Abstract
Produksjon av matrix metalloproteinaser (MMP) for nedbrytning av ekstracellulær matrix er et viktig steg i kreft metastasering. Vi undersøkte effekten av HPV16 teinene (16E6, 16E6 * I og 16E7), enten enkeltvis eller samlet, på transkripsjon av 7
MMP
s innblandet i livmorhalskreft invasivitet. Nivåene av
MMP 7
rapportert økes i livmorhalskreft ble bestemt i C33A stabilt uttrykker ulike HPV16 teinene ved hjelp av kvantitativ RT-PCR og sammenlignet med invasjon evne til cellelinjer ved hjelp av
in vitro
invasjon og sårtilheling analyser. Overekspresjon av
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
ble påvist i HPV16E6E7 uttrykke celler som korrelerte med økt celle invasjon. Kombinasjon av HPV oncoproteiner alltid viste større effekt enn sin individuelle form. Inhibering av celle invasjon ved hjelp av en spesifikk MMP-2-inhibitor, OA-Hy, og anti-MT1-MMP-antistoff bekreftet at invasjon i disse cellene var avhengig av både MMP-2 og MMP MT1-ekspresjon. Nedbryting av HPV16E6E7 av shRNA-mediert knock-down eksperimenter resulterte i redusert MMP-2 og MT1-MMP uttrykk nivåer samt redusert invasjon evne som sterkt foreslåtte spesifikke effekter av HPV teinene på begge MMP og på celle invasjon. Immunhistokjemi studie i invasiv livmorhalskreft bekreftet den forbedrede
in vivo
uttrykk for disse to MMP i HPV16-infiserte celler. I tillegg mulige områder kreves av HPV16E6E7 på
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
arrangører ble undersøkt og PEA3 (på -552 /-540 for
MMP-2
, -303 for
MT1-MMP
) og SP1 (ved -91 for
MMP-2, etter -102 for
MT1-MMP
) bindingsseter ble vist til være avgjørende for å mediere sin transaktiveringsaktivitet. Konklusjonen vår studie viste at HPV16E6 og E7 teinene samarbeide for å fremme livmorhalskreft invasivitet av spesielt oppregulering
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
transkripsjon på en lignende måte.
Citation: Kaewprag J, Umnajvijit W, Ngamkham J, Ponglikitmongkol M (2013) HPV16 Oncoproteiner fremme livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP Invasivitet ved oppregulering Spesifikke matriksmetalloproteinaser. PLoS ONE åtte (8): e71611. doi: 10,1371 /journal.pone.0071611
Redaktør: Nikos K. Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 28 februar 2013; Godkjent: 01.07.2013; Publisert: 13 august 2013
Copyright: © 2013 Kaewprag et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen arbeidet ble støttet av fakultet for naturvitenskap og medisin Scholars Program, Mahidol University, Thailand og National Research Council of Thailand. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vedvarende infeksjon med høyrisiko menneskelige papillomavirus (HPV) er den viktigste årsaken til livmorhalskreft, som er den nest vanligste kreftformen hos thailandske kvinner [1]. HPV16 oppdages oftest, og står for mer enn 50% av livmorhalskrefttilfellene i verden [2]. Carcinogenese på grunn av HPV16 er knyttet til de virale oncoproteiner, E6 og E7, gjennom deres interaksjon med vertscelleproteiner som er involvert i cellesyklusregulering som resulterer i celletransformasjon og immortalisering [3]. HPV16E7 (16E7) binder seg til cellesyklus-proteinet pRb, som deretter utsettes for nedbrytning via en proteasom-mediert prosess [4], mens HPV16E6 (16E6) samvirker med og induserer proteasom-mediert nedbrytning av p53 [5]. Både E6- og E7-oncoproteiner er også i stand til å modulere transkripsjonen av flere vertsgener. Eksempler inkluderer 16E6-avhengig oppregulering av den katalytiske subenheten til humant telomerase revers transkriptase (
hTERT
) og transformerende vekstfaktor β (
TGFB
gener gjennom konkrete SP1 bindingsseter [6], [7 ] og økt uttrykk av DEK proto-onkogen, som koder for en senescence hemmer, ved E7 gjennom en pRb familie protein avhengig veien [8]. i tillegg til å produsere helaftens E6 (16E6F), HPV16 genererer også en avkortet form av E6 (16E6 * i), som fremmer Dlg proteindegradering [9] og transaktivering av aldo-keto-reduktase-genet [10].
