Abstract
MUC4 mucin er en høy molekylvekt, membranbundet, og svært glykosylert protein. Det er et multi-domene protein som er putatively spaltes inn i en stor mucin-lignende subenhet (MUC4α) og en C-terminal vekstfaktor-lignende subenheten (MUC4β). MUC4 spiller avgjørende roller i fysiologiske og patologiske tilstander, og er abnormt overuttrykt i flere krefttyper, inkludert de i bukspyttkjertelen, livmorhals, bryst og lunge. Det er også en potensiell biomarkør for diagnose, prognose og progresjon av mange ondartede sykdommer. Videre spiller MUC4 ulike funksjonelle roller i kreft initiering og progresjon som fremgår av sitt engasjement i onkogene transformasjon, spredning, hemming av apoptose, motilitet og invasjon, og motstand mot kjemoterapi i humane kreftceller. Vi har tidligere generert et monoklonalt antistoff 8G7, som er rettet mot TR-regionen i MUC4, og har vært mye brukt for å studere ekspresjonen av MUC4 i flere ondartede sykdommer. Her beskriver vi generering av anti-MUC4 antistoffer rettet mot de ikke-TR regioner av MUC4. Rekombinant glutation-S-transferase (GST) -fused MUC4α fragmenter, både oppstrøms (MUC4α-N-Ter) og nedstrøms (MUC4α-C-Ter) av TR domene, ble anvendt som immunogener for å immunisere BALB /c-mus. Etter cellefusjon ble hybridomer screenet ved anvendelse av de foran nevnte rekombinante proteiner ad lysatene fra humane pankreatiske cellelinjer. Tre anti MUC4α-N-Ter og en anti-MUC4α-C-Ter-antistoffer ble karakterisert ved flere inmmunoassays inkludert enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), immunoblotting, immunofluorescene, flowcytometri og immunoutfelling under anvendelse av MUC4 uttrykkende humane bukspyttkjertel cancer-cellelinjer. Antistoffene reagerte også med den MUC4 i humane pankreatiske tumorsnitt i immunhistokjemisk analyse. De nye domenespesifikke anti-MUC4 antistoffer vil tjene som viktige reagenser for å studere struktur-funksjon forholdet mellom MUC4 domener og for utvikling av MUC4-basert diagnostikk og terapi
Citation. Jain M, Venkatraman G, Moniaux N, Kaur S, Kumar S, Chakraborty S, et al. (2011) monoklonale antistoffer Erkjenner ikke-Tandem Gjentatte Regions of Human mucin MUC4 i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (8): e23344. doi: 10,1371 /journal.pone.0023344
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 27 juni 2011; Godkjent: 12 juli 2011; Publisert: 23 august 2011
Copyright: © 2011 Jain et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne på dette arbeidet er støttet, delvis med tilskudd fra United States Department of Defense (BC074639, BC083295, BC09742, og PC074289) og National Institutes of Health (R21 CA156037, RO1 CA78590, UO1 CA111294, RO1 CA131944, RO1 CA133774, RO1 CA138791, RO3 CA 139 285 og P50 CA127297). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Humant MUC4 er en svært glykosylert membran-assosiert mucin, som består av en stor 850 kD-mucin-lignende subenhet MUC4α, og en membranbundet 80 kD vekstfaktor-lignende subenheten MUC4β [1], [2] . MUC4α inneholder en sentral tandem gjentagelse (TR) domene inneholdende variable mengder 16 aminosyre-rester motiver som kan gjentas opp til 400 ganger per molekyl. TR domene er flankert av et C-terminalt cystein rik domene og et N-terminalt domene som inneholder tre gjentakelser av 123 aminosyrerester [1]. MUC4β inneholder en cystein rik domene, en domene rik på N-glykosyleringsseter og tre EGF-lignende domener [1]. MUC4 er ansett for å være en human homolog av rotte sialo-mucin-kompleks (SMC, rotte Muc4) på grunn av likheter i strukturelt [1], [3], [4]. SMC er et heterodimert glykoprotein som består av en O-glycosylert mucin subenhet, ascites sialoglycoprotein (ASGP-1), tett bundet til et N-glykosylert transmembran-underenhet, ASGP-2, som inneholder to epidermal vekstfaktor-lignende domener i dens ekstracellulære del [ ,,,0],3], [4].
