Abstract
Insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1R) er et transmembran reseptor som blir aktivert av insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1) og ved en beslektet hormonet IGF-2. Det hører til den store klasse av tyrosin-kinase-reseptorer og spiller en viktig rolle i kolorektal cancer etiologi og progresjon. I denne studien brukte vi bioinformatiske analyser for å søke etter mirnas som potensielt rettet mot IGF1R. Vi identifiserte bestemte geografiske områder for MIR-143 og MIR-145 (MIR-143/145) i 3′-utranslaterte område (3′-UTR) av IGF1R genet. Disse mirnas er medlemmer av en klynge av miRNAs som har blitt rapportert å vise tumor suppressor aktivitet. I samsvar med bioinformatiske analyser, identifiserte vi en invers korrelasjon mellom MIR-143/145 nivåer og IGF1R proteinnivået i kolorektal kreft vev. Ved overekspresjon MIR-143/145 i Caco2, HT29 og SW480 kolorektal kreft celler, vi eksperimentelt bekreftet at MIR-143/145 direkte gjenkjenner 3′-UTR av IGF1R transkripsjon og regulerer IGF1R uttrykk. Videre ble de biologiske konsekvensene av målretting av IGF1R av MIR-143/145 undersøkt av celleproliferasjonsprosesser analyser
i
vitro
. Vi viste at undertrykkelsen av IGF1R av MIR-143/145 trykkes spredning av Caco2 celler. Til sammen våre funn gi bevis for en rolle MIR-143/145 klynge som en tumor suppressor i kolorektal kreft gjennom hemming av IGF1R oversettelse
Citation. Su J, Liang H, Yao W, Wang N, Zhang S, Yan X, et al. (2014) MiR-143 og MiR-145 Regulere IGF1R skal utelates Cell Proliferation i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (12): e114420. doi: 10,1371 /journal.pone.0114420
Redaktør: Cecilia Williams, Universitetet i Houston, USA
mottatt: May 19, 2014; Godkjent: 10 november 2014; Publisert: 04.12.2014
Copyright: © 2014 Su et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2014CB542300), National Natural Science Foundation of China (nr 81101330, 31271378 og 81250044.) og Foundation Natural Science i Jiangsu-provinsen (nr BK2011013 og BK2012014.)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste diagnosen kreft i verden, og det er mer utbredt i utviklede land [1]. Det er anslått at den rå gjennomsnittlig forekomst av tykktarmskreft i Sørøst-Asia for begge kjønn var 6,95 /100 000 innbyggere i 2008, og forekomsten øker med alderen [2]. På molekylært nivå, oppstår kolorektal kreft fra en rekke genetiske og epigenetiske forandringer som inaktiverer tumorsuppressorgener og aktivere onkogener [3]. Men de grunnleggende mekanismer som ligger til grunn for kolorektal kreft initiering og progresjon forblir stort sett ukjent.
Insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1R), en tyrosinkinase reseptor for IGF-1 og IGF-2, blir ofte overuttrykt i tumorer og har blitt godt dokumentert i cellekultur, dyrestudier og mennesker til å spille en rolle i ondartet transformasjon, progresjon, beskyttelse mot apoptose, og metastase [4], [5]. IGF-reseptor-familien består av tre transmembranproteiner, og IGF1R-genet er lokalisert på kromosom 15q26, som koder for et enkelt polypeptid av 1367 aminosyrer som blir konstitutivt uttrykt i de fleste celler [5]. IGF1R aktivering fører til autofosforylering på tyrosiner 1131, 1135 og 1136 i den kinase domene, etterfulgt av fosforylering av juxtamembrane tyrosiner og karboksyterminale seriner [6]. Dette etterfølges av rekruttering av spesifikke tilkoblingsmellomprodukter, inkludert insulin-reseptor substrat-1 (IRS-1), SHC og 14-3-3-proteiner [7], [8]. Disse molekylene knytte IGF1R til ulike signalveier, slik at induksjon av vekst, transformasjon, differensiering og beskytter mot apoptose [9]. Når IGF-1-binding, aktiverer IGF1R den PI3K /Akt kaskade, som fremmer G1 til S cellesyklusprogresjon og løfter celleproliferasjon [10], [11]. IGF1R er overuttrykt i løpet av kolorektal kreftutvikling, med den høyeste ekspresjon observert i de prolifererende celler på bunnen av kryptene i kolon [11], [12]. Imidlertid gjen rolle IGF1R i kolorektal kreft som skal belyses.