rollen til virusproteiner på tumor invasivitet ble først nevnt i en studie som viser i hepatomcellelinje den evnen til hepatitt B-virus (HBV) X-proteinet å indusere ekspresjonen av matriks-metalloproteinaser MMP-2 og MT1-MMP (MMP-14), via en Cox 2-avhengig mekanisme [11]. MMP’er hører til en familie av sink-proteaser som er ansvarlige for degradering av ekstracellulær matriks som er nødvendig for migrering og metastase av kreftceller [12]. Nylige studier har antydet en sammenheng mellom tilstedeværelsen av MMP’er og HPV i livmorhalskreft [13], [14]. Forhøyede ekspresjonsnivåer av et antall av MMP (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MT1-MMP og MMP -15) har blitt rapportert i invasive karsinomer i livmorhalsen, sammenlignet med normalt vev [15] – [17]. Det gjenstår imidlertid en sammenheng mellom HPV teinene og MMP typer kontroversielt. Smola-Hess
et al
. viste at keratinocytter som ble transformert av HPV16 og HPV8 indusert ekspresjon av MT1-MMP [14]. I en nyere undersøkelse, ble den forhøyede HPV16E7 uttrykket vist å assosiere med en økning i pro-MMP-9 aktivitet i organotypiske kultur av keratinocytter imidlertid HPV16E6 /E7 ikke hadde noen effekt på MMP-2, -9 og MT1-MMP-nivåer i menneskelige forhuden keratinocytter [18]. Selv om overekspresjon av flere typer av MMP har blitt observert i livmorhalskreft vev, bare økte nivåer av MMP-2 og MMP-9 ble vist å korrelere med dårlig prognose i pasienter [16]. I tillegg har et forhold mellom
MMP-2
mRNA nivåer og livmorhalskreft invasivitet blitt vist [19]. Aktivering av både MMP-2 og MMP-MT1 ble funnet i squamous cervikale karsinomer [16] og generering av den aktive formen av MMP-2 ble vist å kreve aktivering ved MT1-MMP [20]. Dette kravet er støttet av den demonstrasjon at MT1-MMP er stand til å spalte MMP-2 for å danne en pro-MMP-2 /MT1-MMP /TIMP-2-komplekset, som øker konsentrasjonen av aktiv MMP-2 i forkant av invaderende kreftceller [21]. Selv om en rekke av MMP har overlappende aktivitet på en lignende gruppe av substrater, synes regulering av deres ekspresjonsnivåer for å være uavhengig regulert.
MMP-2
er konstitutivt uttrykt i mange celletyper, mens cytokiner regulere
MMP-9
transkripsjon [22] og regulering av
MT1-MMP product: (konstituerende eller indusert ) er fortsatt uklart [14].
i denne studien analyserte vi evnen til oncoproteiner fra høyrisiko HPV16 og HPV18 å transcriptionally regulere 7 typer
MMP
s
(MMP- 1, -2, -7, -9, -10, -11 Hotell og
MT1-MMP) Hotell og å relatere MMP uttrykk med celle invasjon i livmorhalskreft cellelinjer. I tillegg ble disse resultatene sammenlignet med dem som ble oppnådd fra biopsier av invasiv stadium livmorhalskreft. Vi spekulert på at høyrisiko HPV oncoproteiner oppregulert bestemte typer MMP i livmorhalskreftceller på transkripsjonsnivået.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Menneske vevsprøver som brukes i denne studien ble innhentet skriftlig informert samtykke fra pasientene eller deres pårørende. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av National Cancer Institute, Thailand (EF 236/2011).
