Abstract
I denne studien har vi fokusert på gravitasjon følsomme proteiner av to menneskelige skjoldbrusk kreft cellelinjer (ML-en, RO82-W-1), som ble utsatt for en 2D clinostat (CLINO), en tilfeldig plassering maskin (RPM) og til vanlig en
g
-conditions. Etter et tre (3d) – eller syv-dagers-kultur (7d) på de to enhetene, fant vi begge celletyper vokser tredimensjonalt innenfor flercellede kuler (MCS) og også celler gjenværende tilhenger (AD) til kultur kolbe, mens 1
g
-kontroll kulturene bare dannet adherente monosjikt, hvis ikke bunnen av kulturskålen var dekket med agarose. I dette tilfelle cytokinene IL-6 og IL-8 lettes dannelsen av MCS i begge cellelinjer ved hjelp av væske-overlegg teknikk ved en
g
. ML-1-celler dyrkes på RPM eller CLINO utgitt mengder av IL-6 og MCP-1 i supernatanten, som var signifikant forhøyet sammenlignet med en
g
-controls. Frigjøring av IL-4, IL-7, IL-8, IL-17, eotaxin-en og VEGF økt tidsavhengig, men ble ikke signifikant påvirket av gravitasjonsforhold. Etter 3d med turtallet eller CLINO, en opphopning av F-aktin rundt den cellulære membranen var detekterbar i AD celler fra begge cellelinjer. IL-6 og IL-8 stimulering av ML-1-celler for 3d og 7d påvirket protein innholdet i ß
1-integrin, talin-1, Ki-67, og beta-aktin doseavhengig måte i adherente celler. Den ß
1-inte innhold ble betydelig redusert i AD og MCS prøvene sammenlignet med en
g
, mens Talin-en ble høyere uttrykt i MCS enn AD populasjoner. Markøren spredning Ki-67 ble forhøyet i AD prøvene sammenlignet med 1
g Kjøpe og MCS prøver. SS-aktin innhold av R082-W-1 celler forble uendret. ML-1-celler viste ingen endring i P-aktin i RPM kulturer, men en reduksjon i CLINO prøver. Dermed konkluderte vi med at simulert vektløshet påvirker frigjøring av cytokiner i follikulære skjoldbruskkjertelen kreftceller, og produksjon av ß
1-integrin og Talin-en og spår en identisk effekt under reelle mikrogravitasjon forhold.
Citation : Svejgaard B, Wehland M, Ma X, Kopp S, Sahana J, Warnke E et al. (2015) Vanlige Påvirkning av kreft celler som utøves av en tilfeldig Positioning Machine og en 2D Clinostat. PLoS ONE 10 (8): e0135157. doi: 10,1371 /journal.pone.0135157
Redaktør: Yoshiaki Taniyama, Osaka University Graduate School of Medicine, JAPAN
mottatt: 31 januar 2015; Godkjent: 19 juli 2015; Publisert: 14. august 2015
Copyright: © 2015 Svejgaard et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. forfatterne ønsker å takke den tyske romorganisasjonen (DLR, (DG) BMWi prosjekter 50WB1124 og 50WB1524), European Space Agency (ESA, ESA-CORA-GBF-2011 -005 prosjekt Device Sammenligning, ESA-CORA-GBF- 2013-001 prosjekt Thyroid 3) (DG), Aarhus universitet, Danmark (DG), Universitetet i Regensburg (JG), og DGLRM (Young Fellow Program for EW og GA) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Langvarig romferder ofte føre til skadelige helseplager hos mennesker. En rekke romfart effekter har blitt grundig studert i fortiden og anmeldt [1-4]. Noen effekter kan forklares med velkjente fysiologi; f.eks mangel på gravitasjons stress på ben muskulatur resulterer i en rask tap av bein og muskler, og mangel på gravitasjonsvektor forårsaker problemer knyttet til å balansere og øyebevegelser [1]. Det hadde vist seg at sletting av tyngdekraften påvirker de molekylære mekanismer i cellene direkte [3]. Celler som utsettes for reell eller simulert vektløshet endre sin gen og protein uttrykk oppførsel [5-7], øke apoptose [8, 9], forsinke cellevekst [10] og endre cytoskjelettet [11-13]. Videre flercellede aggregater ble oppdaget, som lignet de organer som cellene hadde blitt avledet [14].