MUC4 er uttrykt i forskjellige epitelvev, herunder epitel av føtale lungene og voksen luftveis fra luftrøret til oppsamlingskanalene lunge trachea [5], tykktarm [6], endocervix [7], conjunctiva [8], hornhinnen [9], spyttkjertlene [10], mellomøret og øretrompeten [11]. I nyere studier, har en progressiv økning i MUC4 uttrykk blitt observert i bukspyttkjertelen intraepitelial neoplastiske lesjoner, noe som indikerer dens rolle i sykdomsutvikling [12]. Tidligere studier fra vårt laboratorium har vist at hemming av MUC4 uttrykk hjelp av anti-sense eller kortinterfering RNA (siRNA) oligonukleotider som er spesifikke for MUC4 resulterer i en redusert tumorigenicity og spredning av kreftceller [13]. Videre har våre nylige studier har vist at MUC4 resulterer i onkogene transformasjon av musefibroblaster [14], bidrar til den medikamentresistens av kreft i bukspyttkjertelen celler ved aktivering av anti-apoptotiske reaksjonsveier [15], og er involvert i den epiteliale-til-mesenchymale overgang i eggstokkreft celler [16]. Disse studiene fra vårt laboratorium og andre grupper indikerer den potensielle betydning av dette mucin i ulike aspekter av tumorbiologi.
Vi har tidligere generert et panel av monoklonale antistoffer rettet mot TR-regionen i MUC4 [17]. En av de anti-MUC4 TR antistoffer, 8G7, har fungert som en verdifull reagens for å studere uttrykk for MUC4 mucin i ulike vev og løse sitt engasjement i ulike maligniteter inkludert, bukspyttkjertel [12], [18], mage [19] , cervical [20], eggstokkreft [21], ekstra lever gallegang kreft [22], colangiocarcinoma [23], og kutant plateepitelkarsinom. Imidlertid inneholder MUC4 mange strukturelle og funksjonelle domener både oppstrøms og nedstrøms av den TR region [1], [2], og mange spleisede former av MUC4 er helt blottet for TR region [24], [25]. Videre er det TR region tungt O-glycosylert. Gitt den endring i status glykosylering av faste tumorer, er det mulig at reaktiviteten til antistoffet kan være skjult i visse maligniteter. Således, den strukturelle kompleksitet MUC4, eksistensen av flere spleisevarianter og glykoformer, og tung O-glykosylering i TR domene garantert genereringen av ytterligere antistoffer til fullt ut å forstå den struktur-funksjon relasjonen for forskjellige MUC4 domener under fysiologiske og patologiske tilstander.
Her rapporterer vi produksjon og karakterisering av en ny anti-MUC4 MAb som gjenkjenner regionene MUC4α både oppstrøms og nedstrøms for TR domene. Rensede rekombinante MUC4 fragmenter, sammensmeltet i ramme med GST, ble benyttet som immunogener, og positive kloner ble utvalgt basert på deres reaktivitet i ELISA. Utvalgte kloner ble preget av sin reaktivitet mot MUC4 i immunoblotting, immunpresipitering, immunfluorescens og flowcytometri ved hjelp av kreft i bukspyttkjertelen celler. De ikke-TR anti-MUC4 MAb som er utviklet i denne undersøkelsen kan være lovende reagenser for å utvikle analyser for kvantifisering av MUC4 i vev og biologiske fluider, for å studere den funksjonelle rolle av MUC4 i forskjellige sykdommer og potensielt for immunterapi.
Resultater
skjematisk struktur av MUC4 og rekombinante domener er angitt i Figur 1a. Etter cellefusjon, ble kultursupernatanter fra stabile hybridomer screenet og de positive hybridomene som oppviser høy reaktivitet med rekombinante proteiner og negativ reaktivitet med GST ble klonet ved tre runder med begrensende fortynning. Syv stabile kloner som er reaktive med MUC4α-N-Ter og tre kloner som er reaktive med MUC4α-C-Ter ble erholdt (tabell 1 og figur 1b). MAbs 2172, 2173, 2175, 2212, 2213, 2214 og 2382 viste spesifikk reaktivitet overfor MUC4α-N-Ter, mens MAbs 2103, 2106 og 2107 var spesifikke for MUC4α-C-Ter. Videre har ingen av de valgte antistoffene viste noen reaktivitet mot renset MUC4 TR peptid, BSA eller GST (data ikke vist). På samme måte som tidligere genererte anti-MUC4 TR-antistoff 8G7 eller anti-KLH antistoff K2G6 viste ingen reaktivitet overfor de rekombinante MUC4 domenene.
