Abstract
Bakgrunn
Kronisk hepatitt C virus (HCV) infeksjon og tilhørende levercirrhose representerer en viktig risikofaktor for leverkreft (HCC) utvikling. TGF-β er en viktig drivkraft for lever fibrogenese og kreft; Men den faktiske effekten på menneskelige kreft progresjon fortsatt dårlig kjent. Målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle HCC-avledet HCV kjerne naturlige varianter på kreft progresjon gjennom virkningene på TGF-β signalering.
hovedfunnene
Vi gir bevis for at HCC- avledet kjerne protein uttrykk i primære humane eller mus hepatocytter lindrer TGF-beta responser i form eller veksthemming eller apoptose. I stedet, i disse hepatocytter TGF-β var fortsatt i stand til å indusere en epitelial til mesenchymale overgang (EMT), en prosess som bidrar til å fremme celle invasjon og metastasering. Videre demonstrerer vi at forskjellige terskler for Smad3 aktivering diktere TGF-β responser i hepatiske celler og som HCV-kjerneprotein, ved å redusere Smad3 aktivering, kan bytte TGF-β vekstinhibitoriske effekter på tumor fremme reaksjoner.
Konklusjon /Betydning
Våre data viser kapasiteten til hepatocytter å utvikle EMT og plastisitet i henhold til TGF-β, legger vekt på HCV kjerne protein i det dynamiske av disse effektene og gi bevis for et paradigme der en viral protein innblandet i onkogenese er i stand til å skifte TGF-β svar fra cytostatisk effekt til EMT utvikling
Citation. Battaglia S, Benzoubir N, Nobilet S, Charneau P, Samuel D, Zignego AL, et al. (2009) Liver Cancer-Avledet hepatitt C-virus Kjerne Proteiner Shift TGF-beta Svarene fra Tumor Suppression til epithelial-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 4 (2): e4355. doi: 10,1371 /journal.pone.0004355
Redaktør: Mauricio Rojas, Emory University, USA
mottatt: 22 juli 2008; Godkjent: 18 desember 2008; Publisert: 03.02.2009
Copyright: © 2009 Battaglia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), Agence Nationale de Recherche sur le SIDA (ANR) og Det europeiske fellesskap (Virgil). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er definert som en prosess der epitelceller mister fenotypiske karakteristiske og skaffe mesenchymale cellens funksjoner. Mens EMT er involvert i sammenheng med embryoutvikling det spiller også en rolle i tilblivelsen av fibroblaster under organ fibrose hos voksne vev og kan bidra til metastaserende utvikling [1]. Faktisk EMT blir stadig mer anerkjent som et viktig skritt som fremmer cellemigrasjon, tumor invasivitet og metastase [2], og har også vært innblandet nylig i kreftstamcelleveksten [3]. I leveren blir hepatiske stel celler (HCS) betraktet som de viktigste fibrotiske forløperceller som transdifferentiate til fibrogenic, ekstracellulære matriks-produserende myofibroblasts i inflammatorisk levervevet ved TGF-β signalering, mens hepatocytter gjennomgår apoptose ved signalering av dette cytokin. Men, identifisering av ulike fibrogenic populasjoner fra hverandre av fastboende stel celler [4] samt konvergerende resultater av nyere studier har utfordret paradigmet av HSC som viktig kilde til lever myofibroblasts og utledes en fremtredende rolle for hepatocytter i leveren fibrogenese. Faktisk har det blitt rapportert nylig at rotter eller mus hepatocytter svare både
in vitro Hotell og
in vivo
til TGF-β ikke bare i form av hemming av cellevekst og apoptose, men også i form av induksjon av EMT [5] – [7]. Følgelig har det blitt vist at TGF-β og laminin 5 transformere ikke-invasive hepatocellulære karsinomceller til invasive celler via fremkallelse av en komplett EMT [8]. Men selv om de molekylære mekanismene bak EMT utvikling har blitt studert, er lite bevis tilgjengelig om sine fysiologiske funksjoner og relevans i menneskelige sykdommer.
