Abstract
Bakgrunn
Squamous celle lungekarsinom står for ca 25% av nye lungekarsinom tilfeller og 40.000 dødsfall per år i USA. Selv om det er flere genomisk målrettet behandling for lunge adenokarsinom, har ingen ennå blitt rapportert i plateepitelkarsinom lungekarsinom.
metodikk /hovedfunnene
Ved hjelp av SNP rekke analyse, fant vi at en region av kromosom segment 8p11-12 inneholder tre genes-
WHSC1L1
,
LETM2
, og
FGFR1
-er forsterket i 3% av lungekreft adenokarsinomer og 21% av plateepitelkreft lungekarsinom. Videre viste vi at en ikke-småcellet lungekreft cellelinje husing samlings forsterkning av
FGFR1
er avhengig FGFR1 aktivitet for cellevekst, som behandling av denne cellelinjen enten med
FGFR1 Anmeldelser – spesifikk shRNAs eller med FGFr små molekyl enzymatiske hemmere fører til hemming av cellevekst.
Konklusjon /Betydning
Disse studiene viser at
FGFR1
forsterkning er vanlig i plateepitel lungekreft, og at FGFR1 kan representere et lovende terapeutisk mål i ikke-småcellet lungekreft
Citation. Dutt A, Ramos AH, Hammerman PS, Mermel C, Cho J, Sharifnia T, et al. (2011) Inhibitor-Sensitive
FGFR1
Amplification i Human Ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE seks (6): e20351. doi: 10,1371 /journal.pone.0020351
Redaktør: Ming Du, Medical College of Wisconsin, USA
mottatt: 30 desember 2010; Godkjent: 30 april 2011; Publisert: 07.06.2011
Copyright: © 2011 Dutt et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
finansiering. Finansieringskilder for dette arbeidet inkluderer støtte fra Novartis, American Lung Association, Uniting mot lungekreft, Sarah Thomas Monopoli fond, Seaman Foundation og Genentech til MM E.Kr. støttes av en Ramalingaswami fellesskap fra Institutt for bioteknologi, Ministry of Science, Government of India. P.S.H. støttes av en Young Investigator Award fra National Lung Cancer partnerskap. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. M.M. er en konsulent til Novartis og mottar forskningsstøtte fra Novartis, mottar forskningsstøtte fra Genentech, og er en av grunnleggerne rådgiver og konsulent, og en egenkapital holder i Foundation Medicine. N.G. Laboratoriet mottar sponset forskning fra Novartis. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i utviklede land med dødsfall i 2009 anslås til om lag 160 000 i USA, med om lag 28% av alle kreftdødsfall [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 75% av alle lungekrefttilfellene og inkluderer to dominerende subtyper, adenokarsinom og plateepitelkarsinom (SCC), som utgjør 40% og 25% av NSCLCs henholdsvis [2], [3] . Til tross for klar histologiske og biologiske forskjeller, lunge adenokarsinom og karsinomer i stor grad er behandlet med de samme kjemoterapeutiske midler med unntak av antifolat middel pemetrexed som er godkjent for behandling av ikke-småcellet lungekreft squamous [4].
betydelige fremskritt i behandlingen av lunge adenokarsinom ha stammet fra detalj genomiske analyser og utplassering av molekylært målrettede midler ledende som har ført til forbedringer i pasientens utfall. Eksempler på dette er bruken av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) hemmere som gefitinib og erlotinib [5], [6], [7] for lunge-adenokarsinomer som bærer
EGFR
mutasjoner [8], [9], [ ,,,0],10], og av ALK-hemmere som crizotinib [11] for lunge adenokarsinomer peiling
EML4-ALK
trans [12], [13].
Men lite er foreløpig kjent om målrettes genetiske avvik underliggende plateepitelkreft lungekreft. I tillegg til
TP53
mutasjoner [14], plateepitelkreft lungekarsinom har vist seg å nære presiseringer av
PIK3CA product: [15],
SOX2 product: [16], og
EGFR product: [16] samt
EGFR
variant III mutasjoner [17]
DDR2
mutasjoner [18] og sjeldne presiseringer av
PDGFRA /KIT product: [ ,,,0],19], [20] og
BRF2 product: [21]. En fersk studie har vist samlings forsterkning av
FGFR1
locus på kromosom 8p assosiert med mobilnettet avhengighet av
FGFR1 Hotell og følsomhet for FGFr hemmere [22]. På denne tiden er det ingen FDA-godkjente målrettet terapi for plateepitelkreft lungekreft.
