Abstract
p53-genet er mutert i mer enn 50% av humane tumorer. Mutant p53 utøver en onkogen funksjon og er ofte høyt uttrykt i kreftceller på grunn av unndragelse av proteasome avhengig nedbrytning. Således reaktive proteasom-avhengig nedbrytning av mutert p53 protein er et attraktivt strategi for kreft administrasjon. Tidligere har vi funnet at Arsenikk (ATO), et stoff for akutt promyelocytic leukemi, forringer mutant p53 protein gjennom en proteasome sti. Imidlertid er det fortsatt uklart hva som er E3 ligase som er rettet mot mutant p53 for degradering. I studien, søkte vi å identifisere en E3 ligase nødvendig for ATO-mediert degradering av mutant p53. Vi fant at ATO induserer ekspresjon av Pirh2 E3 ligase på transkripsjonsnivået. Vi har også funnet ut at knockdown av Pirh2 hemmer, mens ektopisk uttrykk for Pirh2 forsterker, ATO-indusert nedbrytning av mutant p53 protein. Videre fant vi at Pirh2 E3 ligase fysisk kommuniserer med og mål mutant p53 for polyubiquitination og senere proteasomal degradering. Interessant, fant vi at ATO samarbeider med HSP90 eller HDAC hemmer å fremme mutant p53 fornedrelse og veksthemming i tumorceller. Sammen utgjør disse data tyder på at ATO fremmer mutant p53 degradering delvis via induksjon av Pirh2 avhengige proteasome veien
Citation. Yan W, Jung YS, Zhang Y, Chen X (2014) arsenikk reaktiverer Proteasome- avhengig Nedbrytning av Mutant p53 protein i kreftceller i del via Enhanced Expression of Pirh2 E3 ligase. PLoS ONE 9 (8): e103497. doi: 10,1371 /journal.pone.0103497
Redaktør: Yi Li, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 30 april 2014; Godkjent: 03.07.2014; Publisert: 12. august 2014
Copyright: © 2014 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grant CA 121 137 og CA 076069. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
missense mutasjoner i p53 gen, primært gruppert i kjernen DNA-bindende domene, forekommer i en stor fraksjon av humane tumorer [1]. Disse mutasjonene produserer p53-proteiner med en endret sekvens-spesifikk DNA-bindende aktivitet, noe som ikke kan indusere en oppstilling av målgener av villtype p53 i tumor suppresjon [2]. I tillegg er mutante p53-proteiner funnet å ha onkogene aktivitet, definert som forsterkning av funksjon (GOF) [3], [4].
Virkningene av mutant p53 på tumorutvikling og progresjon er vidtrekkende. Sammenlignet med p53-null-mus, mutant p53 knock-in mus oppviser signifikant forskjellig tumor-spektra og høy forekomst av tumormetastase [5] – [7]. Viktigst kliniske studier har vist at et høyt nivå av mutant p53 er korrelert med mer aggressive tumorer og dårligere resultater [8] – [10]. Videre er mutert p53 klinisk signifikant fordi dets ekspresjon gjør celler motstandsdyktige mot kjemoterapeutiske medikamenter [11], [12]. Tilsynelatende er vinning av funksjon av mutant p53 delvis avhengig av dens transkripsjonelle aktivitet [5], [13] – [18], og dens dominant-negativ aktivitet mot p53 familien [19] -. [23]
i motsetning til villtype p53, er mutert p53-protein funnet å unngå proteasom-avhengig nedbrytning [24] – [28], som fører til dens hyperstabilization i tumorer [29]. Flere mekanismer kan forårsake mutant p53 protein for å unngå proteasome avhengig nedbrytning. En mulighet er at tumor-assosiert stress kan utløse interaksjonen av mutant p53 med chaperonproteiner, slik som HSP70 og HSP90, som inaktiverer E3 ligaser MDM2 og CHIP og dermed stabiliserer mutant p53 [24] – [27]. Faktisk, hemming av HSP90 uttrykk eller aktivitet frigjør MDM2 og CHIP å degradere mutant p53 [26], [30]. En annen mulighet er at mutant p53 er istand til å danne amyloid-aggregater i tumorer som er resistente mot degradering proteasomal [27], [31]. Muligheten av mutant p53 stabilisering presenterer en fundamental conundrum i terapeutisk intervensjon for kreftpasienter med en mutant p53. Således har effektiv reaktivering av proteasom-avhengig nedbrytning av mutant p53 i kreftceller en terapeutisk betydning.
