Abstract
Laver er symbiotiske organismer som produserer forskjellige sekundære stoffskifteprodukter. I den foreliggende undersøkelse, testet vi den cytotoksiske aktivitet av 17 lavarter mot flere humane kreftceller og videre undersøkt de molekylære mekanismer som ligger til grunn for deres anti-kreft-aktivitet. Vi fant at blant 17 lavarter arter,
F. cucullata
utviste den mest potente cytotoksisitet i flere humane kreftceller. Høytrykks væskekromatografi analyse viste at den acetonekstrakt av
F. cucullata
inneholder usnic syre, salazinic syre, Squamatic syre, Baeomycesic syre, d-protolichesterinic syre, og lichesterinic syre som delkomponenter. MTT-analysen viste at kreftcellelinjer var mer utsatt for de cytotoksiske effekter av ekstraktet enn ikke-cancercellelinjer. Videre blant de identifiserte underkomponentene, usnic syrebehandling hadde en lignende cytotoksisk effekt på kreftcellelinjer, men i mindre grad enn avtrekks. Ved en dødelig dose, behandling med ekstraktet eller med usnic syre betydelig økt apoptotisk cellepopulasjon og spesielt aktivert apoptotiske signalveien; men ved hjelp av sub-dødelige doser ekstrakt og usnic syrebehandling redusert kreftcelle motilitet og hemmet
i
vitro Hotell og
i
vivo
tumorigene potensialer . I disse cellene, observerte vi signifikant reduserte nivåer av epitel-mesenchymale overgang (EMT) markører og fosfor-Akt, mens fosfor-c-Jun og fosfor-ERK1 /2 nivåer ble bare marginalt berørt. Totalt sett er anti-kreft-aktivitet av ekstrakten er mer potent enn for usnic syre alene. Til sammen
F. cucullata Hotell og dens underkomponent, usnic syre sammen med ekstra komponent, utøve anti-kreft effekter på humane kreftceller gjennom induksjon av apoptose og hemming av EMT
Citation. Nguyen TT, Yoon S, Yang Y, Lee HB, Oh S, Jeong MH, et al. (2014) Lichen sekundære metabolitter i
Flavocetraria cucullata
viser anti-kreft effekt på humane kreftceller gjennom induksjon av apoptose og Suppression på karsinogent Potentials. PLoS ONE 9 (10): e111575. doi: 10,1371 /journal.pone.0111575
Redaktør: Chengfeng Yang, Michigan State University, USA
mottatt: 13 juli 2014; Godkjent: 26 september 2014; Publisert: 31 oktober 2014
Copyright: © 2014 Nguyen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609) på og av Korea National Research Resource Center Program (NRF-2012M3A9B8021726). Denne studien har også fått støtte fra et forskningsstipend finansiert av Sunchon Research Center for Naturmedisin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en viktig dødsårsak i verden. Som gruppe kreftformer utgjør ca 13% av alle dødsfall hvert år med de vanligste er lungekreft (1.37 millioner dødsfall), magekreft (736,000 dødsfall), leverkreft (695.000 dødsfall), tykktarmskreft (608,000 dødsfall), og brystkreft (458,000 dødsfall) [1]. Invasiv kreft er den ledende dødsårsaken i den industrialiserte verden, og den andre ledende dødsårsaken i den tredje verden [2], så for disse grunner, ulike kreftbehandlinger har blitt utviklet, inkludert et bredt spekter av kreftlegemidler med kjent cytotoksiske effekter på kreftceller.
laver er symbiotiske organismer, vanligvis sammensatt av en fungal partner (mycobiont) og en eller flere fotosyntetiske partnere (photobiont), som er mest ofte enten en grønn alge eller en cyanobacterium [3] . Selv om den doble natur fleste lavarter er nå allment anerkjent, er det mindre kjent at noen lavarter er symbioses involverer tre (tredelt lav) eller flere partnere. Generelt laver eksistere som diskret thalli og implisitt behandlet som enkeltpersoner i mange studier, selv om de kan være et symbiotisk enhet som involverer arter fra tre riker. Fra et genetisk og evolusjonært perspektiv, kan laver ikke betraktes som individer, men heller som kompositter, og dette har store konsekvenser for mange områder av etterforskningen som utvikling og reproduksjon.