En av de mekanismer der cellene gjennomgår neoplastisk transformasjon og flykte fra normal vekstkontroll innebærer en endret respons til de cytostatiske effekter av TGF-β [9], [10]. Videre, i løpet av de senere stadier av tumorgenese, kan TGF-β stimulere invasjon hovedsakelig gjennom induksjon av EMT. Det er nå generelt akseptert at TGF-β har en dobbel rolle i onkogenesen og kan fungere som en tumor suppressor eller tumor promoter faktor avhengig cellulær sammenheng [11], [12], men som er involvert i bryteren av TGF-p-responser mekanismer mot malignitet er ikke fullt ut forstått.
In vivo
, er det blitt vist at tap av TGF-β aliserte signifikant reduserte tumor latens og økte frekvensen av metastase i flere musemodeller [13].
TGF-β initierer reaksjoner etter kontakter to typer av trans-membran serin /treoninkinaser som kalles reseptorer type i og type II, fremme aktivering av type i av type II-kinase. Den aktiverte type I reseptor forplanter seg deretter signal til kjernen ved fosforylering Smad2 og Smad3. Når fosforylert, Smad2 og Smad3 forbinder med den delte partner Smad4 og kompleksene akkumuleres i kjernen hvor de regulerer uttrykket av TGF-β målgener gjennom samarbeids interaksjoner med transkripsjons partnere [14], [15], [16]. Forstyrrelse av TGF-β signalering, enten via mutasjonsinaktivering av komponentene i signalveien, eller ved modulering av deres ekspresjon eller funksjon, er nå kjent for å spille en viktig rolle i tumorprogresjon. Til tross for alle disse bevisene, den kliniske implikasjonen av TGF-β i metastase progresjon er fortsatt uklart.
Kronisk hepatitt C virus (HCV) infeksjon og tilhørende levercirrhose representerer en viktig risikofaktor for leverkreft (HCC) utvikling, og til tross for epidemiologiske bevis kobler HCV smitte til HCC, er den kliniske betydningen av dette viruset på hepatocarcinogenesis fortsatt uklart [17]. Fordi HCV RNA viser høy genetisk variasjon, kronisk HCV infeksjon resulterer i en kompleks befolkning på forskjellige, men nært beslektede virusvarianter ofte referert som quasispecies [18], [19]. Den ikke-tilfeldig fordeling av HCV quasispecies har blitt observert mellom tumoral og ikke-tumoral leveren antyder muligheten for et utvalg av quasispecies med modifiserte funksjonelle egenskaper som kan bidra til utvikling fibrose, så vel som tumorigenesis prosessen [20].
Den strukturelle komponenten i HCV har HCV kjerne protein tilt særlig oppmerksomhet etter sin karakterisering og ulike rapporter har antydet sin potensielle rolle i HCV patogenesen. Faktisk, i tillegg til sin rolle i viral RNA emballasje, HCV-kjerneprotein har blitt rapportert til å interagere med flere cellulære proteiner som TNFR [21], PKR [22], Stat3 pRB eller p53 [23] som fører til modulering av transkripsjonen av gener avhengig disse kaskadene og følgelig til modulering av en rekke cellulære regulatoriske funksjoner. Faktisk, er en rekke data antydet en mulig involvering av HCV-kjerneprotein i modulering av celleproliferasjon og apoptose selv om enkelte resultater er kontroversiell ettersom kjerneprotein har blitt rapportert å oppvise pro eller antiapoptotic effekter, avhengig av forsøkssystemet som brukes [24] [25]. Videre har disse studiene ble hovedsakelig utført ved anvendelse av apoptotiske midler fra TNF-familien, og ikke med TGF-β. Dette avviket kan også være på grunn av genetisk heterogeniteten til forskjellige HCV-genotyper.
vi og andre har tidligere vist en interaksjon mellom Smad3 og HCV-kjerneprotein [26], [27]. Interessant nok har vi også observert at forskjellig naturlig kjerne-varianter isolert fra svulsten eller ikke-tumorknuter kan på en annen måte binde Smad3, og dermed inhibere TGF-β indusert Smad3 transkripsjonen aktivitet tyder på at HCV-kjerneprotein kan modulere TGF-β signalering og nedstrøms biologiske responser [ ,,,0],27]. Vi hypothetised at den molekylære heterogenitet av HCV observert i infiserte pasienter kan være involvert i det kliniske forløpet av kreftutviklingen.