Nylig har vi funnet at arsen mål mutant p53 for degradering, som fører til veksthemming i solide tumorceller [32] . Arsen er et metalloid med en betydelig effekt og moderat uønskede bivirkninger i pasienter med akutt promyelocytisk leukemi, myelom, og myelodysplastiske syndromer [33]. Interessant nok har vi funnet at arsen induserer ekspresjon av villtype p53, TAp73, og TAp63 i tumorceller [32], [34]. Disse aktivitetene av arsen gi en strategi for å svekke mutant p53 dominant-negativ funksjon og andre GOF aktiviteter. Selv om arsen reduserer stabiliteten av mutant p53 protein gjennom en proteasom-reaksjonsveien [32], E3-ligase som er rettet mot mutant p53 for nedbrytning er fortsatt ukjent. I denne studien vil vi ta opp dette spørsmålet til rette for utvikling av arsenikk (ATO) som en potensiell kreft narkotika for å kontrollere svulster med mutant p53.
Materialer og metoder
Cell Culture
menneskelig bukspyttkjertelkreft cellelinje MIA Paca-2 (som inneholder mutant R248W) og human keratinocyte cellelinje HaCaT (som inneholder mutant H179Y /R282W) ble dyrket som beskrevet tidligere [35].
plasmider og siRNA
Menneske full lengde Pirh2, ble Pirh2-DN (en E3 ligase defekt mutant), og Pirh2-ΔRING (ringfingeren domene sletting mutant) brukes som tidligere beskrevet [36]. Alle Pirh2 proteiner ble FLAG-merket i N-terminalen. FLAG-merket ubikvitin ekspresjonsvektor i pcDNA3 ble anvendt som tidligere beskrevet [36].
To små interfererende RNA (sirnas) mot Pirh2, 5′-CAU GCC CAA CAG ACU Ugu G dTdT-3 «og 5»- -GGA AGU GCA GUG CAU AAA C dTdT-3 «, og to egge sirnas, 5′-GCA GUG UCU CCA CGU ACU A dTdT-3» og 5 «GGC CGA UUG UCA AAU AAU U dTdT-3», ble kjøpt fra Dharmacon RNAi Technologies. De sirnas ble transfektert inn i celler ved anvendelse SilentFect (Bio-Rad) ifølge produsentens protokoll. Celler ble høstet ved de angitte tidspunkter etter transfeksjon for videre forsøk.
Antistoffer
Kanin anti-p53 (FL-393) ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology Inc. Kanin polyklonalt anti-Pirh2 ble kjøpt fra Bethyl Laboratories Inc. Mouse monoklonale anti-FLAG M2 og kanin anti-aktin ble kjøpt fra Sigma.
Omvendt transkripsjon PCR assay
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen). cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en Iscript ™ cDNA syntese kit (Bio-Rad). For å måle Pirh2 mRNA, ble RT-PCR utført med forover primer 5′-CTGCGAGCACTATGACAGAG-3’and revers primer 5′-TTCATAGCTAGGCATAAGTTAC-3 «. Aktin ble amplifisert med forover primer 5»-TCCATCATGAAGTGTGACGT-3 «og revers primer 5′-TGATCCACATCTGCTGGAAG-3».
Proteosom-inhiberingsanalysen
Celler ble sådd i 24 timer, ubehandlet eller forbehandlet med proteasominhibitor MG132 (4 uM) i 2 timer, og deretter behandlet med ATO i 6 timer.
immunutfelling og Western blot-analyse
immunoutfelling forsøket ble utført som tidligere beskrevet [37]. Kort sagt ble HaCaT og MIA PACA-2-celler ble behandlet med 5 eller 7,5 uM ATO i 6 timer. Celler ble vasket med fosfat-bufret saltvann, lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, og 0,4 mM PMSF), ultralydbehandlet, og klaret ved sentrifugering . Cellelysater (500 ug av total protein) ble inkubert i 4 timer ved 4 ° C med de angitte antistoffer koblet til protein A-agarose-perler (Sigma), og deretter vasket med lyseringsbuffer. Immunoutfelt proteinkomplekser og hel-celle-lysater ble underkastet SDS-PAGE. For hvert sett, ble 5% av hel-celle-lysat anvendt som et inngangsstyre. IgG-antistoff ble anvendt som en negativ kontroll. Immunoblotter ble visualisert ved SuperSignal West Femto Chemiluminiscent gjenkjenning reagenser (Pierce).