Mange lichen sekundære produkter er usmakelig, og kan tjene som defensive forbindelsene mot planteeter, så vel som nedbrytere. Av denne grunn er disse sekundære produkter hyppig brukt av den farmasøytiske industri som antibakterielle og antivirale forbindelser [4], [5]. I tillegg er lav og deres sekundære metabolitter lenge blitt undersøkt for anti-cancerterapi [6] – [15]. I denne studien har vi testet den cytotoksiske aktiviteten av 17 lavarter samlet inn fra de rumenske Karpatene mot flere menneskelige kreftceller og videre undersøkt de molekylære mekanismene bak deres anti-kreft aktivitet for å identifisere mulige forbindelser for nye kreftlegemidler.
Materialer og Metoder
Utarbeidelse av lichen ekstrakter
thalli av
F. cucullata
ble samlet inn fra Romania i 2011 under ekskursjon i nasjonalparken Calimani og naturparken Bucegi organisert av Dr. Crişan på Babes-Bolyai Universitet, Cluj-Napoca, Romania. Tillatelsen til å samle lichen prøver fra disse stedene ble utstedt av administrasjonen av nasjonalparken Calimani og administrasjonen av naturparken Bucegi, med godkjenning av Kommisjonen for beskyttelse av naturlige monumenter (rumenske Academy). Feltstudiene ikke innebærer noen truede eller vernede arter. Duplikatene ble avsatt i den koreanske Lichen Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea. Fint tørket bakken thalli av lichen (150 g) ble hentet ved hjelp av aceton i et Soxhlet extractor. Ekstraktene ble filtrert og deretter konsentrert under redusert trykk i en rotasjonsfordamper. De tørre ekstrakter ble lagret ved -25 ° C inntil videre anvendelse. Ekstraktene ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) for alle forsøkene.
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) analyse av lichen materialer
Tørre lichen ekstraktene ble oppløst på nytt i 2 ml aceton, og deretter underkastes HPLC (Shimadzu, LC-20A). HPLC-analyser ble utført på YMC-Pack ODS-A (150 x 3,9 mm I.D.) reversert-fase-kolonne fullt endeavsluttet C18 materiale (partikkelstørrelse 5 um, porestørrelse 12 nm). Eluering ble utført ved en strømningshastighet på 1 ml /minutt under de følgende betingelser: kolonne temp, 40 ° C; løsningsmiddelsystem, metanol: vann: fosforsyre (80:20:1, v /v /v) før påfølgende injeksjon. Analysen ble overvåket ved en fotodiode array detektor (SPD-M20A) med en rekkevidde på 190-800 nm under hele HPLC utført. Observerte toppene ble skannet mellom 190 og 400 nm. Prøven injeksjonsvolumet var 10 mL. Standardene som ble brukt var hentet fra følgende kilder: salazinic syre (t
R = 2,27 ± 0,2 min) isolert fra lav
Lobaria Pulmonaria, etter usnic syre (t
R = 11,3 ± 0,3 min) fra
Usnea longissima Hotell og protolichesterinic syre (t
R = 22,3 ± 0,2 min) og lichesterinic syre (t
R = 26,5 ± 0,2 min) fra lav
kruslav islandica
.
Cell kultur
Den menneskelige kreftcellelinjer HT29 (tykktarmskreft), AGS (magekreft), A549 (lungekreft), og CWR22Rv-en (prostatakreft) ble opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Gen Depot, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gen Depot, USA) og 1% penicillin og streptomycin (RPMI komplett medium) (Gen Depot, USA). HaCaT (human keratinocytt), NIH 3T3 (mus embryonale fibroblastceller), HEK293T (human embryonisk nyre-celler), RIE (rotte intestinal epithelial) celler, og Madin-Darby kaninnyre (MDCK) celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM ) (Gen Depot, USA) supplert med 10% FBS og 1% penicillin og streptomycin. Celler ble dyrket i 5% CO
2 i en fuktig atmosfære ved 37 ° C. Cellelinjer ble kjøpt fra den koreanske cellelinje Bank (https://cellbank.snu.ac.kr), Korea.