Overuttrykte av TGF-β og samtidig reduksjon i hepatocytter veksthemming er ofte observert i HCC støtter forestillingen om at TGF-β kan spille en rolle i å fremme tumorleverkreft [28]. Imidlertid er den funksjonelle innblanding av TGF-β i leveren tumorigenesis samt innblanding av EMT i HCC utvikling ennå ikke klarlagt. Likeledes, effekter av onkogene viral hepatitt B eller C proteiner på EMT utvikling har ikke blitt undersøkt i løpet av hepatokarsinom prosessen. Demonstrasjon samspill mellom HCV-infeksjon og TGF-β mediert EMT kan gi en ny modell for å få innsikt i mekanismene for leveren kreftutvikling.
I denne studien har vi gjort bruk av naturlig HCV kjernevarianter isolert fra HCV-relaterte HCC vev for å analysere deres innvirkning på dobbel funksjon av TGF-β i en pathophysiogically-relevant tilstand. Derfor undersøkte vi effekten av kjerne protein varianter isolert fra både svulst eller ikke svulst cirrhosepasienter områder i primære humane hepatocytter; ja, er skrumplever en velkjent preneoplastiske tilstand, forbundet i minst 90% av tilfellene av HCC. Ved hjelp av disse variantene vi gir bevis for et paradigme der en viral protein er i stand til å skifte TGF-beta svar fra cytostatisk effekt til EMT utvikling.
Materialer og metoder
Materialer
rekombinant TGF-β1 og rekombinant TRAIL /Apo2L ble kjøpt fra Abcys, den kjemiske inhibitor av TGF-β signale SB-431542 som virker ved spesifikt å forstyrre den type i reseptor [29] var fra Calbiochem, det fluorescerende fargestoff DiOC
6 (3,3’dihexylocarbocyanine iodide) var fra Molecular Probes.
vektorer
Full lengde HCV kjerne sekvenser ble amplifisert fra HCV-RNA ekstrahert fra tumor (T) eller cirrhose (NT) knuter av en pasient (pasient B) infisert med HCV genotype 1b som tidligere beskrevet [22]. PCR-produktene ble sekvensert direkte og innsatt i vektoren pcDNA3.1. Rekkefølgen av disse to varianter er blitt tidligere beskrevet [27]. T-sekvensen er forskjellig fra NT én etter 2 endringer i aa 118 (N → D) og aa 189 (A → V).
(CagA)
9-Luc ble vennlig levert av Dr JM Gauthier . De ekspresjonsvektorer for HA-TβRI.act, og Flag-TβRImL45.act var en gave fra Dr. Y.E. Zhang [30]. Den pRetroSuper-puro plasmid som inneholder kort hårnåler RNA anti mot Smad3 ble vennlig levert av Dr J. Massagué [31]. En pRetroSuper-puro plasmid som inneholder rykke korte hårnåler RNA ble brukt som kontroll. Pires-GFP ble hentet fra Stratagene, pCMV-Renilla-Luc var fra Promega. Myc-Smad3 ekspresjonsvektor ble tidligere beskrevet [32].
Transgene mus
For å oppnå transgene mus, de HCV kjerne cDNA isolert fra tumor (T) eller cirrhose knuter (NT) ble klonet nedstrøms av hepatitt B virus regulatoriske elementer og innføres i C57BL /6 embryoer (Institut Clinique de la Souris, Strasbourg, Frankrike). Transgene mus ble identifisert ved å underkaste en ug hale-DNA til forsterkning ved PCR.
Cellekultur
Den humane hepatom-cellelinje Huh7 [33] ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte medium inneholdende 10% føtalt kalve serum (FCS). -Celler ble transfektert med de forskjellige vektorer ved hjelp av LipofectAMINE-metoden (Invitrogen) og stabile transfektanter ble selektert ved å inkubere cellene med antibiotikumet svarende til seleksjonsgenet.