GST fusjonsprotein forberedelse
glutation S-transferase (GST) -tagged Pirh2, Pirh2-ΔRING, eller Pirh2-DN var uttrykt av pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech). De rekombinante GST-merkede proteiner ble renset som tidligere beskrevet [37]. I korthet, ble GST-fusjoner av Pirh2, Pirh2-ΔRING, og Pirh2-DN uttrykt i E. coli BL21 (DE3) (Novagene) etter induksjon med 0,5 mM IPTG i 4 timer ved 37 ° C. Bakterielle celler ble høstet og deretter resuspendert i GST lyseringsbuffer (200 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, og 0,4 mM PMSF). Deretter ble cellelysater sonikert og klaret ved sentrifugering. GST fusjonsproteiner ble renset ved hjelp av glutation-Sepharose perler (Amersham Pharmacia Biotech) i henhold til produsentens protokoll.
p53 ubiquitinering analysen
35S-merket villtype p53 eller mutant p53 ( R175H og R273H) proteiner ble syntetisert ved in vitro transkripsjon og translasjon ved hjelp av TNT T7 koblet retikulocyttlysat system (Promega). 5 pl (~ 2 x 10
4 CPM) av in vitro translaterte p53 ble tilsatt til GST-Pirh2 (2 ug) og blandes på is i 1 time under dannelse av GST-Pirh2-p53-komplekser. Kompleksene ble tilsatt til ubiquitinering buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 5 mM MgCl
2, 2 mM DTT og 1 x regenerering av energi oppløsning (ERS)), inneholdende E1 (100 ng) , E2 (200 ng), og ubiquitin (2 ug), og inkubert ved 30 ° C i 2 timer. Til slutt ble reaksjonsblandingen separert på SDS-PAGE og analysert ved autoradiografi. E1, E2, ERS, og ubiquitin ble kjøpt fra Boston Biochem.
statistikker
To-gruppe sammenligninger ble analysert ved tosidig Student
t
test.
p
verdier ble beregnet, og
p
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Arsenikk forringer mutant p53 protein via proteasome avhengige pathway
Det er velkjent at det i tumorceller, er hyperstabilization av mutant p53-protein knyttet til omgåelse av proteasom-avhengig nedbrytning [24] – [27], [31], [38]. Således reaktivering av proteasom-avhengig nedbrytning av mutant p53 på tumorceller har en terapeutisk betydning. Tidligere har vi funnet at ATO reduserer stabiliteten av mutant p53 protein gjennom en proteasom-reaksjonsveien [32]. Viktigst, viste vi at knockdown av endogen mutant p53 sensitizes, mens ektopisk uttrykk for mutant p53 desensitizes, kreftceller for arsen behandling [32]. Konsekvent, en annen studie viste at arsen-indusert nedbrytning av mutant p53 inhiberer proliferasjon av p53R273H-uttrykkende celler på en doseavhengig måte [39]. Imidlertid er det fortsatt uklart hvilke E3 ligase er ansvarlig for arsen-indusert mutant p53 degradering. For å teste dette, fikk vi bekreftet at arsen-indusert nedbrytning av mutant p53 er via proteasome avhengige veien. For dette formål HaCaT-celler var ubehandlet eller behandlet med 4 uM MG132, en inhibitor av 26S-proteasomet, i fravær eller nærvær av ATO. Vi fant at arsen-indusert mutant p53 degradering ble fullstendig avskaffet ved MG132 (Fig. 1a). Tilsvarende fant vi at arsen-indusert nedbrytning av mutant p53 protein ble hemmet av MG132 i MIA PaCa2 celler (Fig. 1B). I tillegg har vi funnet at, i motsetning til effekten av proteasom-reaksjonsveien på villtype p53-protein [40], inhibering av proteasom-reaksjonsveien alene var ikke i stand til å øke nivået av mutant p53-protein (fig. 1A-B), i samsvar med en tidligere rapport [41]. Til sammen bekreftet disse resultatene at arsen reaktiverer proteasome avhengig nedbrytning av mutant p53 i tumorceller.