I de senere år ble det klart at studier av oppførselen til kreftceller i verdensrommet kan støtte kreftforskning på jorden [15]. Nå er det av interesse å sammenligne rollene til forskjellige proteiner i celle tilpasning til endrede miljøforhold (mikrogravitasjon). Vi karakterisert ulike linjer på menneske thyroid kreft celler dyrket under betingelser med reelle og simulerte mikrogravitasjon med det mål å finne muligheter for å redusere kreftcellen aggressivitet [16-18]. Siden eksperimenter under reelle mikrogravitasjon dvs. romfart mulighetene er sjeldne og dyre [16], en stor del av studiene ble utført ved hjelp av enheter som mål å simulere mikrogravitasjon på jorden [3, 19]. Imidlertid påvirker hver enhet cellene, ikke bare ved å hindre sedimentering, men også av egenskapene til sin operasjonsmodus, som omfatter forbigående hypergravity eller vibrasjon [20]. Derfor ble det vurdert at noen observasjoner gjort på celler dyrket på en mikrogravitasjon simulere enhet ikke kan utelukkende skyldes hindrer celle sedimentering, men også på grunn av enhetsspesifikke effekter [18]. Videre har vi også observert at effektene er spesifikke for definerte typer av skjoldbruskcellelinjer [21]. For å undersøke innflytelsen av endrede tyngdekraft på cellenivå, studerte vi forskjellige kreftceller på forskjellige enheter som simulerer mikrogravitasjon i henhold til sammenlignbare protokoller. Før karakterisering, human thyroid-celler FTC-133, ML-1, og HTU-5 ble dyrket på den tilfeldig Positioning Machine (RPM, figur 1A) [17], men bare FTC-133 celler på RPM og den hurtigroterende 2D -Clinostat (CLINO, figur 1B) [18] og i verdensrommet [16, 22, 23]. Forsøkene avdekket flere aspekter og pekte på cytoskeletal proteiner og cytokiner som prime mål av mikrogravitasjon effekter [3, 19, 22, 23]
A:. Random Positioning Machine (RPM) og B:. 2D-Clinostat
i denne studien undersøkte vi effekten av simulert mikrogravitasjon hjelp av RPM og CLINO enheter på to menneskelige follicular skjoldbrusk kreft cellelinjer (ML-1, RO82-W-1) i en parallell måte enten for tre (3d) eller sju (7d) dager, henholdsvis, før utvalgte cytokiner og cytoskeletal proteiner ble kvantifisert. For å bedømme den mulige rolle av cytokinene IL-6 og IL-8 for ekspresjon av utvalgte proteiner i thyroid kreft celler, studerte vi virkningen av IL-6 og IL-8-programmet på Ki-67, ß
1- integrin, Talin-1 og beta-aktin proteiner i adherente ML-1-celler. Videre har vi fokusert på rollen av cytokinene IL-6 og IL-8 i ML-en og RO82-W-1 spheroid formasjon ved hjelp av flytende-overlay teknikk i henhold til en
g
-conditions [24]. Cytokiner og cytoskeletal proteiner, hvis utgivelse eller uttrykk ble endret, henholdsvis drøftes med hensyn til deres spesifikke roller i skjoldbruskkjertelen.
Metoder
Cellelinjer
ML-en cellelinje.
monolag av ML-1 follicular skjoldbrusk kreft celler [25] ble dyrket på enten RPM eller clinostat. ML-en cellelinje avledet fra en tilbakevendende svulst i en dårlig differensiert follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma (stadium pT4) av en 50-år gammel kvinne [25]. Cellelinjen har en doblingstid på 4 dager. Cellene tar opp glukose, utskille tyreoglobulin, tyroksin og trijodtyronin og er tumorigent i nakne mus.
UCLA RO82-W-en cellelinje.
RO82-W-en cellelinje var etablert av Estour
et al
. i 1989 [26]. Cellelinjen ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich Chemie (Munchen, Tyskland). Denne cellelinje avledet fra metastaser av en follikulær karsinom hos en kvinnelig pasient. Selv om den primære svulst RO82-W-1 sluppet tyroglobulin (Tg) inn i sirkulasjonen, opptaket av jod-131 var mindre enn 2% [26]. RO82-W-1-celler er Tg-positive, og er også tumorigene i nakne mus [26].