I løpet av det siste tiåret, en ny klasse av små RNA-molekyler som kalles microRNAs (mirnas) har dukket opp som viktige regulatorer av initiering og progresjon av menneskelig kreft, inkludert tykktarmskreft [13] – [15]. mirnas er små (~22-nukleotid lange), enkelt-trådet ikke-kodende RNA-molekyler som negativt regulerer genekspresjon ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av mål-mRNA-molekyler, noe som resulterer i enten degradering av transkriptet eller inhibering av translasjon [16] – [18]. Mange mirnas fungere sammen med hverandre for å finjustere protein uttrykk på et globalt nivå. Dermed mirnas spille en betydelig rolle i post-transcriptional genregulering. Viktigere, nyere studier tyder på at feilregulering av miRNAs er forbundet med menneskelige maligniteter og foreslå en kausal rolle miRNAs i kreft etiologi [19]. mirnas formodentlig spiller en rolle i kreft fordi de kan påvirke oversettelse og stabiliteten av målrettede onkogener eller tumor-suppressorer, som til slutt påvirker cellulær fysiologi [19], [20]. For eksempel, MIR-143 og MIR-145 (MIR-143/145), som er lokalisert i en klynge innenfor 5q32-33 kromosom regionen, er nedregulert i mange typer kreft, inkludert tykktarmskreft [21], [22] . MIR-143 og MIR-145 har vist seg å ha anti-tumorigen aktivitet, herunder deltakelse i ulike kreftrelaterte prosesser som proliferasjon, invasjon og migrasjon [23].
Selv om feilregulering av IGF1R og miRNAs er assosiert med tumorigenesis i menneskelig tykktarmskreft, er lite kjent om mirnas som virker på IGF1R. I denne studien fant vi at IGF1R var direkte regulert av MIR-143 og MIR-145 i kolorektal kreftceller. Videre viste vi at MIR-143/145 kan hemme IGF1R uttrykk for å undertrykke spredning av kolorektal kreft celler.
Materialer og metoder
menneskelig vev
kolorektal kreft vev og sammenkoblede tilstøtende noncancerous vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår kirurgiske prosedyrer på The First Affiliated Hospital Anhui Medical University (Hefei, Kina). Både tumorer og noncancerous vev ble utsatt for histologisk analyse for diagnostisk bekreftelse. Den patologisk type hver kreft ble identifisert som adenokarsinom. Skriftlig samtykke ble gitt av alle pasientene eller deres foresatte, og etikkomiteen av The First Affiliated Hospital Anhui Medical University godkjent alle aspekter ved denne studien. Vevsfragmentene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen ved tidspunktet for kirurgi og lagret ved -80 ° C. De kliniske funksjonene pasientene er oppført i tabell S1in File S1.
Cell kultur
Den menneskelige kolorektal kreft cellelinjer Caco2, HT29 og SW480 ble kjøpt fra Shanghai Institute of Cell Biology, kinesisk Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Caco2-celler ble dyrket i DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco) i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2; HT29 og SW480 celler ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco) i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2.
RNA isolering og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra de dyrkede celler og vev ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Analyser å kvantifisere modne miRNAs ble utført ved hjelp av TaqMan mikroRNA sonder (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet 1 ug total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av AMV revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina) og en stilk-sløyfe RT primer, og en tiendedel av cDNA ble anvendt pr qPCR reaksjon (Applied Biosystems). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en TaqMan PCR kit og en Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaksjonene ble inkubert i en 96-brønners optisk plate ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle reaksjonene ble kjørt i triplikat. Etter reaksjonene var fullført, ble syklusen terskel (C
T) data bestemmes ved hjelp av faste terskelinnstillinger, og gjennomsnittlig C
T ble bestemt ut fra tredoble PCR. En sammenlignende C
T metoden ble brukt til å sammenligne hver tilstand til kontroll reaksjoner. U6 snRNA ble anvendt som en intern kontroll, og den relative mengde av miRNA normalisert til U6 ble beregnet med ligning 2
-ΔΔCT, hvori ΔΔC
T = (C
T miRNA-C
T U6)
target- (C
T miRNA-C
T U6)
kontroll.