a) Skjematisk struktur av MUC4 og rekombinante proteiner anvendt i studien. MUC4 er putatively spaltes ved GDPH området for å generere en N-terminal mucin-type subenhet MUC4-α og en C-terminal vekstfaktor-type subenheten MUC4-β. Viktige områder av MUC4 er merket. Rekombinante domener av MUC4- α som tilsvarer fragmentene oppstrøms og nedstrøms for tandem-repeat (TR) domene ble klonet og uttrykt som beskrevet i Materialer og Metoder og betegnet MUC4-α-N-ter og MUC4-α-C-Ter, henholdsvis. Nukleotid-tall som tilsvarer grensene for de rekombinante domenene er merket og er beskrevet i Moniaux et al. og Choudhury et al (Ref 1 og 24, henholdsvis) i henhold til den opprinnelige nummerering. Cys-cystein-rike domenet EGF-epidermal vekstfaktor-lignende domene; TM-transmembrane domene; CT-cytoplasmatiske hale. b) ELISA som viser reaktiviteten av anti-MUC4 MAb til rekombinante immunogener. De angitte MAb ble inkubert med 2,5 ug /ml av GST-merket N-terminale og tandem gjentatte rekombinante domener av MUC4. Spesifisitetene ble også testet mot MUC4 TR peptid, GST og et ikke-spesifikt kontroll-protein, bovint serum albumin og antistoffer oppviste negativ reaktivitet mot disse antigenene. Analysen omfattet også en uspesifikk isotypematchende kontroll K2G6.
Antistoffene ble videre testet for deres evne til å spesifikt gjenkjenne MUC4 protein i lysatene av MUC4 uttrykke bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved immunoblotting. Av de syv MUC4α-N-Ter-spesifikke antistoffer bare MAb 2214, 2175 og 2382 erkjente MUC4 protein i cellelysatene (figur 2). MAb 2215 og 2382 føres med høy molekylvekt proteinbånd i lysatene av MUC4 positive celler (HPAF /CD18, Colo357, QGP1 og T3M4) (Fig. 2a og 2c) og reaktiviteten mønsteret var lik den til anti-TR MAb 8G7 (fig. 2d). Hver av de MUC4 positive cellelinjer viste en karakteristisk distinkt bandet størrelse som er forenlig med våre tidligere rapporter om VNTR polymorfismer i MUC4 med HPAF /CD18, Colo357 og QGP1 viser et enkelt band og T3M4 uttrykker to band (allel VNTR polymorfi). I motsetning til MAb 2175, 2382 og 8G7, MAb 2214 omsatt med overveiende lav molekylvekt form av MUC4 men med bandet mønster som svarer til den VNTR polymorfisme (figur 2b). Mab 2214 viste også veldig svak reaktivitet med høy molekyl bånd tilsvarende de som er gjenkjent av andre antistoffer i QGP1 og T3M4 lysater. Immunoblot-analyse av β-aktin i SDS-PAGE løst lysater indikert lik protein lasting (figur 2, innfelt). Ingen reaktivitet ble observert med noen antistoff med lysatet til MUC4 negative cellelinje MiaPaCa. Ingen av de anti-MUC4α-C-Ter-antistoffer reagerte med MUC4 i cellelysatene på immunblotting (data ikke vist).
I alt 20 ug protein fra celle-ekstrakter ble løst ved elektroforese på en 2% SDS-agarosegel, overført til PVDF-membran, og inkubert med 2 ug /ml MAb 2175 (a) 2214 (b), 2382 (c) eller 1 pg /ml av anti-MUC4 TR Mab 8G7 (d). Membranen ble deretter probet med pepperrot peroksidase-merket geit anti-mus immunoglobulin. Signalet ble oppdaget ved hjelp av en ECL-reagens kit. Posisjonen av de detekterte båndene er angitt med piler. For lasting kontroll, ble immunoblot for påvisning av β-aktin (innfelt a) utført på lysater av de respektive cellene oppløst på 10% SDS-PAGE.