Begge cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 medium ved 37 ° C og 5% CO
2. Mediet ble supplert med 100 ug /ml streptomycin, 100 U /mL penicillin og 10% FCS (alle Biochrom, Berlin, Tyskland).
Fordi begge ondartede humane tyroid follikulær cellelinjer hadde beholdt evnen til å syntetisere Tg representerer de verdifulle modeller for studiet av menneskelige follikulære karsinomer.
Cell Culture Prosedyre
24 timer før forsøkene, celler av begge typer ble sådd på enten lysbilde kolber (Thermo Scientific, Roskilde, Danmark) med et voksende område av 9 cm
2 for CLINO eller inn T25 kolber (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) med et voksende område på 25 cm
2 for RPM. Cellene for hver type kulturflasker ble randomisert til å bli dyrket som statiske bakkekontrollene (en
g
-condition) eller på en av enhetene. Fase kontrast bildene ble tatt. De morfologiske bilder for RO82-W-1-celler er vist i figur 2. CLINO og RPM eksperimenter ble utført i enkelt inkubatorer ved 37 ° C, og bakkekontroll ble alltid holdt ved siden av eksperimentene i samme respektive kuvøse, hviler i en statisk
g
-conditions. Celler av begge typer ble høstet etter 3d dager og 7d
A:. Follikulære skjoldbrusk kreft celler dyrket for 3d på statisk en
g
. Cellene proliferated som 2D enkeltlag. B: RO82-W-1 celler inkubert for 3d på RPM. Pilene viser 3D-aggregater (flercellede kuler, MCS). Skjærene viser bade 3D-sfæroider i supernatanten. C: MCS dannet på CLINO etter 3 dager. D: RO82-W-1 celler dyrket i 7 dager på CLINO. Pilene viser 3D-kuler. Innsatsen viser en flytende sfæroid i supernatanten. E: RO82-W-1 celler dyrket i 7 dager ved statisk en
g
-conditions vokse så vel som en konfluent monolag. F: 7 dager gamle MCS dannet på RPM (piler) kunne påvises og tilhenger RO82-W-1 celler
Effekter av IL-6 og IL-8 på tilhenger ML-en. celler dyrket under en
g
– vilkår
ML-1 celler fra frosne aksjer ble dyrket i T75 kolber i RPMI 1640 medium til de nådde subconfluence (3-5 dager). Etterpå ble cellene subdyrket i 5 T175 og så snart de nådde subconfluence de ble dyrket på nytt i 20 T175 kolber. Etter å ha fått Subkonfluente ble cellene behandlet med bærer RPMI 1640 medium eller med 0,03 ng /ml 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /mL av IL-6 eller 1 ng /ml, 10 ng /ml, 45 ng /ml eller 100 ng /mL av IL-8-konsentrasjoner på henholdsvis [27-29]. Vi har også søkt om IL-6 gruppen 0,03 ng /ml og for IL-8 45 ng /ml, fordi disse konsentrasjonene ble utgitt i supernatanten ved ML-1 celler etter 7 dager.
10 T175 kolber ( 2 T175 uten IL-6 eller IL-8 og 8 T175 med forskjellige konsentrasjoner av IL-6 eller IL-8) ble dyrket i en inkubator (1
g
) for 3d, og et annet sett av 10 T175 for 7d.
etter 3d 7d eller mediet i kulturflasker er blitt kassert, ble cellene skrapet i 10 ml DPBS og sentrifugert ved 6000 rpm i 15 minutter. Supernatanten ble fjernet, ble pelleten oppløst i 1 ml DPBS og sentrifugeres på nytt ved 6000 rpm i 15 minutter. Pelletene ble umiddelbart anvendt for proteinekstraksjon, Western blot-analyse av beta-aktin, ß
1-integrin, talin-1 og Ki-67 og følgende densitometri [17,19]. Resultatene er gitt i figur 3.
Western blot-analyser og densitometriske data er gitt. A, C: beta-aktin, 3d og 7d; B, D: ß
1-integrin, 3d og 7d; E, G: Ki-67, 3 og 7 dager; F, H: Talin-1, 3 og 7 dager. IL-6 doser: 0,03 ng /ml; 1 ng /ml; 10 ng /ml og 100 ng /ml. Dosen 0,03 ng /ml er den maksimale mengden av IL-6 frigitt av ML-1-celler i supernatanten og målt ved hjelp av MAP (mørke-grå kolonner). IL-8 doser: 1 ng /ml; 10 ng /ml; 45 ng /ml og 100 ng /ml. Dosen 45 ng /ml er den maksimale mengden av IL-8 utgitt av ML-1 celler i supernatanten og målt ved MAP (mørk grå søyler).