MTT analyse
Lichen ekstrakter ble oppløst i DMSO (Sigma-Aldrich , St. Louis, USA) og seriefortynnet med DMEM eller RPMI 1640 for å oppnå konsentrasjoner på 6,125, 12,5, 25, 50, 100 ug /ml. Celler (2 x 10
4 celler /brønn) ble sådd ut på en 96-brønns plate, dyrket over natten, og deretter behandlet med aceton ekstrakt eller hoved forbindelser med
F. cucullata
ved konsentrasjoner på 100 ug /mL eller uM til 10 mikrogram /ml eller uM i 48 timer. Når behandlingen var ferdig, ble kulturene supplert med MTT. Etter inkubasjon med MTT ved 37 ° C, ble celler lysert med lyseringsbuffer inneholdende 50% DMSO og 20% SDS, og absorbansen ble målt ved 570 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (VERSAmax, Molecular Devices, Minnesota, USA). Prosenten av levedyktige celler ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: Prosent cellelevedyktighet = (optisk tetthet (OD) av de eksperiment prøver /OD av kontroll) x 100. IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp av Statistisk Package for Social Science (SPSS) programvare.
fluorescens mikroskopi av apoptotisk morfologi
Cellene ble dyrket på kammer lysbilder med en tetthet på 4 × 10
5 celler /brønn og lov til å feste natten, etterfulgt av behandling med
F. cucullata
aceton ekstrakt eller usnic syre i 24 timer eller 48 timer. Cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og inkubert med Annexin V-FITC merking av oppløsningen i 15 min. Deretter ble cellene vasket to ganger i PBS og analysert ved bruk av et Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Japan) fluorescerende mikroskop.
Cellene ble dyrket som beskrevet ovenfor. Etter 24 timer eller 48 timer behandling med
F. cucullata
aceton ekstrakt eller usnic syre, ble cellene vasket med PBS tre ganger og fiksert i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur og deretter inkubert i 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) i 30 min . Deretter ble prøvene farget med Hoechst 33257 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ved romtemperatur etter vasking tre ganger i fiksativ oppløsning i PBS. Cellene ble vasket to ganger i PBS og montert på et objektglass. Platene ble analysert ved bruk av et Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Japan) fluorescerende mikroskop og evaluert som prosentandelen av celler med kondensert eller oppdelte kjerner fra et totalt antall av 300 celler.
flowcytometri analyse for cellesyklus
etter 24 timers inkubasjon, ubehandlet og aceton utvinnes eller usnic syrebehandlet MDCK, HEK293T, HT29, AGS, A549, og CWR22Rv-1 celler ble trypsinert. Deretter ble en RNase-inhibitor tilsatt og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Til slutt ble prøvene sentrifugert for å fjerne supernatanten, og pellet-celler ble fortynnet i 100 ul av propidiumjodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) og inkubert i ytterligere 30 minutter ved 4 ° C. Flowcytometri ble utført med en FACS Caliber (BD Biosciences, San Diego, USA).
