgkin lymfom celler. Først undersøkte vi effekten av M
4 N på metabolitt innholdet i disse cellene (utført av Metabolon, Co. Ltd) [32]. Metabolitten analysen (S1 tabell) viste bred påvirkning av M
4 N på ulike prinsipielle stoffskifte. Siden mangel av bestemte metabolitter har flere betydelige konsekvenser for cellulær fysiologi enn overflod av dem, valgte vi metabolittene som cellulære innholdet ble konsekvent redusert med M
4 N i minst to av tre cellelinjer og uforandret eller ubestemte i tredje (figur 4).
LNCaP, ASPC-1 og L428-celler ble behandlet med M
4N (80μM) i 8 h og metabolitt innholdet i prøvene ble målt ved hjelp av LC /GC-massespektroskopi ved Metabolon (S1 tabell). Blant de metabolitter ble undersøkt, kun metabolitter hvis innhold var signifikant (p≤0.05) undertrykt ved M
4N i minst to av tre cellelinjer ble valgt ut og vises her i henhold til den ytterligere forutsetning at virkningen av M
4N på innholdet av metabolitter i den tredje cellelinjen var en undertrykkelse, ingen vesentlig endring, eller ikke undersøkt. «M /C «indikerer at forholdet mellom metabolitt innholdet for prøvene som ble behandlet med M
4 N vs. kontroll. N.A. indikerer «data ikke tilgjengelig «. Unntakene for disse reglene var ADP og UDP-glukose (hvis innhold ble begge undertrykket ved M
4N i to av de tre cellelinjer, men forskjellen var statistisk signifikant bare i en av de to cellelinjer. I det tredje cellelinjen dataene var ikke tilgjengelig). Tallene for forholdet skyggelagt i grønt indikerer at metabolitt innholdet var statistisk mindre i de behandlede prøvene enn kontrollgruppen, mens de uten nyanser tyder på at det ikke var en statistisk forskjell mellom kontroll og de behandlede prøvene.
Mange TCA syklus-relaterte metabolitter (citrate, succinate, fumarat, og malat) ble oppbrukt av M
4 N behandling (figur 4). Bare innholdet av α-ketoglutarat økte svakt med M
4 N blant TCA-syklus-relaterte metabolitter (S1 Table). Effekten av M
4N på glykolysen /glukoneogenese-relaterte metabolitter var variabel, avhengig av cellelinjen (S1 tabell) selv om innholdet av glukose-6-fosfat og glukose-1-fosfat ble gående redusert med M
4N behandling (fig 4). Glukose-1-fosfat omdannes til UDP-glukose ved glukosyltransferase reaksjoner med UTP. Innholdet av både UDP-glukose og UTP ble redusert med M
4N også (figur 4), noe som indikerer at metabolismer relatert til glukose-6-fosfat /glukose-1-fosfat /UDP-glukose ble samlet trykt av M
4 N. Innholdet av 3-fosfoglycerat, en nøkkel metabolitt i glykolysen /glukoneogenese vei, ble signifikant økt med M
4N i LNCaP-celler, men ikke i ASPC-1 eller L428-celler, mens innholdet av pyruvat, som også er en nøkkel glykolyse metabolitt, ble betydelig økt med M
4 N i ASPC-1 og L428 celler, men ikke i LNCaP celler (S1 Table). Dette indikerte at selv om effekten av M
4N på glykolyse-relaterte metabolitter var variabel avhengig av cellelinjer, M
4N stanset glykolyse i alle tre cellelinjene undersøkt og samlet noen glykolyse-relaterte metabolitter slik som 3-fosfoglycerat og pyruvat. I mellomtiden innholdet av laktat var konsekvent redusert med M
4N behandling (figur 4), noe som indikerte at omdanningen av pyruvat til laktat ble undertrykket ved M
4N. I konklusjonen, data relatert til karbohydratmetabolisme (Fig 5A) samlet viste at M
4 N redusert innholdet av TCA syklus-relaterte metabolitter mens akkumulere visse glykolyse-relaterte metabolitter, og dermed indusert cataplerosis (cataplerosis er her definert som en metabolsk tilstand som oppstår under mangel av TCA-syklus-relaterte metabolitter) [33]