Væske overlegg teknikk
Multicellulære tumor sfæroider ble fremstilt ved hjelp av væske-overlegg teknikk [24]. Thyroid kreft celler av ML-1-cellelinje og den UCLA RO82-W-1 cellelinjen høstet fra adherently voksende konfluente monolag ble sådd ut på agarose-belagte 96-multibrønntestplater (Nunc GmbH, Wiesbaden, Tyskland) ved en konsentrasjon på 4000 celler /200 ul RPMI 1640 medium og ble inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2. Cellene ble stimulert med bærer, IL-6 (1 ng /ml, 10 ng /mL og 100 ng /ml) og IL-8 (1 ng /ml, 10 ng /ml og 45 ng /ml). Etter 3d og 7d bildene ble tatt, og resultatene presenteres i figur 4.
A1-A7: Fase kontrast mikroskopiske bilder tatt etter 3d. ML-1 celler dyrket i agarose-belagte brønner, som ble behandlet med bærer eller forskjellige doser av IL-6 eller IL-8, henholdsvis. A8: 3 dager gamle spheroid og tilhenger ML-1 celler på CLINO. B1-B7: Bilder tatt etter 3d. RO82-W-1 skjoldbruskkreftceller dyrket i agarose-belagte brønner, behandlet med bærer eller forskjellige doser av IL-6 eller IL-8, henholdsvis. B8: 3 dager gamle spheroid og tilhenger RO82-W-1 celler på CLINO. C1-C7: Bilder tatt etter 7d. ML-1 celler dyrket i agarose-belagte brønner, som ble behandlet med bærer eller forskjellige doser av IL-6 eller IL-8, henholdsvis. B8: 7 dager gamle spheroid og tilhenger ML-en cellepopulasjon etter inkubasjon i 2D CLINO. D1-D7: fasekontrast bilder tatt etter 7d. RO82-W-1 skjoldbruskkreftceller dyrket i agarose-belagte brønner, behandlet med bærer eller forskjellige doser av IL-6 eller IL-8, henholdsvis. D8. 7 dager gamle MCS og tilhenger RO82-W-1 celler etter kultur i CLINO
Random Positioning Machine
RPM ble kjøpt fra ADS, tidligere nederlandsk Space , Leyden, Nederland (fig 1A). Konstruksjonen og funksjon ble beskrevet tidligere av van Loon [30]. Den består av to uavhengig roterende rammer innenfor hverandre. I våre eksperimenter ble det RPM operert i «tilfeldig mode» (60 ° /s), i hvilken retning endres kontinuerlig og tilfeldig. Over tid er alvoret vektor av jorden opphevet. Under forsøkene ble det RPM lastet med opp til 15 cm T25
2 kolber som ble festet til den første plate på maskinen. I praksis alle kolber bodde innenfor en avstand på 7,5 cm fra rotasjonssenteret. I forholdsvis lav hastighet (60 ° /s) av RPM, blir sentrifugalkraften oppleves av cellene selv på de fjerneste punkter fra rotasjonssenteret antas å være neglisjerbar [30].
2D Clinostat
2D CLINO anordning (fremstilt av DLR, Cologne, Tyskland, figur 1B) består av seks armer som muliggjør rotasjon av prøvene rundt en akse vinkelrett på tyngdekraften [31]. Hver roterende arm var lastet med 4 lysbilde kolber, for totalt 24 kolber per løp. På CLINO, er gravitasjonsvektoren randomisert ved hurtig og konstant rotasjon. Stor forsiktighet ble tatt for å sikre at alle kolber valgt for clinorotation var fri for luftbobler som ellers ville forårsake kaotiske flytende bevegelse. 2D CLINO roterer konstant ved 60 rpm genererer restakselerasjoner i en avstand på 3 mm rundt rotasjonssenteret i størrelsesorden 0,012
g
, mens celler som befinner seg på ytterligere avstand erfaring opp til 0,036
g
[18, 31]. Selv om gravitasjon messige terskelen av skjoldbrusk kreft celler er ukjente, bare de cellene som ligger innenfor en avstand på 3 mm rundt rotasjonsaksen ble høstet for analysene, noe som betyr at disse cellene hadde opplevd en svært lav rest akselerasjon.
pH-målinger
pH ble målt med en Metrohm 827 pH-meter ikke mer enn en time etter at forsøket avsluttes. Alle målinger ble utført to ganger, og prøvene ble holdt i lukkede Eppendorf-rør til måling for å unngå reaksjoner med atmosfæriske gasser.
fasekontrastmikroskop
Axiovert 25 Microscope (Carl Zeiss Mikros, LLC, USA) ble anvendt for visuell observasjon av morfologien av cellene.