sårhelende analysen
AGS og A549 celler ble sådd ut i en tetthet på 2,5 × 10
5 celler /brønn på 6-brønners vevskulturplater (Corning, New York, USA) og dyrket over natten til samløpet. Monolags celler ble skrapet med en pipettespiss for å skape et sår. Cellene ble deretter vasket to ganger med serumfritt RPMI 1640 for å fjerne flytende celler og inkubert i medium med 5 ug /ml av
F. cucullata
trekke eller 10 mm usnic syre. Fotografier av celler ble tatt ved 0, 24, 48 og 72 timer etter at såret for å måle bredden av såret. Avstanden migrerte av cellene ble beregnet som differansen mellom kantene av såret ved punkt 1 og ved tidspunkt 2. For hver cellelinje, ble et gjennomsnitt av åtte sår analyser tatt for å bestemme den gjennomsnittlige hastighet av migrasjon ved en gitt konsentrasjonen av aceton ekstrakt eller usnic syre. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Invasion assay
tumorcelle-invasjon ble analysert ved hjelp av en transwell kammer (Corning Coster, Corning, NY, USA) assay med en topchamber av 8 um pore- størrelse polykarbonat membran belagt med 1% gelatin. AGS og A549-celler ble sådd ut på 2,5 x 10
5-celler /brønn i dyrkningsmedium inneholdende 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i det øvre rom av kammeret. Det nedre kammer er fylt med dyrkningsmedium inneholdende 0,2% BSA og 1 mg /ml fibronektin som en chemo-lokkemiddel. Celler ble dyrket i fravær eller nærvær av 5 pg /mL aceton ekstrakt eller 10 pM usnic syre i 24 timer. Forkamrene ble fiksert og farget med Diff Hurtig kit (Sysmex, Kobe, Japan). Den invaderte celler ble analysert under et lysmikroskop i fem tilfeldig valgte felt. Hvert forsøk ble utført in triplo. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig antall celler som migrerer per høyeffekts felt.
klonogene assay
A549 og AGS-celler ble vasket, trypsinert, og resuspendert i RPMI 1640. Cellene (500 celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater i 2,5 ml RPMI 1640 medium per brønn og ble inkubert i vedlegg. I etterfølgende 48 timers behandling, medier som inneholder aceton ekstrakt eller usnic syre ble erstattet med friskt medium i 12 dager. Koloniene ble fiksert i 4% paraformaldehyde, farget med 0,5% krystallfiolett, og telles under et stereomikroskop. Pletterings effektivitet (PE) av ubehandlede celler og overlevelsesfraksjon (SF) av behandlede celler ble deretter bestemt (n = 3) [16].
soft agar-kolonidannelsesbestemmelsen
AGS (1 x 10
4) og A549 (1 x 10
4) cellene ble suspendert i 1,5 ml av bløt agar (0,35% agarose i RPMI komplett medium), sådd ut på 1,5 ml av størknet agar (0,6% agarose i RPMI komplett medium) i 6-brønners plater og dyrket i 3 uker. Celler ble matet to ganger per uke med cellekulturmedium inneholdende aceton ekstrakt (1 pg /ml eller 5 ug /ml), usnic syre (5 uM eller 10 uM), lichesterinic syre (10 pM) eller DMSO (0,01%) . Pikselintensiteten av koloni-området ble målt ved hjelp av IMT iSolution programvare (IMT i-Solution Inc., Northampton, NJ, USA) i tilfeldig utvalgte mikroskopfelt i hver plate. For å måle prosent område av kolonien, pixel mengde koloni området ble normalisert til piksel × piksler torget. Data representerer gjennomsnittet av tre forsøk.
Påvisning av proteiner i cellelysatene
celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av aceton ekstrakt eller underkomponenter i 48 timer ble høstet og analysert ved western blot som beskrevet tidligere [17]. Antistoffene brukte ble kjøpt fra Cellesignalering Technology (PARP, caspase-3, Bax, Bcl_xL, α-tubulin), og BD Biosciences (E-cadherin). Alle resultater er representative fra minst tre uavhengige forsøk. For å analysere nivået av fosfoproteiner, ble kule-baserte multipleks-analyse (Bio-Plex fosfoprotein assay, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) utført i henhold til produsentens instruksjoner [18], [19]. I korthet, dette forsøket målte flere fosfoprotein signaler fra en enkelt lysat [20].