Plasmid konstruerer og stabilt transfekterte cellelinjer
HeLa, Siha, Caski (vennlig levert av P . Chambon, IGBMC, Frankrike) og C33A (ATCC: HTB-31) cervikale kreftcellelinjer og humane embryonale nyre 293T cellelinje (vennligst tilveiebrakt av P. Angeletti, Lincoln University of Nebraska, USA) ble holdt ved 37 ° C i henhold en atmosfære av 5% CO
2 i DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin cocktail (GIBCO, Invitrogen). HPV16 onkogen cDNA, nemlig 16E6 (som inneholder både 16E6 * Jeg og 16E6F), 16E6 * Jeg, 16E7, 16E6E7 (både 16E6 og 16E7) og 16E6 * IE7 (begge 16E6 * Jeg og 16E7) ble fremstilt fra Siha celler og cDNA av HPV18E6E7 (både 18E6 og 18E7) ble preparert fra HeLa-celler. Alle cDNA ble satt inn i vektoren pcDNA3, og C33A celler som stabilt uttrykker HPV-proteiner ble samlet og opprettholdt som tidligere beskrevet [10]. To korte hårnål (sh) RNA konstruksjoner (shE6A og shE6B) inneholder utfyllende oligonukleotider utformet for å kneble HPV16E6 mRNA [23] og ikke-måls negativ kontroll shRNA (shCtrl) ble klonet inn pSUPER.retro.puro (OligoEngine). Arrangøren konstruksjonene ble generert ved å forsterke DNA-sekvenser -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 og -211 /+ 40 av
MMP-2
promoter og -1277 /+ 187, -425 /+ 187 og -151 /+ 187 av
MT1-MMP
promoter fra C33A celler og satt inn i plasmid pGL3-Basic (Promega). De følgende primere; -1721 /+ 40
MMP-2
frem primer 5 «GAGTGCTCGAGGATCAGGCTGAAGGGCCTGG 3», -1001 /+ 40
MMP-2
frem primer 5 «GAGTGCTCGAGGAATTCGTGGAACTGAGGG 3», -211 /+ 40 MMP -2 frem primer 5 «GAGTGCTCGAGCGAGAGAGGCAAGTGGGG 3»,
MMP-2
revers primer 5 «CCTGAAAGCTTCTGGATGCAGCGGAAACAA 3», -1277 /+ 187
MT1-MMP
frem primer 5 «CACCTCGAGGGAGGCTCCACAGGACCTGAAA 3», – 425 /+ 187
MT1-MMP
frem primer 5 «CCACTCGAGTCCCACACTCTGAGCTCCTCGTT 3», -151 /+ 187
MT1-MMP
frem primer 5 «TTGCTCGAGGGCTAAAACAACCACGTCCCCA 3» og
MT1-MMP
reverse primer 5 «CCGGGAAGCTTGGGCACTGTGGGCTCCGC 3» ble brukt.
revers transkripsjon (RT) -PCR og kvantitativ PCR (qPCR)
Total RNA ble ekstrahert fra celler med Illustra ™ RNAspin Mini kit (GE Healthcare) og brukes som mal for cDNA syntese ansette SuperScript®III RNaseH
-RT Kit (Invitrogen). qPCR ble utført ved hjelp av Stratagene Mx3000P qPCR system (Agilent Technologies) sammen med RBC ThermOne® Real-Time Premiks (SYBR grønn). Termocykling betingelser for både qPCR og RT-PCR var som følger: 10 min ved 95 ° C; (40 sykluser for RT-PCR), 30 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 60 ° C og 30 sek til 72 ° C. Fastsettelse av hypoxantin-guanin phosphoribosyltransferase (
HPRT
) rengjøring genekspresjon ble inkludert i hvert eksperiment for å korrigere for variasjoner i mal konsentrasjoner. Mengden av PCR amplikonene ble analysert ved hjelp av Gel Doc 2000 og nummer én programvarepakke (Bio-Rad). De primer sett som brukes til forsterkning av HPV16E6 /E7,
MMP
,
TIMP-2 Hotell og intern kontroll
HPRT
cDNA har tidligere blitt beskrevet [10], [24] [25]. Relativ ekspresjon er presentert som middelverdier ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
Gelatin Zymografi
Gelatinase aktiviteten til MMP-2 ble vurdert ved hjelp av gelatin zymografi som tidligere beskrevet [26]. C33A stabilt uttrykker forskjellige oncoproteiner ble inkubert i serumfritt medium i 48 timer før analyse. Etter å ha blitt konsentrert ved hjelp av en Amicon® Ultra-0,5 sentrifugale filteranordning (Millipore), like mengder av totalt protein i det brukte mediet fra hver cellelinje ble blandet med ikke-reduserende prøvebuffer (2% SDS, 10% glycerol, 62,5 mM Tris -HCI pH 6,8 og 0,01% bromfenolblått) og kjørt på en 7,5% polyakrylamidgel inneholdende 1 mg /ml gelatin (Sigma). Etter elektroforese, ble gelene renaturert ved vasking med 2,5% Triton X-100 to ganger i 30 min. Den klare bånd av hydrolysert substrat ble utviklet ved inkubering i utvikling av buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM CaCl
2, 1 mM ZnCl
2, 0,02% NaN
3 og 1% Triton X -100) ved 37 ° C i 18 timer og farget med 0,025% (w /v) Coomassie blue R250 i 1 time. Den gelatinolytisk aktivitet av MMP band ble kvantifisert ved densitometrisk analyse (Antall Ett program, Gel Doc 2000-systemet, Bio-Rad, USA) og presentert som gangers økning av den totale MMP-2 (pro-MMP-2 (72 kD) og aktiv MMP-2 (68 kD)) i forhold til kontroll pcDNA3 celler på 48 timer.