Western blot-analyser
Western blot-analyser, immunoblotting, og densitometri ble utført i henhold til rutinemessige protokoller [32-37]. De følgende antistoffer ble brukt til å kvantifisere antigenene: Anti-beta-aktin, og anti-talin-1, ble anvendt ved en fortynning på 1: 1000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA); så vel som anti-integrin-beta
1 antistoff (Epitomics, Burlingame, USA); Ki-67 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, TX, USA (fortynning 1: 500); den sekundære, HRP-bundet antistoff ble benyttet ved en fortynning på 1: 4000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA). Som en lasting kontroll glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (ABR-Affinity BioReagents, Golden, USA, fortynning: 1:10 000) ble brukt
Membranene ble analysert ved hjelp ImageJ programvare (US National Institutes of Health, Bethesda. , MD, USA;. https://rsb.info.nih.gov/ij/), for densitrometric kvantifisering av bandene
F-aktin flekker
F-aktin ble visualisert ved rhodamine-phalloidin flekker (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og kjernene ble farget med Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), som publisert tidligere [36, 37]. Prøvene ble montert med Vectashield (Vector, Burlingame, CA, USA) og analysert mikroskopisk. F-aktin farget prøvene ble undersøkt ved hjelp av en Zeiss 510 META invertert konfokal laser scanning mikroskop (Zeiss, Tyskland), utstyrt med en Plan-Apochromat 63 × 1,4 mål. Eksitasjon og emisjonsbølgelengder var: λexc = 488 nm og λem = ≥505 nm for FITC. Etterpå ble prøvene analysert ved hjelp av bildeanalyseprogram Scion Image (versjon 1.63 MacOS Scion Corporation, USA).
Cytokin målinger av Multi-Analyttforringelse Profilering teknologi
Utgivelsen av cytokiner ble undersøkt via fler Analytt profilering (MAP) som tidligere beskrevet [18, 22]. For hver tilstand, ble fem supernatanter oppsamlet etter 72 timer og lagret ved -80 ° C inntil testing. Kartet ble utført av selskapet Myriad RBM (Austin, Texas, USA), bestemte de Human Cytokiner av valg MAP A og B.
Cytokin måling av enzymbundet immunosorbent assay
IL-6, IL-8, MCP-1-proteiner som frigjøres fra RO82-W-1 celler i cellekultursupernatanter under RPM og CLINO eksperimenter ble påvist ved ELISA-er kjøpt fra R 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Cellene i follicular skjoldbrusk kreft cellelinjer ML-en og RO82-W-1 ble dyrket for 3d og 7d på turtallet, på 2D CLINO og under normal statisk laboratorie en
g
-conditions. Opp til den syvende dag, forble pH-verdien i det normale område, uavhengig av om cellene ble dyrket på RPM under en
g
eller på CLINO. Men cellene forble vokser i et monosjikt bare hvis dyrkingen ble utført under en
g
, mens, når dyrket med endrede gravitasjonsbetingelser ble cellene splittet i to populasjoner av hvilke ett består celler som var tilbake adherently, mens den annen inneholdt celler som danner 3D aggregater som ligner på de som er beskrevet for FTC-133-celler [18].
Vi fikk lignende resultater med de RO82-W-1 og ML-1-celler. Begge typer celler prolifererte som RO82-W-1-celler er vist i figur 2 som en adherent monolag (Fig 2A og 2E) og som multicellulære sfæroider på RPM (Fig 2B og 2F) og CLINO (figur 2C og 2D). Det var ingen forskjell i form av antall kuler av hver cellelinje som oppsto på enten RPM eller CLINO. Begge enhetene leverte kuler av forskjellig størrelse (maks. Diameter 0,4 mm) ved begge tidspunkter som vist i figur 2B, 2C, 2D og 2F. Avløsning av AD celler startet tidlig og celle avløsning og spheroid dannelsen skjedde også etter 7d.