QRT-PCR-analyse
Totalt RNA (1 pg) fra hver gruppe av behandlede celler ble omdannet til cDNA ved anvendelse av en M-MLV revers transkriptase kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og SYBR grønt (Enzynomics, Seoul, Korea). Primere som brukes for real-time PCR var E-cadherin (fremover) 5′-cagaaagttttccaccaaag-3 «og (revers) 5′-aaatgtgagcaattctgctt-3′; N-cadherin (fremover) 5»-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 «og (revers) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; Snail (fremover) 5»-gaggcggtggcagactag-3 «og (revers) 5′-gacacatcggtcagaccag-3′; Twist (fremover) 5»-cgggagtccgcagtctta-3 «og (revers) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; GAPDH (fremover) 5»-atcaccatcttccaggagcga-3 «og (revers) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3». QRT-PCR reaksjon og analyse ble utført ved hjelp av CFX (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
In vivo tumorigenicity assay
Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Chonnam National University Medical School forskning Institutional Animal Care Bruk Committee. Vedlikehold av dyr og alle in vivo eksperimenter ble utført i henhold til de veiledende prinsippene i omsorg og bruk av dyr (DHEW publikasjon, NIH 80-23). A549-celler ble fremstilt i RPMI 1640 medium (1 x 10
6 celler /mus) og suspenderte celler ble forbehandlet med en tiendedel av dødelig konsentrasjon på
F. cucullata
aceton ekstrakt, usnic syre, lichesterinic syre, eller DMSO (Vehicle) like før injeksjon. Cellene ble injisert subkutant i flanken region av Balb /c naken mus og tumor ble målt etter to uker.
Statistisk analyse
Alle forsøk ble analysert i tre paralleller (n = 3). Data ble uttrykt som middelverdier ± standardavvik. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 17. behandlingseffekter ble bestemt med enveis ANOVA post-hoc analyse. En p-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant mindre annet er angitt
Resultater
Flavocetraria cucullata
aceton ekstrakt har potente cytotoksiske effekter på kreftceller
Å. identifisere den cytotoksiske substans fra rumenske lav, målte vi IC
50 verdier av aceton utdrag fra 17 lavarter på HT29 (kolorektal kreftceller) og AGS (mage kreftceller) celler. Blant de lavarter,
F. cucullata
som utøves de mest potente cytotoksiske virkninger på HT29 både (IC
50 = 10,9 ug /ml) og AGS (IC
50 = 11,6 ug /ml) sammenlignet med andre lavarter (IC
50 verdiene varierte rundt 25-100 mg /ml, Tabell S1 i File S1). For å kontrollere om cytotoksisitet av
F. cucullata
ekstrakt var spesifikk for kreftceller, gjennomførte vi ytterligere tester på ytterligere kreftceller inkludert A549 (lungecancerceller) og CWR22Rv-1 (prostatakreftceller) celler, og på ikke-cancerceller inkludert MDCK (Madin-Darby kaninnyre ) og RIE (rat intestinal epitelceller), NIH 3T3 (mus embryonale fibroblast), HaCaT (human keratinocytt) celler. Resultatene viste at
F. cucullata
acetonekstrakt spesifikt påvirket levedyktigheten av kreftceller, mens ikke-cancerceller ikke ble alvorlig skadet (Fig. 1A).
(A) Prosent levedyktigheten for celler behandlet med acetonekstrakt av
F. cucullata
. Cellene ble behandlet med
F. cucullata
ekstrakt i en konsentrasjon i området 10-50 ug /ml i 48 timer, og cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av et MTT-assay. (B) høytrykks-væskekromatografi kromatogrammene av
F. cucullata
ekstrakt. Identiteten av hver delkomponent er notert på den tilsvarende topp. (C-D) prosent levedyktigheten for celler behandlet med enten usnic syre (C) eller lichesterinic syre (D). Cellene ble behandlet med den angitte delkomponent av
F. cucullata
i en konsentrasjon i området 12,5 til 50 uM i 48 timer, og cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av et MTT-assay. Data representerer middel ± SEM (Standard feil av gjennomsnittet), n = 3.