In vitro
invasjon analysen
In vitro
invasjon analyser ble utført i et Transwell kammer belagt på det øvre kammer med 30 ug Matrigel® (BD Bioscience). Celler (2 x 10
5) i serumfritt medium ble sådd ut på det øvre kammer og DMEM inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. For hemming analysene ble celler (10
4 for Siha og 5 x 10
4 for 16E6E7) ble behandlet med varierende konsentrasjoner (0, 2, 5, 10 eller 20 pm) av MMP-2-inhibitor,
cis
-9-oktadecenoyl-N-hydroxylamide; OA-Hy (Calbiochem), eller med 20 ug /ml anti-MT1-MMP-antistoff (ab78738, Abcam) i det øvre kammer med 1% FBS for Siha og 2% FBS for 16E6E7 i det nedre kammer. Etter inkubering i 24 timer (eller 12 timer ved inhibering assays) for 16E6E7 og 12 timer (eller 7 h ved inhibering assays) for Siha, ble cellene i det nedre kammer fiksert med 4% para-formaldehyd og beiset med 0,5% krystallfiolett. Invasjon aktivitet ble bestemt ved å telle antall invaderte celler i fem tilfeldige felt og resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av fargede celler i forhold til kontroller, kjøretøy eller det ikke-målsøkende shRNA plasmid eller ubehandlede celler.
Sår healing analysen
Celler ble dyrket fram til samløpet og en kunstig såret ble generert ved hjelp av P-200 pipette. DMEM inneholdende 100 ug Matrigel® (BD Bioscience) ble tilsatt til celler og tillatt å polymerisere i 15 minutter. Antallet celler migrerer inn i riper regionen ble talt på 0 og 48 timer etter inkubasjon og rapportert som prosent celler i ripete regionen sammenlignet med kontrollceller.
Luciferase aktivitetsanalyse
C33A celler uttrykker HPV16E6E7 ble transient transfektert med pGL3-Basic luciferase vektorkonstruksjoner som inneholder
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
arrangører som beskrevet ovenfor. Transfekterte celler ble lysert og undersøkt for luciferase-aktivitet som rapportert tidligere [10].
Western Blot analyse
C33A-celler som uttrykker onkoproteiner HPV16 ble lysert i Lysis-M-reagens, EDTA-fri, med komplett proteasehemmer Cocktail (Roche). Proteinene ble separert på 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Etter blokkering med 10% ikke-fettholdig tørrmelk i PBST, ble membranene inkubert med mus-anti-p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology ved 1:5,000), muse-anti-MT1-MMP (ab78738, Abcam ved 1:1,500 ), mus anti-TIMP-2 (ab1828, Abcam på 1:1,000), eller mus anti-GAPDH (sc-166574, Santa Cruz Bioteknologi på 1:2,000) antistoffer ved 4 ° C over natten etterfulgt av inkubasjon med en sekundær HRP- konjugert sau anti-mus IgG (GE Healthcare) (1:3,000) i 2 timer ved romtemperatur. Resultatene ble visualisert ved anvendelse av Pierce ECL-systemet (Thermo Scientific), med GAPDH som en lasting kontroll. Protein nivåer ble kvantifisert ved hjelp densitometry (Antall Ett program, Gel Doc 2000-systemet, Bio-Rad) og resultatene er presentert som gangers økning av protein (både pro- og modne former) sammenlignet med kontrollen over bilen etter normalisering mot GAPDH.
Fluorescent Immunohistochemistry
All klinisk undersøkelse har blitt gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen deklarasjonen~~POS=HEADCOMP og Good Clinical Practice. Parafininnstøpte vevssnitt fra 26 invasive karsinomer i livmorhalsen, tre cervikal intraepitelial neoplasi (ett hver av CIN 1, CIN 2 og CIN 3), og en adenomyosis ble oppnådd fra National Cancer Institute (NCI), Thailand. Alle vev ble analysert ved NCI patologer og anonymisert før de blir sendt til studiet. Antigener ble hentet av mikrobølger prøvene i Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-base pH 9,0, 1 mM EDTA, 0,05% Triton X-100) i 5 minutter og endogen peroksydase-aktivitet ble inhibert ved behandling med 3% H
2O
2 i 10 min. Fluorescent immunhistokjemi ble utført ved å inkubere 4 ° C over natten med primær muse anti-MMP-2 og anti-MT1-MMP monoklonale antistoffer (42-5D11 og 114-6G6 henholdsvis; Chemicon) på en 1:100 fortynning etterfulgt av inkubasjon med sekundær Alexa fluro 647-merket geit anti-mus IgG-antistoff (1:400 fortynning; Invitrogen). Hoechst 33258 (1:1,000 fortynning; Invitrogen) ble anvendt for nukleær farging. Snittene ble montert med VECTASHIELD® anti-fade medium (Vector Laboratories) og fluoriserende signaler ble målt ved hjelp av et Olympus FV1000 confocal mikroskop utstyrt med ImageJ programvare. MMP-2 og MT1-MMP uttrykk ble scoret som positiv eller negativ etter trekke med baseline kontroller uten primære antistoff behandling som gir antallet fargede celler av ≥1% eller 0% hhv.