for å kvantifisere IGF1R og GAPDH mRNA, 1 mikrogram total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp Oligo d (T) 18 primere (Takara) og ThermoScript reverstranskriptase (Invitrogen). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 42 ° C i 60 min og 70 ° C i 10 min. Real-time PCR ble deretter utført med RT produkt, SYBR grønt fargestoff (Invitrogen) og spesifikke primere for IGF1R og GAPDH. Sekvensene til primerne var som følger: IGF1R (sense): 5′-GCCAAGCTAAACCGGCTAAA-3 «; IGF1R (antisens) 5»-TATCCTGTTTTGGCCTGGACATA-3 «; GAPDH (sense): 5»-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 «; og GAPDH (antisens) 5»-CGCTCATTGCCGATAGTG-3 «. Reaksjonene ble inkubert ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min. Etter at reaksjonene var fullstendige, C
T-verdier ble bestemt ved å sette en fast terskel. Den relative mengde av IGF1R mRNA ble normalisert til GAPDH.
mirna overekspresjon
miRNA overekspresjon ble oppnådd ved å transfektere celler med en miRNA ligner, en syntetisk RNA-oligonukleotid-dupleks ligne miRNA forløperen. Syntetiske RNA-molekyler, inkludert pre-MIR-143, pre-MIR-145 og en egge negativ kontroll RNA (pre-MIR-kontroll), ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina). Caco2, HT29 og SW480 celler ble sådd i 6-brønners plater og transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) på neste dag når cellene var omtrent 70% sammenflytende. For miRNA overekspresjon eksperimenter, 100 pmol av pre-MIR-143, 100 pmol av pre-MIR-145 eller 50 pmol av både pre-MIR-143 og pre-MIR-145 ble brukt. 6 timer etter transfeksjon, ble mediet for Caco2-celler byttet til DMEM supplert med 2% føtalt bovint serum, og mediet for HT29 og SW480-celler ble endret til RPMI-1640 supplert med 2% føtalt bovint serum. Cellene ble høstet ved 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon for isoleringen av total RNA eller protein, respektivt.
Plasmid konstruksjon og siRNA interferens assay
A pattedyr-ekspresjonsplasmid (pReceiver-M02 -IGF1R) er utformet for å uttrykke spesielt full-lengde åpen leseramme (ORF) i humant IGF1R uten MIR-143/145-responsive 3′-UTR ble innkjøpt fra GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). Et tomt plasmid tjente som en negativ kontroll. SiRNA (sense: 5′-GCGGCUGGAAACUCUUCUATT-3 «, antisense: 5′-UAGAAGAGUUUCCAGCCGCTT-3») rettet mot humant IGF1R ble designet og syntetisert ved Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). En kryptert siRNA (Invitrogen) ble inkludert som en negativ kontroll. Overekspresjon plasmid eller siRNA ble transfektert inn Caco2 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt RNA eller protein ble isolert 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon. IGF1R mRNA og protein uttrykk nivåer ble vurdert av kvantitativ RT-PCR og Western blotting.