For å identifisere de underkomponentene av
F. cucullata
, HPLC ble utført på aceton ekstrakt av
F. cucullata
; de resulterende kromatogrammene og massespektrometrisk analyser av hver topp er vist i figur 1B og tabell S2 i File S1. Som vist i figur 1B, salazinic syre (Tr = 2,268 min), squamatic syre (Tr = 2,855), baeomycesic syre (Tr = 4,646), usnic syre (Tr = 11,327), d-protolichesterinic syre (Tr = 22,315), og lichesterinic syre (Tr = 26,595) ble påvist i aceton ekstrakt av
F. cucullata
. Blant de underkomponentene, usnic syre hadde den høyeste toppen (% intensitet = 91,49 ± 0,0025), mens d-protolichesterinic syre og lichesterinic syre viste lavere topper (% intensitet = 2,27 ± 0,1, 2,22 ± 0,1, henholdsvis) (tabell S2 i File S1 ). Etter å ha identifisert lichen underkomponentene, to metabolitter, usnic syre (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) og lichesterinic syre (isolert fra
F. Cucullata
ekstrakt som deler av deres kjemiske struktur med d-protolichesterinic syre bortsett en umettet karbon-binding) ble brukt for videre eksperimenter. For å finne ut hvilke delkomponent var ansvarlig for cytotoksisitet av lichen, målte vi cytotoksisitet av usnic syre og lichesterinic syre og funnet ut at usnic syre viste lignende cytotoksiske effekter i ikke-kreft og kreftceller, mens lichesterinic syre utstilt ingen åpenbar cytotoksisk effekt på noen av de testede celler (fig. 1C og 1D). I tabell S3 i File S1, blir IC
50 verdier av aceton ekstrakt, usnic syre, og lichesterinic syre i forskjellige celler presentert. Interessant, gitt molekylvekt (molekylvekt = 344) og intensitet% av usnic syre i aceton ekstrakt av
F. cucullata
, IC
50 verdier av usnic syre i HEK293T, HT29, og A549-celler ble sannsynligvis høyere enn de beregnede usnic syrekonsentrasjon i ekstraktet. Disse resultatene tyder på at uidentifiserte delkomponenter av
F. cucullata
trekke trolig forsterke cytotoksisiteten til usnic syre. Det er imidlertid verdt å merke seg at IC
50 verdier av usnic syre, spesielt i ikke-kreftceller som MDCK, RIE, NIH 3T3, og HaCaT celler, var mye lavere enn de av usnic syrekonsentrasjonen i
F. cucullata
ekstrakt, noe som tyder på at det kan være en motstandsdyktig mekanisme som ligger til grunn cytotoksisiteten av usnic syre i cellene eller den annen delkomponent (e) kan minske cytotoksisiteten til usnic syre til cellene. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at aceton ekstrakt av
F. cucullata
har selektiv cytotoksisitet til kreftceller og at usnic syre kan fungere som en stor effektor av disse effektene.
dødelige konsentrasjoner
av Flavocetraria cucullata Hotell og usnic syre indusere apoptose av kreftceller
for å avgjøre om cytotoksisitet av
F. cucullata
og usnic syre var på grunn av induksjon av apoptose, celler behandlet med en dødelig konsentrasjon på
F. cucullata plakater (50 ug /ml) eller usnic syre (100 uM) ble farget med Hoechst 33258 og deres atom morfologi ble observert. Som vist i figur 2A, ble kondensert kjernemorfologi sett i AGS celler behandlet med enten
F. cucullata
trekke ut eller usnic syre. I figur 2B, er kvantifisering av celletall i forskjellige cellelinjer er vist. Interessant, induksjon av atom kondensasjon var signifikant økt i behandlede kreftcellene, men ble ikke sett i den ikke-kreftcellelinje MDCK, noe som tyder på at
F. cucullata Hotell og usnic syre er selektivt cytotoksisk til kreftceller gjennom induksjon av apoptose.
(A) Hoechst 33258 farging av AGS (human magekreft cellelinje) celler behandlet med
F. cucullata
trekke ut eller underkomponentene, usnic syre og lichesterinic syre. Pilene viser celler som viser kondensert eller fragmentert kjernemorfologi. Representative bilder vises fra tre uavhengige forsøk. (B) Quantificational analyse av kondensert eller fragmentert kjernemorfologi i forskjellige celler behandlet med
F. cucullata
trekke ut eller underkomponentene. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien), n = 3 ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med dimetylsulfoksyd-behandlede gruppen.