Evnen av antistoffer til å gjenkjenne MUC4 i det intakte -celler ble undersøkt ved immunfluorescens og strømningscytometri. I metanol fast og permeabilized analysen HPAF /CD18 celler alle de valgte MAbs utstilt spesifikk farging for MUC4; ingen farging ble observert med kontroll anti-KLH antistoff K2G6 (figur 3). MAb 2214 viste en både membran og perinukleær flekker, mens MAbs 2175, 2382 og 2106 viste cytoplasma og membranfarging. Den anti-TR MAb 8G7 viste sterkest reaktivitet på grunn av repeterende natur av epitoper. Videre har ingen av antistoffene viste noen reaktivitet med MUC4 negative bukspyttkjertelkreft cellelinjer MiaPaCa eller Panc1 (data ikke vist). For celleoverflatefarging, ble parformaldehyde fiksert (unpermmeabilized) celler som brukes, og binding av antistoffene ble analysert ved flow-cytometri. MAb 2214 utviste den sterkeste reaktivitet med celleoverflaten i paraformaldehyd-fikserte celler, mens overflate reaktiviteten av MAb 2175 og 2382 var svak og midlere fluorescensintensitet (MFI) verdier var sammenlignbare med verdiene oppnådd med Mab 8G7 (figur 4).
Celler ble dyrket ved lav tetthet på steriliserte dekkglass, fiksert i iskald metanol ved -20 ° C og ble inkubert med 10 ug /ml ikke-TR MAb fra 2214, 2175, 2382 og 2106, eller 2 ug /ml av anti-MUC4 TR MAb 8G7 (kontroll) og påvist ved anvendelse av FITC-konjugert sekundært antistoff. Anti-KLH-antistoff K2G6 ble anvendt som en isotype-kontroll. Celler ble montert på glassplater ved hjelp av anti-fade Vectashield monteringsmedium og observert under en ZEISS konfokal laser scanning mikroskop (forstørrelse, × 630).
Celler ble høstet ikke-enzymatisk, festes med paraformaldehyde og inkuberes med de angitte antistoffer. Etter inkubering med sekundært antistoff, ble cellene analysert ved hjelp av BD FACSCalibur. De gjennomsnittlige fluorescensintensiteter (MFI) verdier oppnådd med hvert antistoff er angitt i parentes.
domene-spesifikke anti-MUC4 antistoffer ble også testet for deres evne til å immunoutfelle MUC4 ved hjelp av HPAF /CD18-lysat. MAb 2382 2175, 2214 og immunopresipitert med full lengde MUC4 fra de totale cellelysatene, som ble visualisert når de behandlede prøvene ble løst på SAS-agarosegel og immunoblottet med anti-MUC4-TR MAb 8G7 (figur 5). De immunoutfelte prøver fra forskjellige antistoffer ble også immunoblottet med MAb 2214 på grunn av den dominerende reaktivitet med en lavere molekylvekt form av MUC4. Når undersøkt med MAb 8G7, ble det høyeste beløpet av MUC4 immunopresipitert med 8G7, mens MAb 2382 også resultert i betydelig berikelse av 8G7 reaktivt protein band. MAbs 2175 og 2214 også immunopresipitert full lengde 8G7 reaktiv band, men berikelse var ikke så sterk som observert med MAb 8G7 og 2382. Anti-C-terminal MAb 2106 og negativ kontroll anti-KLH antistoff K2G6 ikke trekke ned noen 8G7 reaktiv protein band. Imidlertid har ingen av de testede antistoffer med unntak av 2214, immunopecipitated MAb 2214-reaktivt med lav molekylvekt form av MUC4.
Protein lysater fra de MUC4-uttrykkende CD18 /HPAF celler ble immunopresipitert ved bruk av 5 ug /ml av 8G7 ( tandem gjenta MAb), 2382, 2214 og 2175 (Non-tandem gjenta MAbs) og K2G6 (isotypematchende kontroll MAb) og ble immunblottet hjelp MAb 8G7 og 2214 som beskrevet i materialer og metoder.
evne til å detektere antistoffer MUC4 i tumorvev ble testet ved immunhistokjemiske analyser av kreft i bukspyttkjertelen vev. MAb 2214, 2175 og 2382 viste positiv farging i tumorvevet som ble bestemt til å være positiv MUC4 basert på dets reaktivitet med anti-TR MAb 8G7 (figur 6). Mønsteret av farging med de nye antistoffer som var lik den som er observert med 8G7 viser diffus farging i både membranen og cytoplasma av tumorcellene. Ingen farging ble observert med Mab 2106 eller den ikke-spesifikke isotype matchet kontroll MAb K2G6.