Luciferase reporter analysen
Hele 3′-UTR av menneskelig IGF1R ble forsterket av PCR hjelp humant genomisk DNA som en mal. PCR-produktene ble deretter satt inn i p-MIR-reporter plasmid (Ambion, Austin, TX, USA). Innsettingen ble bekreftet å være korrekt ved hjelp av DNA-sekvensering. For å teste bindende spesifisitet, sekvensene som samhandler med frø sekvens av MIR-143 og MIR-145 ble mutert (fra UUGGGAG til AACCCUC for Mir-143 bindingssetet og fra UUGGGAG til AACCCUC for Mir-145 bindingssete), og den mutante IGF1R 3′-UTR ble innsatt i en tilsvarende luciferase reporter plasmid. For luciferase reporter-analyser, Caco2, HT29 og SW480-celler ble sådd ut i 24-brønners plater og ko-transfektert med 0,8 pg av ildflue luciferase reporter plasmid, 0,8 ug β-galaktosidase (β-gal) ekspresjonsplasmid (Ambion), og lik mengder (20 pmol) av MIR-143/145 ligne eller en egge negativ kontroll RNA bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Den β-gal plasmid ble brukt som en kontroll transfeksjonseffektivitet. Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon og analysert med hensyn på luciferase-aktivitet ved hjelp av et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA).
Protein isolasjon og Western blotting
Celler eller vev ble lysert i en RIPA lysebuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,25% natrium-deoksycholat, og 1 mM EDTA, pH 8,0) med ferskt tilsatt protease inhibitor cocktail (Roche) i 30 minutter på is og ble deretter sentrifugert ved 16 000 x g ved 4 ° C i 10 min. Supernatanten ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen ble beregnet med en BCA proteinanalysesett (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE (Bio-Rad). Etter elektroforese ble proteinene elektrooverført til PVDF-membraner (Bio-Rad) og deretter blokkert med 5% skummet melk i 1 time. Membranene ble deretter inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C i 12 timer. Etter tre vaskinger i TBST, ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter tre vaskinger ble membranene inkubert med SuperSignal West Pico kjemiluminescens-substrat (Pierce). Den samme membran ble også probet med et GAPDH-antistoff for å tjene som en lasting kontroll. IGF1R og GAPDH antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling (# 3018) og Santa Cruz Bioteknologi (sc-25778), henholdsvis.
Celleproliferering analysen
Caco2 celler ble sådd på 5 × 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater og inkuberes deretter over natten i DMEM supplert med 10% FBS. Celler ble samlet opp ved 12, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Etter transfeksjon, ble 10 ul av celletellingsleder-8 (# c0038, Beyotime) tilsatt til det tilsvarende test brønn og inkubert i 1 time. Absorbansen ble målt ved en bølgelengde på 450 nm.
Edu spredning analysen
For å vurdere celleproliferasjon ble Caco2 celler sådd i 24-brønners plater. Cellene ble inkubert under standard betingelser i komplett medium. Transfeksjon av cellene ble utført påfølgende dag som beskrevet ovenfor. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble celleproliferasjon påvises ved hjelp inkorporering av 5-etynyl-2′-deoxyuridine (Edu) med EDU Cell Proliferation Assay Kit (Ribobio, Guangzhou, Kina). Kort fortalt ble cellene inkubert med 50 pM edu i 3 timer før fiksering, permeabiliseringen og EDU-farging, som ble utført i henhold til produsentens protokoll. De cellekjerner ble farvet med DAPI (Sigma) ved en konsentrasjon på 1 ug /ml i 10 minutter. Andelen av celler som innlemmet Edu ble bestemt av fluorescens mikroskopi.
Statistisk analyse
Alle de Western blotting og spredning analyse bilder er representative for minst tre uavhengige forsøk. Kvantitativ RT-PCR og luciferase reporter-analyser ble utført i tre eksemplarer, og hver enkelt eksperiment ble gjentatt flere ganger. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. Observerte forskjeller ble ansett som statistisk signifikant på p. 0,05 bruker t-test
Resultater
Identifikasjon av konservert MIR-143 og MIR-145 målse innenfor 3′-UTR av IGF1R
Tre beregningsalgoritmer, inkludert TargetScan [24] og RNAhydrid [25], ble brukt i kombinasjon for å identifisere potensielle mirnas som er rettet mot IGF1R. Alle tre algoritmer spådd MIR-143 og MIR-145 som regulatorer av IGF1R. De predikerte interaksjoner mellom MIR-143/145 og målse innenfor 3′-UTR av IGF1R er illustrert i figur 1A. En spådd hybridisering ble observert mellom både MIR-143 og MIR-145 og 3′-UTR av IGF1R. Selv om de to målse innenfor 3′-UTR av IGF1R var i nærheten av hverandre, områdene var ikke-overlappende. Det var perfekt komplementaritet mellom frøet region (kjernen sekvens som omfatter de første 2-8 baser av den modne miRNA) og beslektede mål. Minstefrie energiverdiene til hybridiseringer mellom MIR-143 og IGF1R og mellom MIR-145 og IGF1R var -19,8 og -24,8 kcal /mol, henholdsvis, som er godt innenfor rekkevidden av ekte miRNA-target par. Videre MIR-143/145 bindende sekvenser i IGF1R 3′-UTR ble svært konservert over arter. Dermed ble MIR-143 og MIR-145 valgt som kandidater for videre eksperimentell verifikasjon.