Isolering og kultur av primære hepatocytter
primære mus hepatocytter ble isolert ved lever perfusjon med en kollagenase blanding som tidligere beskrevet [34]. Etter isolering ble hepatocytter resuspendert i Williams medium supplert med 10% føtalt kalveserum, 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, 250 ng /ml Fungizone ( «pletteringsmedium») og sådd ut med en tetthet på 3 x 10
4 celler /cm
2. Etter 4 timer ble serumholdig medium fjernet, og cellene ble dyrket i Williams medium supplert med 1 mg /ml bovint serumalbumin, 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, 250 ng /ml Fungizone, og behandlet med TGF- β 2 ng /ml eller SB431542 1 mikrometer.
Primære humane hepatocytter ble isolert fra friske leveren vev av kirurgiske leverbiopsi-prøver samlet inn etter informert samtykke innhentes fra pasienten under terapeutisk delvis hepatectomy for levermetastaser og godartet levertumor. Kollagenase (Sigma Aldrich) perfusjon (500 ug /ml, 2,4 mg /ml CaCl
2 i HEPES-buffer, pH 7,4) ble innledet ved omfattende vasking av levervevet med HEPES /EDTA-buffer (pH 7,4) ved anvendelse av et kateter innført i skipene på snittflaten av resected fragment. Cellene ble deretter vasket to ganger og hepatocytter ble separert fra nonparenchymatous celler ved Percoll fraksjon (30% isotonisk Percoll oppløsning, sentrifugert ved 450 g i 4 minutter), og straks infisert ved 37 ° C i 2 timer med lentivirale vektorer, vasket og sådd ut i Williams medium supplert som beskrevet andre steder [35]. Tolv timer senere, de ble behandlet eller ikke med TGF-β eller SB431542 for ulike tidsperioder.
lentiviral vektorer
TRIP-ΔU3-CMV-T, TRIP-ΔU3-CMV-NT og TRIP-ΔU3-CMV-CINV vektorer ble oppnådd ved å erstatte GFP i TUR-ΔU3-CMV-GFP med cDNA som koder for HCV kjernesekvenser. En invertert kjerne sekvens TRIP-ΔU3-CMV-CINV ble anvendt som en kontroll.
vektor-partiklene ble produsert ved den forbigående kalsiumfosfat kotransfeksjon av 293T-celler som tidligere beskrevet [36]. Vektor konsentrasjoner ble normalisert i henhold til den p24 (HIV-1 capsidproteinet) -innhold på supernatanter.
Western blotting
Cellene ble vasket to ganger med PBS og lysert i RIPA-buffer inneholdende 0,5% SDS og Benzon nuklease. Proteiner ble kvantifisert med Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad, Frankrike) og 30 ug ekstrakter ble separert på SDS-polyakrylamidgel, overført på nitrocellulosemembran og blottet ved hjelp av forskjellige primære antistoffer rettet mot HCV-kjerneprotein, E-cadherin, Fibronectin (Santa Cruz Biotechnology), vimentin (Chemicon), fosfor-Smad3 (Cell signalering), Smad3 (Abcam), flagg, Myc og HA-koder (Sigma). Membraner ble avslørt ved hjelp av en chemioluminescence deteksjon kit (ECL Plus, GE Healthcare).
Cell farging
muse hepatocytter ble dyrket i 48 timer med eller uten TGF-β (2 ng /ml) og rutinemessig flekk hematoksylin-eosin ble utført etter fiksering av celler med EtOH 70% ved 4 ° C i 15 min.
Immunofluorescence farving
cellene ble vasket med PBS og fiksert med 4% PFA løsning ved 4 ° C i 20 minutter, etterfulgt av metanol permeabiliseringen i 5 minutter ved -20 ° C. Celler ble deretter inkubert med et primært mus anti-vimentin, kanin anti-αSMA, eller kanin anti-E-cadherin antistoff og deretter med en Alexa Fluor 488-konjugert anti-mus-antistoff og en Alexa Fluor 594 konjugert geite-anti-kanin-antistoff (Molecular prober). De ble deretter farget med Hoechst og undersøkt av fluorescens mikroskopi.
celleproliferasjon og apoptose analyser
Celleproliferering ble vurdert av BrdU inkorporering (Roche), celle levedyktighet og caspase 3-aktivitet ble beregnet ved hjelp av en Celltiter-Glo luminiserende cellelevedyktighet assay eller CaspaseGlo 3/7 analysen henholdsvis (Promega) ifølge produsentens instruksjoner.