For å bekrefte dette, farget vi cellene med FITC-Annexin V for å detektere eksponering av fosfatidylserin på den ytre plasmamembran, som er en karakteristisk finne i cellene gjennomgår apoptose. Som vist i Figur 3A, har kreftceller ble behandlet med enten
F. cucullata
trekke ut eller usnic syre viste FITC positivitet. For å bestemme andelen av apoptotiske celler, flowcytometrisk analyse av celler farget med propidiumjodid ble utført. Som vist i figurene 3B og 3C, økte den populasjon av celler i sub G1 fasen etter 24 timers behandling i kreftceller. Dette kvantifisering analyse viste at induksjon av apoptose av
F. cucullata
ekstrakt var doseavhengig unntatt i MDCK-celler, med en signifikant økning sett i AGS, HT29, og A549-celler (fig. 3B). Imidlertid, som vist i figur 3C, effektiviteten av usnic syre i å øke antallet av apoptotiske celler var signifikant lavere enn den til den
F. cucullata
ekstrakt. Disse funnene antyder igjen at uidentifisert underkomponent (er) på
F. cucullata
kan potensere effekten av usnic syre selv om usnic syre spiller en stor rolle i å indusere apoptose i ulike kreftceller.
(A) FITC-Annexin V farging av celler behandlet med
F. cucullata
trekke ut eller usnic syre. Pilene viser celler som viser FITC positivitet. (B-C) Flowcytometrisk analyse av celle-syklus fordelinger etter
F. cucullata
ekstrakt (B) eller usnic syre (C) behandling og grafisk fremstilling av resultatene. Representative bilder eller Resultatene er vist fra tre uavhengige eksperimenter.
For ytterligere å bekrefte endringer i nivået av apoptotiske proteiner, vi utførte western blot analyse for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), caspase- 3, Bax, og BCL-xL. Som vist i figurene 4A og 4D, ekstrakt og usnic syrebehandlingen økte nivåer av spaltede PARP og spaltet caspase-3 i CWR22Rv-1, AGS, HT29, og A549-celler. I tillegg var nivået av de pro-apoptotiske protein, Bax, var signifikant økt i disse behandlede celler, men ikke i MDCK og HEK293T-celler (fig. 4B og 4E). I motsetning til dette nivået av anti-apoptotiske protein, Bcl-xL, var betydelig redusert bare i behandlede kreftceller (fig. 4C og 4F). Konsekvent,
F. cucullata
var mer effektive i indusering av apoptose enn usnic syre og var mer effektiv i kreftceller enn ikke-kreftcelle. Tatt sammen, viser resultatene at dødelige konsentrasjoner av aceton ekstrakt av
F. cucullata
og den underkomponent av usnic syre indusere apoptose av kreftceller.
(A og D) Western blot-analyse av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og caspase-3 i celler behandlet med den
F. cucullata product: (A) eller usnic syre (D). Pilspisser indikerer spaltede fragmenter av hvert protein. (B-C og E-F) Quantificational analyse av Bax (B og E) og Bcl-xL (C og F) protein uttrykk nivåer i celler behandlet med F. cucullata eller usnic syre, henholdsvis. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell i forhold til dimetylsulfoksyd-behandlede gruppen.