(A) Skjematisk beskrivelse av de hypotetiske tomannsboliger dannet av samspillet mellom bindingsstedene i IGF1R 3′-UTR (topp ) og MIR-143/145 (nederst). Den forutsagte fri energi verdien av hvert hybrid er indikert. Frøet gjenkjenningsseter er merket, og alle nukleotider i disse regionene er svært konservert over flere arter, inkludert menneske, mus og rotter. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse av MIR-143 og MIR-145 nivåer i seks par av kolorektal cancer vev (C) og noncancerous vev (P) prøver. (C og D) Western blot-analyse av IGF1R proteinnivåer i seks par av C og P prøver. C: representant bildet; D: kvantitativ analyse. * P 0,05; ** P. 0,01
Identifikasjon av en invers korrelasjon mellom MIR-143/145 nivåer og IGF1R protein nivåer i kolorektal kreft vev
Interessen MIR-143/145 klynge og IGF1R ble også støttet av den nylige identifikasjon av disse to mirnas som kandidat tumor suppressors [26] og IGF1R som et onkogen i tykk- og endetarmskreft [8]. Vi neste undersøkt om MIR-143/145 nivåer ble omvendt korrelert med IGF1R protein uttrykk i kolorektal kreft vev. Etter å bestemme nivåene av MIR-143/145 og proteinnivåer IGF1R i seks par av kolorektal kreft vev og tilsvarende noncancerous vev, viste vi at MIR-143 og MIR-145 nivåer ble konsekvent nedregulert i kolorektal kreft vev (figur 1B) , mens IGF1R protein nivåer var dramatisk høyere i kolorektal kreft vev (figur 1C og 1D). Resultatene indikerte at MIR-143/145 uttrykk nivåer er omvendt korrelert til IGF1R protein uttrykk i menneskelige kolorektal kreft vev.
Validering av IGF1R som et direkte mål på MIR-143/145
korrelasjon mellom MIR-143/145 og IGF1R ble ytterligere undersøkt ved å evaluere IGF1R uttrykk i den menneskelige kolorektal kreft cellelinjer Caco2, HT29 og SW480 etter overekspresjon av MIR-143/145. I disse forsøk ble overekspresjon oppnådd ved å transfektere Caco2, HT29 og SW480-celler med forhånds MIR-143 og /eller pre-MIR-145, som er syntetiske RNA oligonukleotider som etterligner MIR-143 og MIR-145 forløpere. Den effektive overekspresjon av MIR-143/145 er vist i figur 2A, 2F og 2K. Som forventet, overekspresjon av MIR-143 og /eller MIR-145 undertrykte betydelig IGF1R protein nivåer i Caco2, HT29 og SW480 celler (figur 2B, 2C, 2G, 2H, og 2L, 2M). For å bestemme regulerings nivået der MIR-143/145 påvirket IGF1R uttrykk, vi gjentok ovenfor eksperimenter og undersøkt uttrykk for IGF1R mRNA etter transfeksjon. Overekspresjon av MIR-143/145 ikke påvirker IGF1R mRNA stabilitet (figur 2D, 2I og 2N). Disse resultatene viste at MIR-143/145 regulerer spesifikt IGF1R uttrykk ved post-transkripsjonelle nivå, som er det mest vanlig mekanisme for dyr mirnas.