Effekt av IL-6 og IL-8 på ML-1 celler dyrket under en
g
-conditions
IL-6 (0,03 ng /ml og 1 ng /ml) stimulering økte mengden av beta-aktin og ß
1-integrin-protein i adherente mL-1-celler. Dessuten, IL-8 (1, 10 og 45 ng /ml) økte beta-aktin proteininnhold i disse celler, mens bare høyere doser (10-100 ng /ml) forhøyet proteininnholdet i ß
1-integrin i løpet av 3 dager (figur 3A og 3B).
etter 7d, en økning ble funnet for beta-aktin-protein i alle IL-6-behandlede prøver, så vel som i prøvene som er behandlet med 1 og 10 ng /ml IL -8 (fig 3C). SS
1-integrin-proteinet ble indusert ved 0,03 ng /ml så vel som ved 10 ng /ml IL-6, mens bare 10 ng /ml IL-8-induserte mengden av proteinet etter en 7-dagers-stimulering (fig 3D).
i tillegg har begge cytokiner (IL-6 og IL-8, alle doser) induserte en økning av den Ki-67 proteininnhold etter 3d (figur 3E). Etter 7d, alle IL-6 doser så vel som 1 ng /mL og 100 ng /mL IL-8 økte mengden av Ki-67-protein i ML-1-celler (figur 3G). I motsetning til dette ble det talin-1 proteininnhold tydelig redusert ved hjelp av IL-6 og IL-8-programmet til mediet. Lave doser av IL-6 og alle doser av IL-8 var effektive (figur 3F) i løpet av 3-dagers-en
g
-experiment. Et annet resultat ble funnet etter 7d. IL-6 stimulering resulterte i en økning av talin-1 (figur 3 H). Et lignende funn ble observert i IL-8-behandlede prøver (1, 10 og 45 ng /mL) av ML-1 cellelinje.
Disse forsøk som er definert for det første, den optimale IL-6 og IL-8 doser for ekspresjon av forskjellige proteiner i henhold til en
g
-conditions og for det andre dosene for å teste deres innvirkning på MCS formasjon ved hjelp av væske-overlegg metoden (se nedenfor og figur 4).
Effekt av IL-6 og IL-8 på spheroid formasjon under en
g
-conditions
Etter 3d, ML-1 celler viste bare løse celleaggregater, når dyrket med en
g
-conditions på agarose. 10 og 100 ng /ml IL-6 og 1, 10 og 45 ng /ml IL-8-behandling resulterte i en bedre aggregering av ML-1-celler til sfæroider, når de dyrkes i agarose-belagte brønner (væske-overlegg teknikk) (fig 4A1-4A7). RO82-W-1 celler dannet store uregelmessige aggregater etter en 3-dagers-inkubasjon i agarose-belagte brønner. Begge cytokiner forbedret dannelsen av RO82-W-1 flercellede kuler ved hjelp av væske-overlay-metoden (Fig 4B1-4B7).
Etter 7d, ML-1 celler viste uregelmessig dannet cellulære aggregater på agarose. De cytokin-behandlede gruppene inneholdt flere tette kuler etter en uke med stimulering (Fig 4C). De ML-1-kuler dannet på CLINO var lik de væskeoverleggsklumper som ble behandlet med 45 ng /ml IL-8 (fig 4C7 og 4C8).
Etter 7d, er RO82-W-1 celler vokste i form av tette flercellede kuler samt enkeltceller bading i væsken i agarose-belagte brønner. Cytokin påføring på mediet økt litt størrelsen av kulene (fig 4D1-4D7).
Sfæroidene i begge celletyper som dannes etter IL-6 og IL-8-behandling viste en lignende morfologi enn den MCS produsert etter inkubasjon på CLINO (fig 4A8, 4B8, 4C8 og 4D8).