A:. Et skjema for glycolysis-, TCA-cycle-, og mitokondrielle elektrontransportsystem relatert metabolsk reaksjonsvei. Rådata av metabolitten analysen er vist i tabell S1. Utvelgelsen av S1 tabell kan finnes i figur 4. De oppadrettede pilene indikerer at innholdet av metabolittene forbundet med disse pilene var signifikant (p≤0.05) indusert ved M
4N i minst to av tre cellelinjer (LNCaP, ASPC-1, og L428-celler) under den ytterligere forutsetning at virkningen av M
4N på innholdet av disse metabolittene i den tredje cellelinjen var en induksjon uten statistisk signifikant forskjell, ingen vesentlig endring, eller ikke undersøkt . Imens nedover peker pilene indikerer at innholdet av metabolittene forbundet med disse pilene var signifikant (p≤0.05) undertrykkes av M
4 N i minst to av tre cellelinjer (LNCaP, ASPC-en, og L428 celler) under ytterligere betingelse at virkningen av M
4N på innholdet av disse metabolittene i den tredje cellelinjen var en undertrykkelse uten statistisk signifikant forskjell, ingen vesentlig endring, eller ikke undersøkt. Unntakene for disse reglene er glukose-6-fosfat (hvis innhold ble undertrykket ved M
4N i alle tre cellelinjer, men forskjellen var statistisk signifikant bare i L428-celler), 3-fosfoglycerat (hvis innhold var signifikant indusert ved M
4N i LNCaP men ikke i ASPC-1 og L428 celler) og pyruvat (hvis innhold ble betydelig indusert av M
4 N i ASPC-1 og L428 celler, men undertrykte betydelig i LNCaP celler). 3-fosfoglycerat og pyruvat er merket med tilhørende oppoverrettede pilene fordi dataene (S1 tabell) viste at M
4N akkumulert disse metabolittene og fastlåste glykolyse, men hvor M
4N påvirkes disse metabolittene ble varierer avhengig av cellelinjen (se teksten). Effekten av M
4N på ATP-innholdet i de hele celler er vist i figur 6A. Effekten av M
4N på NDUFS1 ekspresjon er vist i figur 6C. Resultatet indikerer økning i mRNA-ekspresjon av fosfoenolpyruvat carboxykinase 2 (PCK2) og asparagin syntase (bilsportforbund) av M
4N (80 pM) behandling i 6 timer ble fra dype RNA-sekvensanalyse er vist i tabell 1. B: Et skjema for lipid metabolismen. Betydningen av oppover og piler som peker nedover i dette skjemaet er de samme som i skjemaet for glucolysis-, TCA-cycle-, og mitokondrielle elektrontransportsystem relaterte metabolismen (Fig 5A). Langkjedede fettsyrer acyl-karnitin omfatter palmitoylcarnitine (16: 1) og oleoylcarnitine (18: 1). Når fettsyrene brytes ned gjennom β-oksidasjon syklus, de trenger å bli konvertert til acyl-Carnitines skal transporteres inne i mitokondriene. Dermed dataene indikerte at M
4 N bør undertrykke β-oksidasjon syklus ved å redusere produksjonen av langkjedede acyl-Carnitines.
metabolitten data viser også at M
4 N betydelig redusert innhold av aspartat i alle tre cellelinjer (Fig 4). Siden aspartat fremstilles enten fra oksaloacetat av en transaminering reaksjon eller fra fumarat gjennom adenylosuksinat, M
4N-mediert cataplerosis (figurene 4 og 5A) var en årsak til redusert produksjon av aspartat [33]. Metabolitten data videre viste at M
4 N modulert lipidmetabolismen også. Selv M
4N forskjellig modulerte innholdet av forskjellige typer av lipider, avhengig av cellelinjer (S1 Table), M
4N gående reduserte innholdet av langkjedet acyl-carnitin som palmitoylcarnitine og oleoylcarnitine (figur 4) og øket innholdet av karnitin og dets derivater i alle tre cellelinjer (S1 Table). Siden langkjedet acyl-karnitin er viktig for transport av langkjedede fettsyrer throughthe mitokondriemembranen [34] dataene indikerte at M
4N bør redusere β-oksidasjon av fettsyrer (figur 5B).