Parafinsnitt ble inkubert med de angitte test- og kontrollantistoffer, og binding ble påvist ved anvendelse av VECTOR Universal fargingssett. MAb 8G7 ble anvendt ved en konsentrasjon på 2 ug /ml, mens alle andre antistoffer ble anvendt ved en konsentrasjon på 10 ug /ml.
diskusjon
MUC4 er et stort glykoprotein som er involvert i fysiologi og innblandet i ulike sykdomstilstander. Av særlig betydning er dens rolle i bukspyttkjertelkreft utvikling og progresjon [2], [26], [27]. En rekke nyere studier har etablert rolle av trans mucin MUC4 i patogenesen av mange ondartede sykdommer. MUC4 består av to domener, nemlig MUC4α som har den tandem repeterende regionen og MUC4β som har det trans-membran-regionen og også besitter vekstfaktor lignende domener [1], [2]. På grunn av den polymorfisme i antall tandemrepetisjoner [28] og eksistensen av forskjellige spleiseformer fullstendig blottet for TR domenet [25], de antistoffer som gjenkjenner de ikke-tandem gjentatte områder i proteinet som kunne gi nyttig informasjon om dens funksjon , mulige samvirkende partnere og enda viktigere kan benyttes i kvantitative analyser.
Tre av antistoffer dannet mot regionen oppstrøms for det sentrale domenet TR 2214, 2175 og 2382, og en av de antistoffer som er utviklet mot nedstrøms TR domene, 2106 viste sterk reaktivitet mot de respektive rekombinante domener i ELISA. Ingen av antistoffene gjenkjenner uspesifikke rekombinante domener, GST eller syntetisk TR peptider. Disse antistoffene kan potensielt tjene som nyttige reagenser for utvikling av MUC4 bioassay og kan utfylle eksisterende anti-MUC4 TR-antistoff eller andre antistoff som er reaktive mot karbohydrat-epitopene som er tilstede på slimstoffer (DUPAN2, CA 19,9, Tag 72). Økende bevis tyder på at det MUC4 mucin, på grunn av sin over-ekspresjon i en rekke kreftformer, er en mulig markør for diagnose [27], spesielt for den dødelige kreft i bukspyttkjertelen, hvor dens assosiasjon med de tidlige neoplastiske lesjoner er blitt etablert [29]. En annen fersk studie har vist MUC4 å være en roman prognostisk faktor på utenomlever gallegang kreft [22]. MUC4 uttrykk var korrelert med dårlig prognose i liten størrelse lunge adenokarsinom [30]. Alle disse studiene har vist at MUC4 kan være en sentral aktør i tumorigenesis; Men alle disse studiene har analysert MUC4 i vevsprøver, som kan være begrenset av utvalgsfeil, på grunn av den heterogene ekspresjon av tumorantigener. Derfor ville det være logisk å utvikle kvantitative analyser for MUC4 i biologiske væsker, som vil være ikke-invasiv, kostnadseffektiv og lett automatiseres. På grunn av den variable størrelse på den tandem repeterende regionen, kan det antistoff som gjenkjenner den tandem repeterende regionen ikke brukes til kvantitative formål. Den domene-spesifikke antistoffer potensielt kan bidra til å utvikle
in vitro
diagnostiske analyser for å kvantifisere MUC4 i serum og andre biologiske fluider.