(A, F og K) Kvantitativ RT-PCR-analyse av mir -143/145 nivåer i Caco2, HT29 og SW480 celler behandlet med en egge kontroll, pre-MIR-143, pre-MIR-145 eller begge pre-MIR-143 og pre-MIR-145. (B, C, G, H, og L, M) Western blot-analyse av IGF1R proteinnivåer i Caco2-celler behandlet med en kryptert kontroll, pre-MIR-143, pre-MIR-145 eller både pre-MIR-143 og pre -miR-145. B, G og L: representant bildet; C, H og M: kvantitativ analyse. (D, I og N) Kvantitativ RT-PCR analyse av IGF1R mRNA nivåer i Caco2, HT29 og SW480 celler behandlet med en egge kontroll, pre-MIR-143, pre-MIR-145 eller begge pre-MIR-143 og pre- MIR-145. (E, J og O) direkte anerkjennelse av IGF1R 3′-UTR av MIR-143/145. Caco2, HT29 og SW480 celler ble ko-transfektert med ildflueluciferase journalister som inneholder enten villtype (WT) eller mutant (MUT) MIR-143/145 bindingsseter i IGF1R 3′-UTR og en egge kontroll, pre-speil 143, pre-MIR-145 eller begge pre-MIR-143 og pre-MIR-145. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene analysert ved hjelp av et luciferase-analysesett. Resultatene vises som forholdet mellom ildflue luciferase aktivitet i MIR-143/145-transfekterte celler til aktiviteten i kontrollcellene. * P 0,05; ** P. 0,01
For å avgjøre om de negative regulatoriske virkningene av MIR-143/145 på IGF1R uttrykk ble formidlet gjennom binding av MIR-143/145 til den anslåtte målområder i tre «-UTR av IGF1R mRNA, den fulle lengde 3′-UTR av IGF1R inneholdende de to forutsagte MIR-143/145-bindingsseter ble innsatt nedstrøms for ildflue luciferase-genet i en reporter plasmid. Det resulterende plasmid ble transfektert inn i Caco2, HT29 og SW480-celler sammen med en transfeksjon styre plasmid (β-gal) og enten pre-MIR-143/145 eller egge negativ kontroll RNA. Som ventet ble luciferase aktiviteten betydelig redusert i celler transfektert med pre-MIR-143 og /eller pre-MIR-145 (figur 2E, 2J og 2o). Videre introduserte vi punktmutasjoner i de tilsvarende komplementære områder i 3′-UTR av IGF1R å eliminere den anslåtte MIR-143/145 bindingssteder. Dette mutert luciferase reporter var upåvirket av overekspresjon av MIR-143/145 (figur 2E, 2J og 2o). Dette funnet antydet at miRNA bindingssteder bidro sterkt til miRNA: mRNA interaksjon som formidlet den post-transcriptional undertrykkelse av IGF1R uttrykk. I konklusjonen, våre resultater viste at MIR-143/145 direkte gjenkjenner og binder seg til 3»-UTR av IGF1R mRNA-transkript for å undertrykke IGF1R uttrykk i kolorektal kreftceller.