Mitokondriell transmembranpotensial (ΔΨm) ble evaluert ved å farge cellene (10
6) med den fluorescerende fargestoff DiOC
6 ved en sluttkonsentrasjon på 40 nM i 15 minutter ved 37 ° C. Celler ble umiddelbart dissosiert av trypsin og deres fluorescens beregnet ved analyse med en FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson) ved hjelp av FL1-kanalen [37].
Cell sortering
flowcytometrisk analyse og sortering var utføres ved hjelp av en FacsDiva flowcytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Forward Scatter (FSC) og side scatter (SSC) ble samlet inn gjennom et filter. GFP signal ble samlet i FL1 kanal. Et lys gate ble trukket i SSC versus FSC å ekskludere døde celler /rusk. Celler i porten ble vist i en biparameter histogram (FS versus FL1) og endelige portinnstillingene fast bestemt på å samle de merkede cellene. GFP-positive celler ble sortert ved 5000 celler /sek.
Transkripsjonell analyse
Celler ble transfektert med vektorer som koder for genet av interesse sammen med den CagA-luc reporter plasmid og Renilla luciferase plasmidet til normalisere resultatene. De ble inkubert i 24 timer senere i fravær eller nærvær av TGF-β for ytterligere 18 timer. Luciferase aktivitet ble målt med Dual luciferase reporter analysen (Promega) system i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
Betydningen mellom de ulike forhold og deres kontroll ble bestemt av paret Students
t
test med GraphPad Prism programvare. En p-value≤0.05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
HCV kjernevarianter lindre TGF-β cytostatisk svar og øke TGF-β -mediert EMT i mus eller humane primære hepatocytter
Vi har tidligere vist at når forbigående uttrykt i hepatiske celler, HCV kjerne proteiner isolert fra svulsten eller cirrhose knuter binde Smad3 ulikt, og at denne interaksjonen inhiberer Smad3 avhengig transkripsjonen aktivitet [27]. For å fastslå den fysiologiske betydningen av denne observasjonen, vi først undersøkt virkningen av en slik binding på TGF-β biologiske responser i hepatocytter isolert fra transgene mus som uttrykker disse HCV-tumor (T) eller cirrhose (NT) kjerne varianter under kontroll av den HBX promoteren og som for det meste uttrykkes i leveren. Hepatocytter ble isolert fra lever fra 2 måneder gamle mus og behandlet eller ikke med TGF-β i 48 timer. Vi observerte at TGF-β var mindre potente til å inhibere celleproliferasjon i hepatocytter isolert fra transgene mus som uttrykker de HCV-kjerneproteinene enn i hepatocytter isolert fra en styre mus (Fig. 1A). Følgelig cellenes levedyktighet ble mindre redusert ved TGF-β i celler som uttrykker kjerneproteiner sammenlignet med vill-type-celler (Fig. 1B). Vi har også funnet at ekspresjonen av HCV-kjerneproteinene inhiberte TGF-β-mediert apoptose som vist ved kaspase 3 aktiveringen, som representerer et veldefinert kjennetegn på apoptose (Fig. 1C). Interessant, nedsatt T-kjerne ekspresjon TGF-β-mediert apoptose eller inhibering av cellelevedyktighet i en høyere grad enn det NT-kjerne som viser en funksjonell betydning av den økte interaksjonen av denne kjerne varianten med Smad3 [27]. For å bekrefte at dette HCV kjerne-indusert reduksjon av apoptose observert etter TGF-β behandling var bestemt, brukte vi en annen induserer apoptose, TRAIL. Mus hepatocytter som uttrykker eller ikke HCV-kjerneproteinene svare på TRAIL på lignende måte i form av kaspase 3 aktiveringen noe som tyder på at den samlede apoptose prosessen ikke ble modifisert ved kjerne ekspresjon (Fig. 1D). Dette resultatet er i tråd med en tidligere rapport som viser at HCV kjernen fører til TRAIL-indusert apoptose gjennom aktivering av mitokondrie-signalveien [38].