Western blot ble fremstilt med ekstrakter fra HaCaT (A) og MIA Paca-2 (B) celler, som var ubehandlet eller forbehandlet med 4 mikrometer MG132 i 2 timer, og deretter ubehandlet eller behandlet med ATO i 6 timer.
Arsenikk forringer mutant p53 protein via induksjon av Pirh2 E3 ligase
Tidligere har vi funnet at arsen induserer ekspresjon av Pirh2 E3 ligase for å degradere ΔNp63 onkogene protein, et medlem av p53-familien [34]. Pirh2 er kjent for å være en E3 ligase rettet mot villtype p53-protein for degradering [42], [43]. Dermed utforsket vi om ATO induserer uttrykk for Pirh2 i tumorceller som bærer en mutant p53. Vi har funnet at ved behandling med ATO, ble nivået av Pirh2 transkripter signifikant økt i MIA PACA-2 og HaCaT-celler (fig. 2A), samtidig med en økning av Pirh2 protein (Fig. 2B). Disse data antydet at ATO kan transkripsjonelt indusere ekspresjon av Pirh2 å degradere mutant p53 på tumorceller.
(A) Nivået av Pirh2 transkripsjon økes ved ATO. RT-PCR-analyse ble utført med total RNA isolert fra MIA PACA-2 og HaCaT celler ubehandlet eller behandlet med 7,5 mikrometer ATO for 2-6 timer. Aktin mRNA ble amplifisert som en lasting kontroll. (B) Western blot var forberedt med utdrag fra MIA PACA-2 og HaCaT celler ubehandlet eller behandlet som i (A), og deretter analysert med antistoffer mot Pirh2 og aktin, henholdsvis.
Neste, vi undersøkt om ektopisk uttrykk for Pirh2 forbedrer arsen-indusert nedbrytning av mutant p53 protein. Vi fant at ektopisk ekspresjon av Pirh2 eller ATO behandling alene betydelig redusert nivå av mutant p53 i HaCaT og MIA PACA-2-celler (Fig. 3A-B). Viktigst, har vi funnet at en kombinasjon av ektopisk ekspresjon av Pirh2 og ATO behandling ytterligere redusert nivået av mutant p53 (fig. 3A-B). Disse data antydet at mutant p53 kan brytes ned av Pirh2 E3 ligase, og aktiviteten Pirh2 kan bli styrket ved ATO behandling via ukjente mekanismer.
(A-B) Western blot var forberedt med utdrag fra HaCaT (A ) og MIA PACA-2 (B-celler), som ble transfektert med pcDNA3 eller pcDNA3-FLAG-Pirh2 i 24 timer, og deretter behandlet med 5 eller 7,5 uM ATO i 6 timer. Blottene ble deretter probet med antistoffer mot FLAG tag, p53, og aktin, respektivt. (C) Skjematisk fremstilling av Pirh2 protein sammen med plasseringene av Zn fingeren og ring domener, to substitusjons mutasjoner C145S og C148S i ringen domenet (Pirh2-DN), og sletting av RING domenet i Pirh2 (Pirh2-ΔRING). (D-E) ektopisk ekspresjon av Pirh2-DN eller Pirh2-ΔRING har liten eller ingen effekt på nivået av mutant p53. Western blot var forberedt med ekstrakter fra HaCaT (D) og MIA PACA-2 (E) celler, som ble transfektert med pcDNA3, pcDNA3-FLAG-Pirh2-DN, pcDNA3-FLAG-Pirh2-ΔRING, eller pcDNA3-FLAG-Pirh2 for 24 timer. Blottene ble deretter analysert med antistoffer mot FLAG tagget Pirh2, p53, og aktin, henholdsvis.