M
4 N undertrykker energiomsetningen
Pardini
et al
. viste at NDGA, en forløperforbindelse hvorpå M
4N var basert på, hemmet mitokondrielle elektrontransportsystem [6-7], noe som tyder på at M
4N kan modulere energimetabolismen (figurene 4 og 5, og S1 Tabell ) gjennom en virkning på mitokondriene. For å teste denne hypotese, ble en luminescens-baserte enzymatisk assay gjennomført for å måle hele cellen ATP-innholdet i LNCaP-celler ble behandlet med M
4N. I analysen (figur 6A) viste at M
4N betydelig redusert ATP-innholdet i 5 timer. AMPK er kjent for å virke som en cellesignale sensor for ATP, ADP, AMP og til å bli aktivert og (fosforyleres) når forholdet mellom AMP /ATP-innholdet er høyt [35, 36]. Forholdet AMP /ATP ble utvidet med M
4N behandling siden AMP-innholdet var uforandret ved M
4N behandlingen i henhold til metabolitten assay (S1 tabell). Som forventet ble det western blot analyse som M
4 N indusert uttrykk for både total AMPK og dens fosforylert form (T174) i 5 h (figur 6B), noe som indikerer at AMPK ble aktivert av M
4 N og M
4N-behandlede celler ble sultet for ATP. NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S-protein 1 (NDUFS1) er en subenhet av mitokondriell kompleks I. Det er blitt vist at aktiviteten til elektrontransportsystemet er undertrykt når det gen som koder for dette proteinet er mutert [37]. Vi har funnet at ekspresjonen av NDUFS1 ble undertrykt i LNCaP-celler etter 5 timer av M4N behandling (figur 6C), som indikerer at M
4N var i stand til å interferere med visse komponenter i elektrontransportsystemet. Hyperpolarisering av ΔΨ
m er generelt ansett å være en tilstand som er forbundet med blokkering i elektrontransportsystemet og lav ATP generasjon [38]. Derfor er et resultat av de JC-1 fargestoff eksperimentene beskrevet ovenfor (figur 2C), så vel som andre mitokondrier relaterte data som er beskrevet her (fig 6) understøttet den nevnte forutsetning at M
4N samt NDGA hadde inhiberende effekt på mitokondrie elektrontransportsystem [6, 7], undertrykker oksidativ fosforylering og reduserer cellulære ATP-innhold. Alternativt kan reduksjonen i ATP kan være et resultat av en M
4N avhengig reduksjon i glykolytisk fluks. Fig 5A oppsummert effekten av M
4 N på TCA syklus /elektrontransportsystemrelaterte metabolisms. Succinatdehydrogenase som konverterer succinat til fumarat i TCA-syklus er også kjent som en viktig komponent i komplekset II i elektrontransportsystemet. Interessant innholdet av både succinat og fumarat ble signifikant redusert ved M
4N (figur 4), noe som indikerer at M
4N trykkes metabolsk aktivitet av både det TCA-syklusen og elektrontransportsystem. Fig 7 oppsummert virkningen av M
4N på nukleinsyre-relaterte metabolisme, basert på data metabolitten (fig 4, S1 tabell) og ATP-testen (figur 6A). I tillegg til redusert mengde av ATP (figur 6A), ble innholdet av nukleosidtrifosfater som CTP, GTP og UTP også redusert med M
4N mens de av forløper-metabolitter for nukleosidtrifosfater som CMP, GMP, UMP, adenin, guanosin og cytidin var alle samlet etter M
4 N behandling. [14].