cytokine release av ML-1 celler
Måling av cytokiner av human cytokin valg MAP A og B vi har oppdaget IL- 4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-17, MCP-1, VEGF-A og eotaksin-1 i supernatantene av de forskjellige cellekulturer. Vi målte omtrent 32 pg /ml IL-4 og IL-7 i supernatantene av tre dager gamle cellekulturer, uavhengig av hvorvidt cellene var blitt inkubert med turtallet, på CLINO eller i den stasjonære en
g
-kontroll. Etter en 7-dagers-eksponering, i cellekultursupernatanter inneholdt omkring 47 pg /ml IL-4 og ca. 43 pg /ml IL-7, uavhengig av dyrkningsbetingelsene (figur 5A og 5C). Et lignende fenomen ble observert med hensyn til IL-8 og VEGF-A. Omtrent 710 pg /ml VEGF-A og 11 000 pg /ml IL-8 ble funnet i supernatantene av tre dager gamle kulturer, uavhengig av hvorvidt cellene var blitt inkubert med turtallet, på CLINO eller under stasjonær 1
g
-conditions. Etter en 7-dagers eksponering, VEGF-A og IL-8-konsentrasjoner ble økt til omkring 3000 pg /ml VEGF-A og omtrent 35.000 pg /mL IL-8 ble påvist, igjen uten signifikant forskjell med hensyn til dyrkingsbetingelser (Fig 5D og 5F). Tatt sammen, figur 5A, 5C, 5D og 5E viser at innholdet av IL-4, IL-7, VEGF-A og IL-8 i kultursupernatantene ble forsterket i den 7-dagers-prøvene sammenlignet med 3- dag-prøver, mens en betydelig innflytelse utsette celler til RPM eller CLINO ikke kunne sees for disse 4 typer cytokiner
A:. IL-4, B: IL-6, C: IL- 7, D: IL-8, E: MCP-1, F: VEGF-A-proteiner utgitt av ML-1-celler i supernatanten etter en 3- og 7-dagers eksponering for RPM eller 2D Clinostat, bestemt ved Multi -Analyte Profilering av supernatanten. RPM: Random Positioning Machine; CLINO: 2D Clinostat; * P 0,05
I motsetning til dette, akkumulering av IL-6 og MCP-1 i de forskjellige kultursupernatantene tydelig avhengig av dyrkningsbetingelsene. En frigjøring av 27 og 33 pg /mL IL-6 ble funnet i supernatantene av RPM-prøver etter 3d og 7d av dyrkning, henholdsvis, mens en mengde på 22,5 pg /ml IL-6 ble målt i relevante 1
g
-controls (fig 5b). På lignende måte ble en konsentrasjon på 24 og 36 pg /mL IL-6 som finnes i supernatantene av CLINO prøver etter en 3- og 7-dagers-forsøket, henholdsvis, mens om en mengde på 25 pg /mL IL-6 ble målt i relevant en
g
-controls (fig 5B). I tillegg nivåene monocytt kjemotiltrekkende protein-1 (MCP-1) endret, da celledyrking ble utført på enheter simulere vektløshet. Under normale gravitasjonsbetingelser, omtrent 600 pg /ml MCP-1 ble funnet etter 3 dager, og mellom 700 og 750 pg /ml etter 7 dager, mens MCP-1-konsentrasjonene økte 750-950 pg /ml med turtallet og fra 700 til 1000 pg /ml på CLINO (fig 5E).
i tillegg til de seks cytokiner vist i figur 5 vi søkt om ytterligere cytokiner som vist i tabell 1. Men vi gjorde ikke oppdage ytterligere cytokiner slippes ut i supernatanten løpet av 3 dager med celledyrking under noen omstendigheter. Frigjøring av IL-17 og eotaxin påvises i prøver dyrket i 7 dager på CLINO, med turtallet, så vel som på bakken med ingen signifikante forskjeller i konsentrasjoner på omkring 1 pg /ml (IL-17) og 15 pg /mL (eotaxin) (tabell 1).
cytokine release av RO82-W-1 celler
Vi undersøkte utgivelsen av utvalgte cytokiner i supernatanten av RO82-W-1 celler etter en 3-dagers eksponering for RPM eller CLINO enhetene. Mengden av IL-6 ble signifikant forhøyet fra 56,9 pg /ml til 75,2 pg /ml på RPM (figur 6A). Et lignende resultat ble oppnådd for IL-8 (figur 6B). Ikke-signifikante økninger både for cytokiner ble målt for CLINO-prøvene.