Det er kjent at Pirh2 krever sin RING domene til ubiquitinate villtype p53 for proteasomal degradering [44]. For å avgjøre om E3 ligase aktivitet Pirh2 er nødvendig for å regulere mutant p53 uttrykk, to FLAG-merket Pirh2 mutanter, Pirh2-ΔRING (mangler ringfingeren domene) og Pirh2-DN (som inneholder to substitusjons mutasjoner C145S og C148S i ringen domene), ble anvendt (fig. 3C). Vi viste at i motsetning til villtype Pirh2, ektopisk ekspresjon av Pirh2-ΔRING eller Pirh2-DN var ute av stand til å redusere nivået av mutant p53-protein i HaCaT og MIA PACA-2-celler (Fig. 3D-E).
for ytterligere å undersøke om endogen Pirh2 formidler arsen-indusert nedbrytning av mutant p53 protein, ble HaCaT og MIA PACA-2-celler transient transfektert med en egge siRNA (Scr-1 og -2) eller en siRNA mot Pirh2 (siPirh2-1 og -2) for 3 d, og deretter mock-behandlet eller behandlet med ATO. Vi viste at nivået av Pirh2 ble signifikant redusert ved Pirh2, men ikke kryptert, sirnas (Fig. 4A-B). Viktigere, fant vi at Pirh2 knockdown var i stand til å redde arsen-indusert nedbrytning av mutant p53 (fig. 4A-B). Vi har også bemerket at arsen behandlingen økte Pirh2 uttrykk, samtidig med en redusert ekspresjon av mutant p53 (Fig. 4A-B).
Western blot ble fremstilt med ekstrakter fra HaCaT (A) og MIA PACA-2 (B ) celler, som ble transfektert med egge siRNA # 1 (SCR-1) (baner 1-2), Scr-2 (baner 5-6), siRNA mot Pirh2-1 (siPirh2-1) (baner 3-4), eller siPirh2-2 (kolonnene 7-8), og deretter behandlet med ATO i 6 timer. Blottene ble deretter analysert med antistoffer mot Pirh2, p53, og aktin, henholdsvis.
Pirh2 fysisk kommuniserer med mutant p53 protein for polyubiquitination
Som E3 ligase ofte fysisk reagerer med sine underlag undersøkte vi om Pirh2 fysisk assosierer med mutant p53. For å teste dette, ble HaCaT og MIA PACA-2-celler behandlet med ATO i 6 timer, og deretter endogen mutant p53 og Pirh2 i celler ble immunoutfelt med antistoffer mot p53 og Pirh2 hhv. Vi viste at endogen Pirh2 ble påvist i muterte p53-immunokomplekser (Fig. 5A). I tillegg ble mutant p53 påvist i Pirh2 immunokomplekser (Fig. 5B). IgG ble anvendt som en negativ kontroll i løpet av immunopresipitering og i stand til immunoutfelling mutant p53 eller Pirh2 (Fig. 5A-B).
(A) HaCaT og MIA PACA-2-celler ble behandlet med 5 eller 7,5 uM for ATO 6 timer. Celleekstrakter fra HaCaT (til venstre) og MIA Paca-2 (høyre) celler ble immunoutfelt med anti-p53 eller kontrollere IgG. De immunkomplekser ble deretter anvendt for å detektere mutant p53 og Pirh2 sammen med hel-cellelysater som inngangskontroll. (B) Et eksperiment ble utført som beskrevet i (A), bortsett fra at anti-Pirh2-antistoff ble anvendt i immunutfelling. (C-E) In vitro syntetisert
35S-merket villtype p53 (C), R175H (D), og R273H (E) ble blandet med GST, GST-merket Pirh2, Pirh2-DN, eller Pirh2-ΔRING . Kompleksene ble deretter blandet med en buffer inneholdende E1, E2 (UbcH5b), og Ub og deretter inkubert ved 30 ° C i 2 timer. Ubiquitinmolekyler p53 ble analysert ved SDS-PAGE og detektert ved autoradiografi. (F) En modell av Pirh2-mediert degradering av mutant p53 indusert av ATO.