Resultater
Effekter av HPV og HPV Oncoproteiner på
MMP
Expression og Invasion evne
Invasion evne til livmorhalskreftcellelinjer som bærer HPV genom (Siha med HPV16, Caski med HPV16 og HeLa med HPV18) ble sammenlignet med HPV-negative C33A og 293T celler. Alle HPV-positive cellelinjer vises tydelig en evne til å invadere, mens invasivitet av HPV-negative cellelinjer var minimal (Fig. 1A). Høyere invasjon evne ble observert med Siha (5000 celler) og HeLa (11000 celler) sammenlignet med Caski celler (2500 celler) (Fig. 1A). Uttrykket nivåer målt ved hjelp qPCR av 7
MMP
s (
MMP-1, -2, -7, -9, -10, -11 Hotell og
MT1-MMP)
i disse fem cellelinjer viste en sammenheng mellom forekomsten av HPV og en økning i
MMP
transkripsjoner bare av
MMP-2
,
-7 Hotell og
MT1-MMP plakater (fig. 1B). Oppregulering av
MMP-2
ekspresjon ble påvist i både sterkt HPV16- og HPV18-positive celler i forhold til HPV-negative celler, med den høyeste aktiviteten i HPV18-positive HeLa-celler.
MMP-7 Hotell og
MT1-MMP
transkripsjonsnivåer ble signifikant økt i HPV16-positive Siha og Caski celler, men bare litt forhøyet i HeLa-celler (Fig. 1B). Men det var ingen heving av
MMP-10 Hotell og
-11
transkripsjoner i noen HPV-positive celler (Fig. 1B). Disse resultatene indikerer at uttrykk for
MMP-2
,
-7 Hotell og
MT1-MMP
er mer sannsynlig å skje i celler som HPV, spesielt HPV16.
(A) Kvantifisering av invasjonen hjelp migrasjon gjennom filtre belagt med Matrigel for HPV positive (Siha, Caski og HeLa) og negative (C33A og 293T) celler som presenterer som tall av invaderende celler. (B) Relativ uttrykk for
MMP-1
,
-2
,
-7
,
-9
,
-10
,
-11 Hotell og
MT1-MMP
målt i cellelinjer ved hjelp av qPCR. Data ble normalisert til C33A. *:
p
-verdi 0,05 i forhold til C33A. (C) Relativ uttrykk for
MMP-2, -7 Hotell og
MT1-MMP
i C33A-celler som stabilt uttrykker forskjellig HPV16 (
16E6, 16E6F, 16E6 * Jeg, 16E7, 16E6E7
,
16E6 * IE7
), HPV18
(18E6E7) Hotell og lav-risiko HPV6
(6E6)
teinene målt ved qPCR og normalisert til pcDNA3. *
p
-verdi 0,05 sammenlignet med pcDNA3 uttrykker celler. (D) Nivået av HPV-transkripter sammenlignet med kontrollen, HPRT, i hver cellelinje som vist ved RT-PCR. (E) P53 degradering aktivitet 16E6, 16E7 og 16E6E7 ble sammenlignet med western blot analyse. GAPDH ble brukt som lasting kontroll.