(A, B, C) Muse hepatocytter hentet fra lever av transgene mus som uttrykker eller ikke HCV kjerne proteiner isolert fra svulsten (T) eller cirrhose (NT) vev ble behandlet med TGF-β i 48 timer før bestemmelse av celleproliferasjon, anslått av BrdU-inkorporering (A), celle-levedyktighet (B) eller caspase 3 aktivitet (C). (D) Celler ble behandlet med TRAIL (20 ng /ml) i 18 timer før bestemmelse av caspase3 aktivitet. Resultatene representerer gjennomsnittet +/- SD av triplikater fra et representativt eksperiment. * P≤0.05, ** p≤0.005, *** p≤0.0005.
Flere bevislinjer støtter forestillingen om at epitelceller kreftceller mister sin evne til å svare på TGF-β cytostatisk effekt, men i enkelte tilfeller beholder sin evne til å svare på andre TGF-β medierte funksjoner som EMT. Observasjonen om at HCV-kjerneproteiner interferere med evnen til TGF-β å utføre hemming av cellevekst og celledreping fikk oss til å vurdere muligheten for at disse proteiner kan påvirke TGF-β mediert EMT. Siden siste resultatene har vist at TGF-β kan indusere en EMT i modne mus hepatocytter
in vitro product: [6], [7], vi undersøkt om HCV kjerneproteiner kan modulere evnen til TGF-β å fremme EMT i de samme primære hepatocytter. Kontrastmikroskopi observasjon viste at etter behandling i 30 timer med TGF-fi noen hepatocytter anskaffet en fibroblast-lignende morfologi som tyder på EMT, og at denne effekten var mer uttalt når disse hepatocytter uttrykker kjerneprotein som viser at celle plastisitet kan økes i mus hepatocytter uttrykke HCV kjerne T-proteinet (fig. 2A). Denne observasjonen ble forsterket av videomicroscopy observasjon (data ikke vist). For å bekrefte at disse observerte fenotypiske endringene var reflektert av en EMT, utførte vi immunfluorescens analyser på hepatocytter isolert fra kontroll eller fra transgene mus. I tråd med tidligere funn, ble TGF-β behandling av kontroll mus hepatocytter ledsages av en meget sterk økning i polymeriseringen av mesenchymale markør alfa glatt muskel aktin (αSMA) var i overensstemmelse med en fenotype av EMT (Fig. 2B). Interessant, HCV-kjerneproteiner og spesielt T en kunne øke αSMA fibrene i fravær av eksogent tilsatt TGF-β. For å vurdere om autokrint frigjøring av TGF-β kan være involvert i dannelsen av αSMA spennings fibre i HCV kjerne uttrykke celler, brukte vi en bestemt TGFβR1 inhibitor, SB431542. Når disse uttrykkende celler ble behandlet med denne inhibitor, αSMA fibrene helt forsvunnet, noe som tyder på at virkningen av den kjerneprotein på EMT utvikling er mediert av en endogen produksjon av TGF-β (Fig. 2B). I samsvar analyser vestlige blotter viste også at E-cadherin uttrykk, en epitelial markør kjent for å være tapt i mesenchymalceller ble sterkt redusert av TGF-β og fullt restaurert ved tilsetting av SB431542 (Fig. 2C).
(A) Morfologiske forandringer av mus hepatocytter som uttrykker eller ikke HCV-T-kjerneprotein observert etter 48 timers kultur med eller uten TGF-β (2 ng /ml). (B) Hepatocytter isoleres fra transgene mus som uttrykker HCV-kjerneproteinene ble behandlet med TGF-β (2 ng /ml) eller SB431542 (1 uM) i 48 timer og ekspresjon av αSMA ble undersøkt ved immunfluorescens ved å bruke et αSMA antistoff. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Hepatocytter isoleres fra transgene mus som uttrykker HCV-kjerneproteinene ble behandlet med TGF-β eller SB431542 i 48 timer og ekspresjon av E-cadherin ble bestemt ved Western blotting. Anti-p38 western blotting ble brukt som kontroll lasting. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
For å oppnå ytterligere bevis på at HCV kjerneproteiner kan modulere omfanget av de negative vekst regulatoriske virkningene av TGF-e vi også utført eksperimenter i humane primære hepatocytter. Fersk isolerte hepatocytter ble infisert med lentiviruses koder for T eller NT kjerne varianter eller en invertert kjernesekvensen som kontroll. Western blot analyser bekreftet ekspresjon av de sentrale proteiner (Fig. 3A). Celler ble deretter behandlet eller ikke med TGF-β i 96 timer forut for analyse av celle-levedyktighet eller kaspase 3 aktiveringen. Både TGF-β-formidlet reduksjon i celleviabilitet (Fig. 3B) og apoptotiske respons (fig. 3C) ble mildnet av HCV kjerne ekspresjon resultatene oppnådd i mus hepatocytter bekrefter.