Alle antistoffer som er reaktive med regionen oppstrøms for det MUC4 TR domenet var i stand å gjenkjenne MUC4 i cellelysatene av MUC4-uttrykkende kreft i bukspyttkjertelen celler. MAb 2175 og 2382 erkjente full-lengde MUC4 med en høy molekylvekt, med et band størrelse lik den som er gjenkjent av anti-TR MAb 8G7. Forskjellen i signalstyrken av de ikke-TR og TR-antistoffer kunne tilskrives antall epitoper tilgjengelige for MAb bindes, ettersom 8G7 gjenkjenner tandem repeterende regionen, som er representert flere ganger i hvert molekyl, mens epitopene gjenkjent av 2175 og 2382 er representert kun en gang per molekyl. I motsetning til dette Mab 2214 oppviste sterk gjenkjennelse av et proteinbånd av mindre størrelse enn de som er gjenkjent av MAb 8G7, 2175 og 2382. Til tross for deres lavere molekylstørrelse, disse båndene speilet allelisk variasjon som oppvises av den full-lengde MUC4 for de respektive cellelinjer Dette tyder på at Mab 2214 muligens reagerer med en umoden eller underglycosylated form av MUC4. Meget svake bånd tilsvarende høy molekylvekt modne protein ble fortsatt detektert i QGP1 og T3M4. Jo sterkere signalstyrken av Mab 2214 med de nedre bånd kan være grunn til overflod av en umoden MUC4 protein i kreftcellene. I kreftceller er det vel etablert at på grunn av avvikende og ineffektive glykosylering, er slimstoffer hypoglycosylated og disse umodne formene kontinuerlig gjennomgår gjentatte sykluser av internalisering, noe som resulterer i en mer umoden form enn den modne formen. Men på-membran deglykosylering (enzymatisk eller kjemisk) av oppløste proteinbånd ikke øke reaktiviteten av Mab 2214 med de modne MUC4 båndene (data ikke vist). Men i paraformadehyde fikserte celler, MAb 2214 oppviste den høyeste reaktivitet med celleoverflaten. Den umodne proteinet er lite sannsynlig å være til stede på celleoverflaten, og eventuelt fiksering av celler med paraformaldehyd eksponert MAb 2214 reaktive epitop. Ytterligere karakterisering av den lavmolekylære form av MUC4 reaktivt med Mab 2214 er i gang.
Immunofluorescens-analyse viste spesifikk farging for MUC4 i membraner, så vel som i de cytoplasmatiske avdelinger av HPAF /CD18-celler. Det fargemønster var sammenlignbart med det anti TR Mab 8G7 og deres spesifisitet til MUC4 ble ytterligere understøttet av den manglende signal i MUC4 negative celler. Den perinukleær farging av Mab 2214 støtter videre sin reaktivitet til umodne protein.
På grunn av sin store størrelse og multi-domene organisasjon, kan MUC4 potensielt samhandle med mange proteiner og disse interaksjonene kan være nøkkelen til ulike funksjoner tilskrives til MUC4. Dets interaksjon med HER2 og den funksjonelle signifikansen av dette er blitt godt undersøkt [31], [32]. Men det er mange andre mulige samvirkende partnere MUC4 som kan spille en viktig rolle i modulerende eller formidling MUC4 funksjon. MAb 2175 og 2382 var i stand til å immunoutfelle det MUC4 proteinet fra cellelysatene av HPAF /CD18-celler og kan dermed bidra ved isolering og identifisering av ytterligere MUC4 samvirkende partnere. Videre er den dominerende reaktiviteten av MAb 2214 til lavere molekylvekt MUC4 antyder en annen form for MUC4 som ko-eksisterer med det modne protein. Hvis, faktisk, det er umoden form av protein, så MAb 2214 kan potensielt bidra i isolering av forskjellige nye samspill partnere som kan samhandle med denne formen for MUC4 og løse sin funksjonelle betydning.
MAbs 2214, 2175 og 2382 også anerkjent MUC4 uttrykt i kreftvevet ved immunhistokjemisk analyse med reaktiviteten mønster som ligner på den som ble observert med anti-TR Mab 8G7. Ingen av de normale bukspyttkjertel kanaler var farget, noe som er i tråd med våre tidligere studier som har vist et fravær av MUC4 uttrykk i de ikke-neoplastiske kanaler. De nye antistoffer kan være nyttige verktøy for å underbygge resultatene oppnådd fra 8G7, tyder overekspresjon av MUC4 i ulike kreftformer. Videre, på grunn av den ikke-repeterende natur av deres reaktive epitoper, vil de nylig utviklet antistoffer tilveiebringe en mer fornuftig mål på graden av overekspresjon av negere virkningene av VNTR polymorfisme. Den anti-TR-antistoff 8G7, vil imidlertid gi større følsomhet for deteksjon på grunn av det store antall av epitoper. Dermed kan en kombinasjon av anti-TR og anti-ikke-TR MUC4 antistoffer gi bedre informasjon om omfanget av MUC4 overekspresjon i tumorvev.