Deretter undersøkte vi om Pirh2 fungerer som en E3 ligase for ubiquitinering av mutant p53. For å teste dette, in vitro ubiquitinering Analysen ble utført med
35S-merket mutant p53R175H eller p53R273H sammen med rekombinant GST-Pirh2, GST-Pirh2-DN, eller Pirh2-ΔRING. Vi viste at mutante p53s ble polyubiquitinated av Pirh2 men ikke av Pirh2-DN og Pirh2-ΔRING (Fig. 5D-E, sammenlign spor 3 med baner 4 og 5). Siden villtype p53 er et kjent mål for Pirh2, ble villtype p53 anvendt som en positiv kontroll. På samme måte viste vi at villtype p53 ble polyubiquitinated ved Pirh2 men ikke ved Pirh2-DN og Pirh2-ΔRING (fig. 5C, sammenlign spor 3 med baner 4 og 5). Sammen utgjør disse data viser at Pirh2 er i stand til å polyubiquitinating mutant p53.
arsentrioksyd samvirker med HSP90 eller HDAC-inhibitor for å fremme mutant p53 nedbrytning og veksthemming i tumorceller
Tidligere studier viste at i tumorceller kommuniserer anstand protein HSP90 med mutant p53 under dannelse av MDM2-p53-HSP90-komplekset og dermed stabiliserer mutant p53 [24], [26], [45]. Følgelig HSP90-inhibitorer 17AAG og geldanamycin forstyrre MDM2-p53-HSP90-komplekset for å degradere mutant p53 [26], [30], [45]. I tillegg Saha, en inhibitor av HDACs, ble funnet å redusere ekspresjon av mutant p53 via inhibering HDAC8-mediert mutant p53 transkripsjon [46] og HDAC6-mediert mutert p53-protein stabilitet [30]. For ytterligere å undersøke om hemmere av HSP90 og HDACs er i stand til å indusere Pirh2 uttrykk for å degradere mutant p53, ble HaCaT og MIA PACA-2-celler behandlet med 17AAG eller Saha. Vi viste at 17AAG eller Saha behandlingen hadde liten eller ingen virkning på ekspresjon av Pirh2 protein i HaCaT (Fig. 6A) og MIA PACA-2-celler (Fig. 6B). Resultatet tyder på at ATO og hemmere av HSP90 og HDACs kan degradere mutant p53 protein via forskjellige veier. Således hypotese vi at ATO-systemet kan samvirke med HSP90 eller HDAC-inhibitor for å fremme mutant p53 nedbrytning og veksthemming i tumorceller. For å teste dette, ble HaCaT og MIA PACA-2-celler behandlet med ATO, 17AAG, eller Saha, alene eller i kombinasjon. Vi fant ut at mutant p53 protein ble markert redusert med ATO, 17AAG, eller Saha, og ytterligere redusert med kombinasjon av ATO med 17AAG eller Saha (Fig. 6C-D). Konsekvent, fant vi at spredning av HaCaT (Fig. 6E) og MIA PACA-2 celler (Fig. 6F) ble betydelig hemmet av ATO, 17AAG, eller Saha, og ytterligere hemmet av kombinasjon av ATO med 17AAG eller Saha. Disse data tyder på at kombinasjonen av ATO med andre anti-cancermidler, slik som inhibitorer av HSP90 og HDACs, kan oppnå synergistiske behandlinger for tumorer bærer et mutert p53.