MiR-143 og MIR-145 kan undertrykker spredning i kolorektal kreft celler
neste fokusert på å studere rollene til MIR-143/145 i IGF1R regulering. Fordi IGF1R er viktig for regulering av proliferasjon og cellesyklusprogresjon, evaluerte vi virkningen av MIR-143/145 for kolorektal cancer celleproliferasjon ved hjelp av en CCK-8-analyse. Til støtte for den oppfatningen at MIR-143/145 funksjon som sentrale krefttrykt mirnas [26], Caco2, HT29 og SW480 celler transfektert med pre-MIR-143/145 viste trykkes spredning (figur 3A, 3E og 3I). Videre vurderes vi rolle IGF1R på celleproliferasjon. Å slå ned IGF1R, ble en siRNA rettet mot IGF1R designet og transfektert inn Caco2, HT29 og SW480 celler. For å overuttrykker IGF1R, ble et plasmid som uttrykker IGF1R ORF transfektert inn Caco2, HT29 og SW480 celler. Den effektive overekspresjon eller knockdown av IGF1R er vist i figur S1 i File S1. I samsvar med tidligere studier som viser at IGF1R fremmer celledeling [27], Caco2, HT29 og SW480 celler transfektert med IGF1R overekspresjon plasmid proliferated på et betydelig høyere rate (figur 3C, 3G og 3K), mens IGF1R knockdown med siRNA undertrykte betydelig spredning (figur 3B, 3F og 3J). Således er anti-proliferative effekt av IGF1R knockdown var lik MIR-143/145 overekspresjon. Videre, konstruerte vi et plasmid IGF1R overekspresjon resistent mot MIR-143/145 (ved eliminering av sin 3′-UTR). Sammenlignet med celler transfektert med pre-MIR-143/145, cellene transfektert med pre-MIR-143/145 og IGF1R overekspresjon plasmid viste signifikant høyere spredning priser (Figur 3D, 3H og 3L), noe som tyder på at MIR-143/145 motstandsdyktig IGF1R reddet undertrykkelsen av IGF1R ved MIR-143/145 og dempes den anti-proliferative effekt av MIR-143/145.
(A, E og i), CCK-8 levedyktighet ble utført 12, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon av Caco2 (A), HT29 (E) og SW480 (i) celler med en kryptert kontroll, pre-MIR-143, pre-MIR-145 eller både pre-MIR-143 og pre -miR-145. (B, F og J) CCK-8 levedyktighet ble utført 12, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon av Caco2 (B), HT29 (F) og SW480 (J) celler med enten en kryptert kontroll siRNA eller en IGF1R siRNA. (C, G og K) CCK-8 levedyktighet ble utført 12, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon av Caco2 (C), HT29 (G) og SW480 (K) celler med enten en kontrollvektor eller en IGF1R overekspresjon vektor. (D, H og L) CCK-8 levedyktighet ble utført 12, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon av Caco2 (D), HT29 (H) og SW480 (L) celler med enten en kryptert kontroll, pre-MIR -143 /145 eller begge pre-MIR-143/145 og IGF1R overekspresjon vektor. * P 0,05; ** P. 0,01
For ytterligere å teste den biologiske effekten av IGF1R målrettede MIR-143/145 på veksten av kolorektal kreft celler, effekten av MIR-143/145 og IGF1R på celle spredning ble undersøkt med en eDU-analyse, en immunkjemiske deteksjonsmetode som måler nukleotidanalog innlemmelse i nylig kopiert DNA. I samsvar med resultatene fra CCK-8 analysen, andelen av Edu-positive celler var betydelig lavere i celler transfektert med pre-MIR-143/145 (figur 4A og 4B). Tilsvarende ble betydelig flere EDU-positive celler observert i cellene med IGF1R overekspresjon, mens IGF1R-siRNA transfekterte celler viste motsatt effekt på celleproliferasjon (figur 4C og 4D). Disse resultatene igjen vist at redusert IGF1R nivåer ga samme fenotype observert av MIR-143/145 overekspresjon. For ytterligere å undersøke den funksjonelle sammenhengen mellom MIR-143/145 og IGF1R ble Caco2 celler samtidig tilført med pre- MIR-143/145 og IGF1R overekspresjon plasmid. Som forventet, overekspresjon av IGF1R dramatisk reddet undertrykkende effekt av MIR-143/145 på celleproliferasjon (Figur 4E og 4F). Til sammen resultatene viser at MIR-143/145 undertrykke celle spredning av stanse IGF1R.