Det arbeides med å studere de direkte hemmende effekter av antistoffene på kreft cellevekst, motilitet og invasjon under både
in vitro Hotell og
in vivo
forhold. Vårt nylige studier har vist at MUC4 bidrar til chemoresistance i kreft i bukspyttkjertelen celler ved aktivering av anti-apoptotiske reaksjonsveier og fremme celleoverlevelse [15]. Derfor vil det være av interesse å studere effekten av anti-MUC4-antistoffer til å indusere apoptose i kreftceller og forsterke deres sensitivitet overfor kjemoterapeutiske medikamenter. Videre disse antistoffene må også bli vurdert for deres nytte i radioimmunodiagnosis og radioimmunterapi av MUC4 overekspresjon svulster. Funksjonelle studier med ikke-tandem gjenta MAbs kan trolig gi en bedre forståelse av MUC4 medierte mekanismer i kreft progresjon. Disse antistoffene kan også hjelpe til med å forstå MUC4 struktur-funksjon relasjoner, regulering av uttrykk og muligens identifisere en sannsynlig samspill partner på tumorcelleoverflaten, noe som kan være årsaken til den metastatisk fenotype.
I konklusjonen, våre studier indikerer at MAb 2175 og 2382 er svært spesifikk påvisning av ikke-tandem gjentagelse regionen av mucin MUC4 av ulike immunologiske analyser. Disse domene spesifikke antistoffer ville tjene som nyttige reagenser for å utvikle kvantitative analyser, og er verdifulle verktøy for å studere MUC4 struktur-funksjon relasjoner og muligens målrette MUC4 for behandling av solide svulster som overuttrykker MUC4.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
bruk av dyr for immunisering og isolering av milten ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) Protocol # 94-025-12 tittelen «monoklonalt antistoff Kjerne Facility immunization Protocol» .
menneske~~POS=TRUNC pankreas tumorvev ble hentet fra University of Nebraska Medical Center (UNMC) Tissue Bank og deres bruk ble godkjent via UNMC Institutional Review Board (IRB) godkjennelse # 491-97-EX.
Generering av rekombinante MUC4 domener
Regions of MUC4-α på hver side av TR domene ble klonet og uttrykt, og rensede proteiner ble anvendt som immunogener. Spesifikke primere ble utformet ved hjelp MUC4 sekvens AJ000281 å forsterke fragmenter fra nukleotider 587 til 3361 [MUC4α-amino Terminal (MUC4α N-ter)] og fra nukleotider 1-1293 [MUC4α-karboksyterminale (MUC4α C-ter), som representerer regionene umiddelbart oppstrøms og nedstrøms for TR domenet, henholdsvis (figur 1a). BamHI og et EcoRI restriksjons ble lagt i de fremover og revers primere, henholdsvis, slik at i-frame kloning med GST og trombin spalting stedet for det pGEX-2TK vektor (Pharmacia). Amplification ble gjort av utvide lenge RT-PCR system (Roche) som tidligere beskrevet ved hjelp JER103 og JER109 som maler for sekvens AJ00281 og AJ010901 henholdsvis [1]. De konstruksjoner ble sekvensert for å bekrefte den riktige leseramme og opprettholdes i E. coli BL21 (New England Biolabs Inc.). En 5 ml over natten forkultur av hver rekombinant stamme ble anvendt til å inokulere en liter 2 x YTA-medium (16 g trypton, 10 g gjærekstrakt og 5 g NaCl i 900 ml avionisert vann, 100 ug /ml ampicillin), og dyrket under omrøring ved 37 ° C i 3 til 4 timer for å oppnå en absorbans ved 260 nm mellom 0,6-0,8, indusert av 0,1 mM IPTG, og dyrket i en tilsetning av 3 til 4 timer. Kulturer ble sentrifugert og vasket tre ganger i iskald PBS, resuspendert i 5 ml iskald PBS og sonikert. Protein lysater ble klaret ved sentrifugering og ved filtrering på et 0,22 mikrometer filter. Lysater ble ført gjennom en 5 ml glutation Sepharose Fast Flow kolonne (Pharmacia), vasket tre ganger med 5 kolonnevolumer av PBS, og eluert med 10 ml 15 mM redusert glutation. Eluering fraksjoner på 1 ml ble oppsamlet og 5 ul aliquot av hver fraksjon ble løst i 10% SDS-PAGE, og proteinene detektert ved Coomassie blå farging. Fraksjoner inneholdende ren GST-fusjonsproteinene ble slått sammen og kvantifisert ved hjelp av BIO RAD-D /C-protein estimering-sett (BIO-RAD).