(A-B) Western blot ble fremstilt med ekstrakter HaCaT fra (A) og MIA PACA-2 (B) celler, som var ubehandlet eller behandlet med 1 pM 17AAG eller 2 uM Saha i 12 timer. Blottene ble deretter analysert med antistoffer mot henholdsvis Pirh2 og aktin,. (C-D) Western blot ble fremstilt med ekstrakter fra HaCaT (C) og MIA PACA-2 (D) celler, som var ubehandlet eller behandlet med 7,5 uM ATO, 1 uM 17AAG eller 2 uM Saha, alene eller i kombinasjon for 12 h. Blottene ble deretter probet med antistoffer mot p53 og aktin, respektivt. (E-F) HaCaT (E) og MIA PACA-2 (F-celler) ble behandlet som i (C-D) i 24 timer. Overlevende celler fra både kontroll- og behandlede grupper ble tellet og presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre separate eksperimenter. *,
p
. 0,05
Diskusjoner
Under normale forhold, er villtype p53 uttrykt ved lave nivåer på grunn av nedbrytning mediert av flere E3 ligaser , inkludert MDM2, Pirh2, COP1, ARF-BP1 og WWP1 [43]. I motsetning til dette, mutant p53 akkumuleres ofte til høye nivåer i tumorceller, selv om dets ekspresjon i normale vev er også holdt på lave nivåer gjennom virkningen av MDM2 [28]. Den tumorspesifikt hyperstabilization av mutant p53 er en kritisk determinant av sin GOF. Faktisk stanse av mutant p53 ved siRNA hemmer proliferasjonen av humane tumorceller [16], [47]. Dermed rettet mot mutant p53 for nedbrytning gir en begrunnelse for attraktive kreft strategier for å dempe spredning av kreftceller. Nylig ble det foreslått at i nonproliferating tumorceller, undertrykker macroautophagy fremmer omsetningen av mutant p53 protein gjennom anstand-mediert autophagy i et lysosom-avhengig måte [29]. Dessverre, kravet om betinget-spredning av kreftceller begrenser potensialet i anstand-mediert autofagi for klinisk anvendelse. I tillegg har tiden tilgjengelige kjemoterapier er i stand til å tappe mutant p53. For eksempel, mange frontline anticancermidler øker både villtype p53 og mutant p53, og kan fremme tumordannelse og progresjon i tumorer med mutant p53 [28], [48]. Således stabilisering av mutant p53 av kjemoterapeutiske midler paradoksalt begrenser effektiviteten av disse behandlinger.
Tidligere har vi funnet at ATO, en medikament klinisk foretrukket for akutt promyelocytisk leukemi, avtar stabiliteten til mutante p53 protein gjennom en proteasom-reaksjonsveien og blokkering av proteasome sti kan lindre arsen-indusert mutant p53 degradering [32], [49]. I denne studien fant vi at ATO induserer uttrykk for Pirh2 E3 ligase. I tillegg fant vi at knockdown av Pirh2 hemmer, mens ektopisk uttrykk for Pirh2 forsterker, arsen-indusert nedbrytning av mutant p53 protein. Våre funn tyder på at arsen-indusert uttrykk for Pirh2 i kreftceller reaktiverer proteasome avhengige mutant p53 nedbrytning (fig. 5F). Selv mutant p53 kan bli målrettet av MDM2 i normale celler, kan MDM2 ikke polyubiquitinate mutant p53 i kreftceller [28]. Denne defekten er sannsynlig på grunn av økte nivåer av HSP70 og HSP90 i kreftceller, som danner komplekser med mutert p53-protein [24] – [26], [45]. I tillegg kan overuttrykt MDM2 isoform B i kreftceller kommuniserer med full-lengde MDM2 og hemme MDM2-mediert mutant p53 ubiquitinering [38]. Disse endringene gir en mulighet til å målrette svulster bærer et mutert p53. Faktisk fant vi at ATO samarbeider med 17AAG eller Saha til å hemme mutant p53 uttrykk og tumor celleproliferasjon.
Selv om ektopisk uttrykk for Pirh2 eller ATO behandling alene kan betydelig redusere nivået av mutant p53, kombinasjonen av ektopisk uttrykk av Pirh2 og ATO behandling ytterligere reduserer nivået av mutant p53 (fig. 3A-B). Dette innebærer at kapasiteten til Pirh2 E3 ligase for å degradere mutant p53 kan bli styrket ved ATO behandling. En mulighet kan være grunn til ATO-induserte posttranslational modifikasjoner av mutant p53 og Pirh2. Faktisk ble det rapportert at ved administrering av arsen i akutt promyelocytisk leukemi (APL), PML-RARα fusjons oncoprotein gjennomgår SUMOylation av små ubiquitin-lignende modifiserende midler (SUMOs) og blir deretter utsatt for RNF4-mediert proteasomal degradering [50], [51 ]. Inaktivering av SUMOylation fullstendig blokkerer PML degradering [52]. Dermed er videre studier garantert å undersøke om Pirh2 og /eller mutant p53 er modifisert av SUMO, som kan bli styrket ved behandling av ATO i tumorceller.