For å undersøke sammenhengen mellom høy uttrykk for
MMP-2, -7 Hotell og
MT1-MMP Hotell og HPV teinene, qPCR ble ansatt for å overvåke
MMP
transkripsjonsnivåer i C33A celler som stabilt uttrykker 16E6, 16E6F, 16E6 * jeg, 16E7, 16E6E7, 16E6 * IE7, 18E6E7 og (lav-risiko) HPV6E6. 16E6F, 16E6 * Jeg og 16E7 var i stand til å indusere en økning i
MMP-2
,
MT1-MMP
men ikke
MMP-7
transkripsjoner, sammenlignet med pcDNA3- transfekterte kontrollceller (fig. 1C). C33A celler som uttrykker 16E6 * Jeg viste den laveste
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
transkripsjoner blant HPV16 oncoproteiner testet. I celler som uttrykker 16E6F og 16E6 * I (dvs. 16E6-uttrykke celler) eller 16E6 * Jeg og 16E7 (dvs. 16E6 * IE7-uttrykkende celler) eller 16E6F, 16E6 * Jeg og 16E7 (dvs. 16E6E7-uttrykke celler) var det signifikant økning i
MMP
s transkripsjoner, spesielt de av
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP plakater (fig. 1C). Men i C33A celler som uttrykker 18E6E7, transkripsjonsnivåer av
MMP-2
,
MMP-7 Hotell og
MT1-MMP
ikke var annerledes enn i pcDNA3 uttrykker celler, og som forventet, det var ingen endringer av
MMP
transkripsjoner i lav-risiko HPV6E6 uttrykker celler i forhold til pcDNA3 uttrykker celler. Disse resultatene viser tydelig at HPV16 men ikke HPV18 teinene spesielt forsterke uttrykket av
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
, men ikke av
MMP-7
. Nivåene av HPV16 onkogene transkripter i C33A celler som vist ved RT-PCR i fig. 1D indikerte at
MMP
induserende aktivitet korrelert mer med typer, men ikke dosering av HPV oncoproteiner. De funksjonelle aktiviteter HPV teinene i nedverdigende p53 proteiner ble også vist i 16E6, 16E7 og 16E6E7 uttrykker celler (Fig. 1E).
Invasivitet, Gelatinase aktivitet og MMP uttrykk i C33A celler som uttrykker HPV16 Oncoproteiner
Vi videre fastslått om økninger i
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
transkripsjoner sette til økt invasivitet av HPV16-onkogen uttrykker celler benytte både
in vitro
invasjon ( fig. 2A) og sårtilheling analyser (fig. 2B). HPV16 oncoprotein som uttrykker C33A var mer invasive i begge analysene enn kontroll HPV6E6 uttrykke og pcDNA3-transfektert C33A, med celler som uttrykker en kombinasjon av E6F, E6 * I og E7 (16E6E7) som har den høyeste invasjon evne (fig. 2A og B). Etter hvert som disse cellene har øket
MMP-2
og
MT1-MMP
transkripter, de ble utsatt for gelatin zymografi ved hjelp av lik mengde av proteiner (30 ug) for å bestemme om forhøyede MMP-aktivitet var til stede. Medium fra alle C33A celler viste tilstedeværelse av en gelatinase, tilsvarende pro-MMP-2 (~72 kD) og MMP-2 (~62 kD) [14], med mer intense MMP-2 band som er tilstede i celler som uttrykker 16E6, 16E6 * IE7 og 16E6E7 (fig. 2C). Celler inneholdende lav-risiko HPV6E6 viste lignende gelatinase aktivitet til styre pcDNA3 inneholdende celler (data ikke vist). Gelatin lysis bandet i gelatin zymographies er blitt fastslått ved tilsetning av 5 mM dinatrium EDTA, en gelatinase-inhibitor, i reaksjons og kjører på en separat gel. Forsvinning av de forventede zymographic båndene bekreftet gelatinase aktivitet av disse lyseringsbånd (data ikke vist). Det er verdt å merke seg at den kombinerte tilstedeværelse av 16E6 * Jeg og 16E6F i 16E6 forbedrer aktive MMP-2 nivåer sammenlignet med celler som uttrykker 16E6F eller 16E6 * jeg alene (Fig. 2A, 2B, 2C), noe som tyder på en additiv effekt mellom de to formene av E6 i å stimulere
MMP-2
uttrykk og dermed fremme celle invasjon. Protein nivåer av MT1-MMP i disse cellene ble også bestemt ved western blot-analyse ved anvendelse av anti-humant MT1-MMP-antistoff med GAPDH som en kontroll. Den fold økning av MT1-MMP-ekspresjon ble beregnet ut fra total MT1-MMP (pro-MMP-MT1 og MT1-MMP) med vektoren kontroll angitt som 1. Som vist på fig. 2D, alle celler som inneholder HPV16 proteiner uttrykt både program- (~66 kD) og moden MT1-MMP (~57 kD) med den største band intensiteten av pro-MT1-MMP i 16E6E7 (2,5 ×, total MT1-MMP) og av moden MT1-MMP i 16E6 (2,3 ×, total MT1-MMP), mens vektor kontroll viste bare den pro-MT1-MMP. Disse observasjonene avslørte at invasivitet av HPV16 oncoprotein uttrykke celler korrelerte med MMP-2 aktivitet og MT1-MMP uttrykk.