Mus Immunisering
immunisering og valg av MAb ble gjennomført ut ved hjelp av etablerte prosedyrer ved UNMC antistoff Kjerne Facility [17]. I korthet, ble separate grupper av mus (BALB /c) immunisert ved gjentatte IP-injeksjoner av rekombinant GST fusjonsproteiner MUC4α-N-Ter og MUC4α-C-ter med to ukers mellomrom. I hver gruppe, ble immunisering med rekombinant protein vekslet med lysatet av MUC4 positiv HPAF /CD18 humane kreft i bukspyttkjertelen celler [17]. Sera fra disse mus ble evaluert ved direkte bindingsanalyser for antistoff reaktivitet med det rekombinante MUC4 fusjonsprotein, og GST ble anvendt som en negativ kontroll. Når en passende antistoff-respons ble observert i ELISA, ble dyrene gitt en avsluttende booster-injeksjon med det rekombinante protein fire dager før blodtapping og splenektomi. Splenocytter ble isolert og fusjonert med NS-1 og /eller Sp2 /0-myelomceller. Hybridomer som produserer antistoffer av interesse ble valgt ved screening for spesifikk antistoffbinding til det immunogen av interesse (rekombinante proteiner og HPAF /CD18 lysat) og mangel på binding til irrelevante kontrollantigener (GST og BSA).
Screening for MUC4-positive Hybridomer
Immulon-plater ble belagt med 50 ul av det antigene preparat (MUC4 rekombinante proteiner eller GST eller proteinlysatene fra MUC4 positive cellelinjer) ved en konsentrasjon på 2,5 ug /brønn i bikarbonat-buffer (pH 9,6 ). Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C. Platene ble vasket i PBST og de frie bindingsseter i brønnene ble mettet, for å eliminere ikke-spesifikk binding av immunoglobulinene ved inkubering med 200 ul /brønn av 2% ikke-fettholdig skummetmelk i PBS i 2 timer ved 37 ° C og platene ble vasket i PBST. Ett hundre ul av kultursupernatanten ble overført fra brønner i kulturplater inn i tilsvarende brønner i ELISA-plater. Mus pre-immunserum ble anvendt som en negativ kontroll i hver analyse ble inkubert i 1 time ved 37 ° C, og deretter platene igjen vasket i PBST. Ett hundre ul /brønn av peroksydase-konjugert antistoff (anti-muse-HRP, Amersham Biosciences, 1:2000 fortynning i PBS) ble tilsatt og inkubert i 1 time ved 37 ° C. Platene ble vasket i PBST og 100 pl av TMB substrat (Dako substrat) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C. Reaksjonen ble avbrutt ved tilsetning av 100 ul 2 M svovelsyre og platene ble skannet ved 450 nm i en ELISA-plateleser Biotech.
Immunoutfelling
Protein lysater fra den MUC4-uttrykk HPAF /CD18-celler ble immunopresipitert ved anvendelse av 5 pg /ml 2382, 2214, 2175, 8G7 (anti-TR-antistoff), og K2G6 (isotype matchet kontroll MAb som reagerer med KLH). Antigen-antistoffkomplekser dannet ble trukket ned ved hjelp av protein A /G-perler (Calbiochem) og kompleksene ble solublized ved hjelp av SDS-prøvebuffer inneholdende 2-merkaptoetanol. Prøvene ble løst på 2% SDS-agarosegel og ble immunblottet hjelp 8G7.
Immunoblotting
En serie av bukspyttkjertelen cellelinjer ble behandlet for protein utvinning og Western blotting ved hjelp av standard prosedyrer [17] . I korthet ble cellene vasket to ganger i PBS og skrapet i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer [50 mM Tris, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,25% natrium-deoksycholat; 1% NP40 (pH 7,5)], som inneholder proteasehemmer blanding (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og fosfatase-hemmere (5 mM NaF og 5 mm Na3VO4, Sigma Chemicals, St. Louis, MO), og holdt ved 4 ° C i i minst 30 min.