Sub-dødelige konsentrasjoner av
Flavocetraria cucullata Hotell og usnic syre hemme tumordannelse og bevegelighet av kreftceller
for ytterligere å undersøke anti-kreft aktivitet av
F. cucullata
trekke ut og usnic syre, vi brukte en tiendedel av de dødelige konsentrasjoner av disse stoffene som ikke viser cytotoksisitet (sub-dødelig konsentrasjon) og testet
i
vitro
tumorigenicity og motilitet av A549 og AGS celler. En klonogene analyse av disse cellene ved subletale konsentrasjoner av ekstraktet (5 ug /ml) eller usnic syre (10 pM) viste en signifikant reduksjon i antall kolonier, noe som indikerer at cellevekst ble inhibert ved disse konsentrasjonene (fig. 5A og 5B). Interessant, behandling med 10 ug /ml ekstrakt eller 15 uM usnic syre fullstendig hemmet dannelsen av kolonier i begge celletyper (data ikke vist). I motsetning til dette viste lichesterinic syre ingen hemmende virkning på celleformering. En myk agar koloni-formasjon analysen ble utført for å teste om subletale konsentrasjoner av
F. cucullata Hotell og usnic syre hemmet forankringsuavhengig vekst av A549 og AGS celler. Som vist i figurene 5C og 5D, kolonidannelse av A549 og AGS cellene på mykagar ble signifikant redusert ved behandling med
F. cucullata
trekke ut eller usnic syre i en doseavhengig måte, mens lichesterinic syre ikke påvirker forankrings-uavhengig vekst. Disse resultatene viser at både
F. cucullata
trekke ut og usnic syre har anti-tumorigen aktivitet ved subletale konsentrasjoner. En sårhelende analyse og invasjon analysen ble videre utført for å teste om
F. cucullata Hotell og usnic syre påvirke migrasjon og invasjon, henholdsvis av kreftceller ved subletale konsentrasjoner. I 6A-C,
F
.
cucullata
ekstrakt og usnic syrebehandling vesentlig hemmet migrasjon av A549 og AGS celler. Som vist i figur 6D-E,
F. cucullata
trekke ut og usnic syre også hemmet invasjon av A549 og AGS celler, mens ingen slik hemming av invasjonen ble påvist i lichesterinic syrebehandlede kreftceller. Resultatene viser klart at
F. cucullata Hotell og usnic syre hemmer kreft celle motilitet og redusere tumorigenicity av kreftceller ved subletale konsentrasjoner.
(A-B) klonogene analyse av A549 og AGS celler behandlet med
F. cucullata
ekstrakt, usnic syre, eller lichesterinic syre (A) og quantificational analyse av kolonien antall i hver gruppe (B). (C-D) Myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen av A549 og AGS celler behandlet med
F. cucullata
ekstrakt, usnic syre, eller lichesterinic syre (C) og quantificational analyse av prosent koloni område i hver gruppe (D). Representative bilder vises fra tre uavhengige forsøk. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien), n = 3 * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell i forhold til dimetylsulfoksyd-behandlede gruppen.
(A-C) Migrasjon analyse av A549 (A) og AGS (B) celler behandlet med
F. cucullata
ekstrakt eller usnic syre, og quantificational analyse av sår lengde i hver gruppe (C). (D-E) Invasion analyse av A549 og AGS celler behandlet med
F. cucullata
ekstrakt, usnic syre, eller lichesterinic syre (D), og quantificational analyse av invaderte celletall i hver gruppe (E). Representative bilder vises fra tre uavhengige forsøk. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (Standardfeil av middelverdien), n = 3 ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskjell sammenlignet med dimetylsulfoksyd-behandlede gruppe i hver cellelinjer. @@ P 0,01; @@@ P 0,001 sammenlignet med den angitte gruppen
Som
F.. cucullata
og usnic syre ble funnet å betydelig redusere kreftcelle motilitet og tumorigenisitet, så undersøkte vi hvorvidt epitelial-mesenkymale overgang (EMT) spiller en rolle i å mediere slike effekter. Ekspresjonsnivået av E-cadherin ble analysert i A549-celler behandlet med en sub-letal konsentrasjon på
F. cucullata
, usnic syre, eller lichesterinic syre. Dataene viste at acetonekstrakt av
F. cucullata Hotell og usnic syre betydelig økt proteinnivå E-cadherin (Fig. 7A). Konsekvent, uttrykket nivået av E-cadherin mRNA ble også økt i disse cellene, mens mRNA nivåer av N-cadherin, Twist, og sneglen ble redusert i disse cellene. Tabell S1. Tabell S2. Tabell S3.