De røde fluorescerende celler er i S-fasen av mitose, og de blå fluorescerende celler representerer alle cellene. (A og B) utd spredning Analysen ble utført 48 timer etter transfeksjon av Caco2 celler med en egge kontroll, pre-MIR-143, pre-MIR-145 eller begge pre-MIR-143 og pre-MIR-145. A: representant bildet; B: Forholdet mellom Edu-positive Caco2 celler. (C og D) utd proliferasjonsanalyse ble utført 48 timer etter transfeksjon av Caco2-celler med en kryptert kontroll siRNA, IGF1R siRNA, kontroll vektor eller den IGF1R overekspresjon vektoren. C: representant bildet; D: Forholdet mellom Edu-positive Caco2 celler. (E og F) utd spredning Analysen ble utført 48 timer etter transfeksjon av Caco2 celler med en egge kontroll pluss kontroll vektor, en egge kontroll pluss IFG1R overekspresjon vektor, pre-MIR-143/145 pluss kontroll vektor, eller pre-MIR -143 /145 pluss IFG1R overekspresjon vektor. E: representant bildet; F: Forholdet mellom Edu-positive Caco2 celler. * P 0,05; ** P. 0,01
Diskusjoner
I løpet av de siste tiårene, store fremskritt i vår forståelse av tykktarmskreft biologi har ført til bedre diagnostiske og prognostiske teknikker og til utviklingen av romanen målrettet terapi. Det gjenstår imidlertid effekten av nye behandlinger begrenset ved en kombinasjon av legemiddelresistens og ved vår begrenset forståelse av tumorcellesignaliseringsreaksjonsveier. Nylig har en viktig rolle for IGF1R i genesis og progresjon av tykktarmskreft dukket opp [28] – [30]. Dermed IGF1R tilbyr en spesielt lovende molekylære mål for kolorektal kreft terapi. Men svært lite er kjent om regulering av IGF1R uttrykk i tykk- og endetarmskreft. Dermed de molekylære mekanismene bak IGF1R regulatoriske veier legges helt klarlagt.
I denne studien, spådde vi IGF1R å være et mål av MIR-143 og MIR-145, som er en klynge av miRNAs som har vært rapportert i mange studier for å bli nedregulert og til å fungere som tumor-suppressorer i de fleste kreft [21], [22]. Etter måling uttrykket nivåer av MIR-143/145 og IGF1R i human kolorektal kreft vev og paret noncancerous vev, vi har oppdaget en invers korrelasjon mellom MIR-143/145 nivåer og IGF1R protein nivåer. Videre, ved overekspresjon MIR-143/145 i Caco2 celler, vi eksperimentelt bekreftet at MIR-143/145 direkte hemmet IGF1R oversettelse. Til slutt viste vi at MIR-143/145 hemmet IGF1R uttrykk og dermed undertrykt spredning av kolorektal kreft celler
i
vitro
. Resultatene avgrense en roman regulatoriske nettverk ansette MIR-143/145 og IGF1R å finjustere celleproliferasjon. Vi har også gitt bevis for at restaurering av IGF1R uttrykk kan reversere MIR-143/145-trykt celleproliferasjon. Interessant nok var det tidligere vist at MIR-145 kan målrettes mot insulin receptor substrat-1 (IRS-1) og IGF1R i tykktarmskreftceller [31] – [33]. Men mens en IRS-1 motstandsdyktig mot Mir-145 kan redde tykktarmskreftceller fra MIR-145-indusert veksthemming, en IGF1R motstandsdyktig mot Mir-145 ikke klarte å redde tykktarmskreftceller fra veksthemming [33]. Dette er ikke i samsvar med våre funn. Det virker som om MIR-145 kan målrette IGF1R å regulere cellevekst er avhengig av celle- og tumortyper. Under andre omstendigheter, kan MIR-145 utøve ulike funksjoner. Likevel, resultatene av våre og andres markere at MIR-143/145 kan virke som tumor-undertrykkende mirnas, og at satsing på IGF1R kan være en mekanisme som MIR-143/145 klynge utøver sin svulst undertrykkende funksjon. Derfor kan modulering av IGF1R av MIR-143/145 forklare hvorfor nedregulering av MIR-143/145 i løpet av kolorektal kreftutvikling kan fremme kreft progresjon.
mirnas som er plassert i nærheten i genomet (innen 10 kb) anses å tilhøre en enkelt klynge. miRNA klynger transkriberes coordinately som polycistronic enheter som er behandlet for å produsere de enkelte miRNA medlemmer, noe som resulterer i co-uttrykk av miRNAs.