(A)
In vitro
invasjon og (B) sårtilheling analyser for C33A celler som uttrykker ulike HPV16 teinene. (C) Et representativt gelatin zymographic gel som viser MMP-2 aktivitet normalisert med like mengder av laste protein (30 ug). Bånd tilsvarende den gelatinolytisk aktiviteten til MMP-2 ble kvantifisert ved densitometrisk analyse og sammenlignet med dem som ble oppnådd fra kontroll pcDNA3 uttrykkende celler. (D) Western blot analyse av MT1-MMP hjelp av anti-MT1-MMP-antistoff (ab78738) på 1:1,500 fortynning med GAPDH som lasting kontroll. *
p
-verdi 0,05, **
p
-verdi. 0,01
Effekt på Invasivitet av HPV16E6 Knock-down Cells
for å bekrefte at HPV16 teinene forårsake oppregulering av
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
uttrykk, E6 onkogener i HPV16-positive Siha celler ble slått ned ved hjelp av to shRNAs (shE6A og shE6B) målretting forskjellige områder av 16E6 mRNA [23]. Ved hjelp av RT-PCR, er nivåene av HPV16E6F, 16E6 * I og 16E7 transkripter i Siha celler ble vist å være redusert med ~ 50% etter transfeksjon med shE6A, mens bare en 10-30% reduksjon ble påvist i cellene transfektert med shE6B (fig. 3A). Bare
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
men ikke
MMP-7
transkripsjoner ble redusert i E6 knock-down Siha celler (fig. 3B). Når like mengder av protein (20 ug) fra det kondisjonerte mediet ble analysert ved zymografi gelatin, ble det observert at MMP-2 aktivitet i shE6A-transfekterte celler ble redusert sammenlignet med pSUPER og shCtrl transfekterte kontrollceller (Fig. 3C). Cellelysater (30 mikrogram protein hver) analysert ved hjelp av vestlige blotter å vurdere MT1-MMP nivåer med GAPDH som kontroll, viste en svak nedgang (~ 30% og ~40% reduksjon i shE6A og shE6B henholdsvis) av MT1-MMP nivåer i både knock- ned celler sammenlignet med shCtrl kontroller (fig. 3D). Interessant, MT1-MMP-proteiner detektert i Siha cellene var hovedsakelig den modne MT1-MMP (57 kD). I samsvar med disse funn både shRNA-transfekterte celler, særlig shE6A, hadde betydelig redusert invasivitet (-48%) og sårtilheling evne (~ 50%), sammenlignet med shCtrl celler (fig. 3E). Dermed ablasjon av HPV16E6 /E7 onkoproteiner reduserer MMP-2 aktivitet, MT1-MMP uttrykk og til slutt invasivitet av HPV16-positive Siha celler.
(A) RT-PCR av
16E6F, 16E6 * I
og
16E7
transkripsjoner normalisert til kontrollen,
HPRT
. Siha celler transfektert med ikke-måls shCtrl og kjøretøy kontroll pSUPER ble brukt som negative kontroller. shE6A og shE6B er to forskjellige shRNAs brukes i knock-down eksperimenter. (B) qPCR av
MMP-2
,
-7 Hotell og
MT1-MMP
utskrifter og (C) MMP-2 aktivitet som analysert av gelatin zymografi, med lik mengder av protein (20 pg), i shRNA transfekterte celler. (D) MT1-MMP protein i slått ned celler som avgjør ved western blot analyse med GAPDH som lasting kontroll. (E) Invasion evne Siha celler transfektert med forskjellige shRNAs som bestemmes av
in vitro
invasjon og sårtilheling analyser. Relativ fold av celle invasjon med ubehandlede celler ble satt som en rapporteres. *
p
-verdi. 0,05 sammenlignet med shCtrl celler
Redusert Invasivitet av spesifikke hemmere til MMP-2 og MT1-MMP