sekresjon av MCP-1 for RO82-W-1-celler var mye lavere enn frigivelsen av ML-1-celler (figur 5E og 6C ). Kultur av RO82-W-1-celler på RPM eller CLINO fullstendig hemmet frigjøringen av MCP-1 (figur 6C)
A.: IL-6, B: IL-8 og C: MCP- 1 proteinene frigjøres ved RO82-W-1 skjoldbruskkreftceller i supernatanten etter en 3-dagers eksponering for RPM eller 2D CLINO, bestemt ved ELISA-teknikk. RPM: Random Positioning Machine; CLINO: 2D Clinostat; * P. 0,05
Effekter av simulert mikrogravitasjon på cytoskjelettet
Siden tidligere studier har vist at cytoskeletal proteiner av forskjellige typer celler er alvorlig påvirket av mikrogravitasjon [11-13, 37, 39-41], utførte vi F-aktin flekker på celler dyrket på RPM og på 2D CLINO for 3d og 7d. Etter 3 dager ble en opphopning av F-aktin langs den ytre cellemembranen var synlig i ML-1-celler så vel som i RO82-W-1 celler dyrket på CLINO og RPM (figur 7). Etter 7 dager ble cellene helt sammenflytende og overgrew hverandre. En fortykkelse av den ytre membranen ble funnet under begge forhold (en
g Hotell og simulert mikrogravitasjon), men var mer uttalt på RPM og CLINO
AC. ML-en 3-dagers -eksperiment. A: ML-1 celler, 3d, 1
g
-condition: normale celler med normal F-aktin cytoskjelettet B: ML-1 celler, 3d, opphopning av F-aktin på den ytre cellemembranen (gule piler ) etter RPM-eksponering. Den hvite pilen markerer Ta av celleaggregater fra tilhenger cellelaget. C: ML-1-celler, 3d, tykkere lag av F-aktin ved den ytre cellemembranen (gule piler). D-F: ML-en 7-dagers-forsøket. D: ML-1 celler, 7d, en
g
-condition: konfluente normale celler med normal F-aktin cytoskjelettet. E: ML-1-celler dyrket med turtallet for 7d viste tykkere lag av F-aktin ved den ytre membran (innsats). F: en 7-dagers eksponering av ML-1-celler til CLINO induserte lignende endringer av F-aktin cytoskjelettet. Innsatsen viser ticker F-aktin fibrene ved cellemembraner. G-I: RO82-W-en 3-dagers-eksperiment. G: normal F-aktin cytoskjelettet av RO82-W-1 celler. H: MCS dannelse (gule piler) etter en 3-dagers-inkubasjon på RPM. En akkumulering av F-aktin ved den ytre cellemembranen er synlige (gule piler). I: RO82-W-1 dyrket i 3d på clinostat viste en tydelig fortykning av F-aktin fibre (piler). Sett inn: 3D MCS. J-L: RO82-W-en 7-dagers-eksperiment. J: F-aktin cytoskjelettet av konfluente RO82-W-1 celler dyrket på en
g
. K, L: MCS dannelsen av RO82-W-1 celler etter RPM- (K) og CLINO-eksponering (L). Pilene viser 3D MCS og en fortykning av F-aktin fibrene ved de ytre membraner.
Western blot analyser av β-aktin i ML-1-celler viste en nedgang etter 7d av clinorotation (fig 8A ), men proteinet forble uendret etter 7d av RPM-eksponering. Eksponering av ML-1 celler til RPM og clinostat indusert signifikant reduksjon av β
1-integrin i AD og MCS celler etter 7d (fig 8B). Talin-1-protein ble signifikant redusert i AD-celler kun, når ML-1-celler ble inkubert på CLINO (figur 8C). Ki-67 protein, et kjerneprotein, forbundet med cellulær proliferasjon prosessen, ble signifikant forhøyet i AD-celler sammenlignet med MCS og en
g
-kontroll cellene på begge enheter (figur 8D).
Western blot analyser av AD: ML-1 celler etter en 7-dagers-eksponering på RPM og CLINO. A: SS-aktin, B: ß
1-inte, C: Talin-1 og D: Ki-67 proteiner. Klare forskjeller mellom de to enhetene er funnet for ß-aktin. Western blot analyser av E-H: RO82-W-1 celler etter en 7-dagers-eksponering på RPM og CLINO. E: ß-aktin, F: ß
1-inte, G: Talin-1 og H: Ki-67 proteiner. Det var ingen endring i beta-aktin innhold av RO82-W-1 celler dyrket på RPM eller CLINO for 7d. Mengden av ß
1-integrin og Ki-67 var sammenlignbare med ML-1 kulturer dyrket under s-μ
g
. * P. 0,05
Ingen endring i beta-aktin ble funnet i RO82-W-1 celler etter en 7-dagers-kulturen på RPM eller CLINO (Fig 8E). Proteininnholdet av beta-aktin holdt seg konstant.