nyisolerte celler ble infisert med lentivirus som koder for HCV-kjerneproteinvarianter eller en invertert kjerne sekvens som kontroll (CTL) (A) Nivåer av kjernen ekspresjon ble estimert ved Western blot-analyse forskjellige tidspunkter etter lentivirus transduksjon. (B, C) Bestemmelse av cellelevedyktighet (B) eller kaspase 3 aktivitet (C) ble utført etter 96 timers behandling med TGF-β (5 ng /ml). Resultatene representerer gjennomsnittet +/- SD av triplikater fra et representativt eksperiment. * P≤0.05, *** p≤0.0005.
Selv om TGF-β-formidlet EMT har blitt beskrevet i grunnskolen mus eller rotte hepatocytter samt i kreft menneskelige celler, ingen slik studie har vært likevel undersøkt i primære humane hepatocytter in vitro. Interessant, observerte vi at humane hepatocytter kunne uttrykke stress-fibre som toppene hovedsakelig lokalisert i membranfremspring i henhold TGF-β behandling (fig. 4A). Uttrykk av HCV kjerneproteiner øker dette TGF-β effekt. Her igjen ekspresjon av HCV-kjerneproteiner økes αSMA polymeriseringen, selv i fravær av eksogent tilsatt TGF-β. Denne effekten kan omfatte endogent TGF-β siden den ble fullstendig opphevet i nærvær av TGF-reseptor inhibitor. For å underbygge dette resultatet, studerte vi uttrykk for en annen mesenchymale markør, vimentin. I samsvar med data innhentet med αSMA, observerte vi at det i kontroll hepatocytter vimentin-ekspresjon ble betydelig økt etter TGF-β behandling, og at denne økningen var større når hepatocytter uttrykte NT kjerneprotein og enda større når T kjerne ble uttrykt (fig. 4A ). Tilsvarende kjerneproteiner indusert ekspresjon vimentin og polymeriseringen i fravær av eksogent tilsatt TGF-β. Dette uttrykket ble fullstendig reversert ved den TGFbRI inhibitor tyder igjen på at endogent fremstilt TGF-β kan være ansvarlig for denne effekten.
(A) Ekspresjon av αSMA eller vimentin ble vurdert ved immunofluorescens-analyse etter behandling med TGF-β ( 5 ng /ml) eller SB431542 (1 uM). (B) Ekspresjon av fibronektin eller E-cadherin ble anslått ved Western blot-analyse under de samme forsøksbetingelser. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Western blot analyser dokumentert en lavere ekspresjon av E-cadherin etter TGF-β behandling som ble fullstendig gjenvunnet i nærvær av TbRI inhibitor. Tvert imot, ekspresjon av mesenchymale markør fibronektin ble sterkt øket ved TGF-β (Fig. 4B).
Tatt sammen disse dataene tyder sterkt på at HCV kjerne interferere med TGF-β responser når det gjelder hemming av cellevekst og apoptose i hepatocytter isolert fra transgene mus samt humane primære hepatocytter. Bemerkelsesverdig, er TGF-beta svar, i form av EMT økt med uttrykk av T eller NT kjerne proteinvarianter i både mus og humane hepatocytter. Dette kan reflektere både direkte effekter av kjernen for TGF-β-indusert EMT og reduksjon av TGF-β indusert apoptose av kjerneprotein, slik at flere celler til å gjennomgå EMT sammenlignet med kontrollceller.