For å avgjøre om selektiv hemming av endogent MMP-2 eller MT1-MMP svekke invasjon egenskaper, både Siha og 16E6E7 uttrykker C33A cellelinjer ble behandlet med OA-Hy, en spesifikk inhibitor for MMP-2, (fig. 4A, 4B) og anti-MT1-MMP, et spesifikt antistoff for det katalytiske domenet av MT1-MMP (fig. 4C). Våre resultater viste tydelig at behandling av OA-Hy resulterte i en signifikant reduksjon i celle invasjon for både 16E6E7 (~70% ved 10 uM) (Fig. 4A) og Siha-celler (~65% ved 20 uM) (fig. 4B) på en doseavhengig måte. Tilsvarende MT1-MMP-inhibering ved hjelp av det spesifikke antistoff klart redusert invasivitet (~ 50%) av begge cellelinjer sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 4C). Våre eksperimenter bekreftet at invasjonen av HPV16-infiserte celler var avhengig av MMP-2 og MT1-MMP uttrykk. Siden det har vært kjent at dannelsen av en MT1-MMP /TIMP-2 /pro-MMP-2-komplekset er nødvendig for aktivering av pro-MMP-2 av MT1-MMP på celleoverflaten, nivåene av TIMP-2- uttrykk i alle HPV16 oncoprotein uttrykker celler ble også undersøkt. Interessant nok var TIMP-2-ekspresjon funnet å være noe økt både på mRNA (~3 x) og protein (ca. 2 x) nivå i alle celler sammenlignet med kontrollen pcDNA3 med unntak av lav-risiko HPV6E6 som oppviste TIMP -2 uttrykk kan sammenlignes med den tomme vektoren (fig. 4D). Enten HPV teinene direkte forbedret uttrykk for TIMP-2 er fortsatt ikke bestemt.
(A) Cell invasjon som bestemmes ved hjelp av
in vitro
invasjon og sårtilheling av HPV16E6E7 uttrykke celler og (B) Siha celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av MMP-2-inhibitor, OA-Hy. (C) De samme cellelinjer ble også behandlet med anti-MT1-MMP-antistoff (20 pg /ml). Relativ fold av celle invasjon med pcDNA3 kjøretøykontroll eller ubehandlede celler settes som en ved φ
p
0,05 sammenligne pcDNA3 og *
p
-verdi 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler er vist. (D) TIMP-2-protein (normalisert med lik belastning protein av 5 ug) ble påvist ved hjelp av Western blot-analyse med et anti-TIMP-2-antistoff (Abcam, 1:1,000 fortynning) og TIMP-2 transkripter ble målt ved qPCR (normalisert til HPRT) for HPV16 oncoprotein uttrykke celler.
Transkripsjonell upregulating aktivitet av HPV16 Onkogener på
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
Arrangøren
arrangøren konstruksjoner som inneholder 5′-oppstrømssekvenser, nemlig -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 og -211 /+ 40 fra
MMP-2
promoter og -1277 /+ 187, -425 /187 og -151 /+ 187 fra
MT1-MMP
promoter smeltet sammen med luciferasereportergenet i plasmid pGL3-Basic ble generert. Hver konstruksjon ble deretter transfektert inn C33A stabilt uttrykker HPV16E6E7. I nærvær av HPV16E6E7, luciferase aktiviteten til -1721 /+ 40
MMP-2
konstruksjon ble vist å være sammenlignbar med den til -1001 /+ 40 visning 4,6 og 3,9 ganger større enn det ekspresjon av kontrollceller transfektert med den tomme pGL3-Basic vektor eller ~ 2-ganger økning av både promoter-aktivitet sammenlignet med basalnivå i pcDNA3 uttrykkende celler (fig. 5A). Lignende resultater ble oppnådd fra
MT1-MMP
promotorkonstruksjoner (Fig. 5B). Disse resultatene tyder på at sekvenser som er ansvarlige for formidling av HPV16 oncoprotein aktivitet bør ligge innenfor -1001 /+ 40 og -425 /+ 187 regioner i
MMP-2 Hotell og
MT1-MMP
arrangører, henholdsvis. Begge inneholdt PEA-3 (på -552 og -540 for
MMP-2
og -303 for
MT1-MMP
) og SP1 (ved -91 for MMP-2 og -102 for
MT1-MMP
) bindingsseter som tyder på at HPV16 teinene utøve sin trans aktivitet gjennom disse områdene på en lignende måte. Mangelen på p53 og fjern PEA-3 bindingsseter i
MMP-2
promoter og TIE-lignende sekvenser i
MT1-MMP
promoter konstruksjoner indikert at disse områdene ikke var ansvarlige for å formidle effekten av HPV oncoproteiner. Men de minste konstruksjoner av
MMP-2
promoter (-211 /+ 40) som inneholder en av hver av SP1, AP2 og PEA-tre bindingssteder og av
MT1-MMP
promoter (