HCV kjerne modulerer TGF -S responser i Huh7 celler
for å dissekere de molekylære mekanismer aktiveres av HCV kjernen protein, etablerte vi Huh7 cellelinjer stabilt uttrykker T kjernen protein (fig. 5A). Kjerneprotein hemmet TGF-β-mediert Smad3 transkripsjonen aktivitet målt ved ekspresjon i disse celler av en reporter plasmid, som inneholder CagA elementer som tidligere er vist å være transactivated av TGF-β gjennom Smad proteiner (ikke vist). I samsvar med resultatene observert i primære hepatocytter, har vi funnet at HCV-kjerneprotein var i stand til å redusere den inhibitoriske effekt av TGF-β på cellenes levedyktighet (fig. 5B). Tilsvarende ble TGF-β-mediert apoptose reduseres i celler som uttrykker HCV kjerne som vist ved caspase3 aktivering (fig. 5C) eller tap av mitokondriemembranpotensialet, noe som representerer en annen tidlig markør av apoptose (fig. 5D).
(A) Ekspresjon av HCV-kjerneprotein bestemt ved Western blot-analyse. (B, C) celler ble behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 48 timer før bestemmelse av cellelevedyktigheten (B) eller caspase3 aktivitet (C). Resultatene representerer gjennomsnittet +/- SD av triplikater fra et representativt eksperiment. *** P≤0.0005 (D) Mitokondriell membranpotensialet (ΔΨm) ble bedømt ved FACS-analyse i celler behandlet med TGF-β i 48 timer. Etter farging med DiOC
6 (3), celler med lav fluorescens intensitet svarende til lav (ΔΨm) ble gated og deres tall uttrykt som en prosentandel av den totale populasjonen. Et representativt forsøk er vist. (E) Celler ble behandlet med TGF-β i 48 timer og E-cadherin eller αSMA ekspresjon ble bestemt ved immunofluorescens-analyse. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (F) Sammenlignings ekspresjon av HCV-kjerneproteiner. Utdrag fra dyrkede celler som uttrykker kjernen protein (Huh7, menneskelige eller mus primære hepatocytter) eller fra leveren hos HCV-relaterte HCC pasienter ble analysert ved Western blot. Anti-p38 western blotting ble brukt som kontroll lasting.
Vi deretter bestemt EMT prosess Huh7 cellelinjer som uttrykker denne kjernen protein. Immunfluorescens studier viste at αSMA var sterkt polymerisert etter TGF-β behandling forbundet med en sterk reduksjon av E-cadherin fra cellemembraner (fig. 5E). αSMA polymerisasjon ble økt i kjerne uttrykke celler. Interessant, i nærvær av kjerneprotein, αSMA fibre først selv i fravær av eksogent tilsatt TGF-β. Ekspresjon av αSMA ble fulgt med forankringsuavhengig vekst, noe som ble observert i fravær av eksogent tilsatt TGF-β i HCV-kjerneprotein uttrykkende celler (data ikke vist).
Til sammen indikerer disse data at virkningene av HCV-kjerneproteiner for TGF-β respons observert i primære hepatocytter ble reprodusert i en human hepatomcellelinje som kunne således utgjør et nyttig verktøy for å dissekere de mekanismene som er involvert i modulering av TGF-p-responser.
Vi har også sammenlignet protein kjerne uttrykk i våre ulike cellemodeller og i ekstrakter fra leveren av HCV /HCC pasienter. Den sterkeste uttrykket ble oppnådd i humane hepatocytter, som er forenlig med en effektiv lentiviral transduksjon. HCV-kjerneprotein ekspresjon kunne også påvises i forskjellige leverekstrakter, men på forskjellige nivåer. Interessant, core uttrykk i disse ekstraktene var sammenlignbar med den observert i mus hepatocytter (Fig. 5F).
Differensial terskler av Smad3 aktivering bryter TGF-β svar fra svulst undertrykkelse til tumorvekst
for å analysere mer detaljert bidraget fra Smad aktivering i virkningene av HCV kjerne på TGF-β svar, vi har gjort bruk av en mutant av TGF-β-reseptor jeg, TβRImL45Act som beholder en konstitutivt aktiv kinase domene, men er ikke i stand til å indusere Smad fosforylering. Huh7-celler ble transfektert med denne mutant eller villtype aktivert form av TβRI, sammen med et plasmid som koder for HCV-kjerne og GFP til å gjenkjenne de transfekterte celler. Immunofluorescens-analyse ble utført 48 timer senere. .