Målrette forsterket tyrosin kinaser med antistoffer eller med små molekyl hemmere har ført til dramatiske forbedringer i responsrate og total overlevelse av kreftpasienter med tumorer båtplass spesifikke genomiske avvik. Utdypninger av
EGFR Hotell og
ErbB2
har blitt rapportert i en rekke kreftformer, inkludert hode og nakke, spiserøret, mage, bryst og tykktarm kreft samt NSCLC [23]. Målretting av disse tyrosin kinaser, som for eksempel bruk av cetuximab å målrette
EGFR
i tykk- og hode- og halskreft [24], [25] og bruk av trastuzumab å målrette
ErbB2
i brystkreft [26], har resultert i betydelige forbedringer i pasientresultatene i hvert av disse sykdommene, selv om ikke alle pasienter med disse amplifikasjoner svare til målrettede midler [27], [28], sannsynligvis på grunn av ytterligere genomiske forandringer i svulsten som resulterer i primære motstand mot spesifikke midler [29], [30].
fibroblast-vekstfaktor-reseptor type 1-genet (
FGFR1
) er en av de mest vanlig amplifiserte gener i human kreft [16 ]. Fibroblast vekstfaktor reseptor (FGFR) tyrosin-kinase-familien består av fire kinaser, FGFR1, 2, 3, og 4, som spiller avgjørende rolle i utviklingen, og har vært vist å være mål for deregulering av enten amplifisering, punktmutasjon, eller trans (anmeldt i [31]). Trans involverer
FGFR3
, samt aktivering somatiske mutasjoner i
FGFR3
har blitt identifisert i multippelt myelom og blærekreft [32], [33], [34]. Vi og andre har identifisert aktive mutasjoner i
FGFR2
i livmorkreft [35], [36]. Forsterkning eller aktivering av
FGFR1
har blitt rapportert i oral plateepitel karsinom [37], esophageal plateepitelkarsinom [38], eggstokkreft [39], blærekreft [40], prostata kreft [41], rhabodomyosarcoma [ ,,,0],42], og lungekreft [16], [43], [44], [45], [46]. I samsvar med dette har en pan-FGFR tyrosinkinasehemmer vist seg å blokkere svulst spredning i en undergruppe av NSCLC cellelinjer med aktivert FGFR signale men har ingen effekt på celler som ikke aktiverer den veien [47].
FGFR1
har blitt identifisert som sjåføren hendelse i brystcarsinomer og NSCLC, spesielt plateepitelkreft lungekarsinom, husing lignende presiseringer av 8p11 kromosomsegment [22], [48]
Basert på SNP rekke kopiantall analyse av 732 prøver, rapporterer vi at
FGFR1
er somatisk forsterkes i 21% av lungekreft plateepitelkarsinom i forhold til 3,4% av lungekreft adenokarsinomer. Vi validere FGFR1 som et potensielt terapeutisk mål ved å vise at i det minste en
FGFR1
-amplified NSCLC tumorcellelinje som er følsom overfor FGFR enzymatisk inhibering og avhengig av
FGFR1
uttrykk for cellenes levedyktighet som vist ved shRNA behandling. Sammen med tidligere rapporter anmeldt ovenfor, er disse resultatene tyder på at FGFR1 kan være en attraktiv terapeutisk mål i NSCLC.
Materialer og metoder
NSCLC primærprøver og cellelinjer
NSCLC celle linjer, NCI-H1703 (plateepitel), NCI-H2444 (lunge), NCI-H520 (plateepitel), HCC95 (plateepitel), NCI-1581 (stor celle karsinom), Calu3 (ikke annet er spesifisert), NCI-H1734 (ikke ellers spesifisert), Colo699 (adenokarsinom), NCI-H2170 (plateepitel), NCI-H226 (plateepitel), A427 (adenokarsinom), NCI-H1563 (adenokarsinom), NCI-H1781 (adenokarsinom) og HCC15 (plateepitel) ble hentet fra samlingen av AF Gazdar, J. Minna og kolleger [49], [50], [51], fra ATCC (Manassas, Virginia, USA) og /eller DSMZ (Braunschweig, Tyskland). Celler ble opprettholdt i RPMI 1640 komplett media supplert med 10% kalveserum (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, California, USA) og penicillin /streptomycin (Gibco /Invitrogen). De NSCLC tumor /normal parene som analyseres i denne studien har vært beskrevet tidligere [16], [20], [45], [50], [52].
SNP tabellens dataanalyse
SNP array-eksperimenter ble utført på 732 NSCLC-tumorcellelinje og prøver og data analysert som beskrevet tidligere [16], [20], [45], [50], [52]. Grensene for 8p11 amplikon definert ved GISTIC analyse [53] ble identifisert som rapportert [52] (https://www.broadinstitute.org/tumorscape/pages/portalHome.jsf). Data skjerm har blitt utført ved hjelp av Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv).
Transfeksjon og infeksjon
Phoenix 293T emballasje cellelinje (Orbigen, San Diego, California, United States) ble transfektert med pBabe-Puro-baserte gateway vektorer ved hjelp FuGENE® 6 Transfeksjon Reagens (Roche, Indianapolis, USA) for å generere replikering inkompetente retrovirus. Målceller ble infisert med disse retrovirus i nærvær av 8 mikrogram /ml polybren. To dager etter infeksjon, ble cellene behandlet med 2 mg /ml puromycin (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) for to dager. De resulterende stabile cellelinjer ble brukt til eksperimentelle studier.
shRNA mediert
FGFR1
knockdown
shRNA vektorer ble hentet fra TRC (The RNAi Consortium). Målet sekvensene av shRNA konstruksjoner er:
FGFR1
# 1 (TRCN 0000121307). 5’AGTGGCTTATTAATTCCGATA-3 «
FGFR1
# 2 (TRCN 0000121308): 5’GCTTGCCAATGGCGGACTCAA-3 «
FGFR1
# 3 (TRCN 0000121309). 5’CTTGTATGTCATCGTGGAGTA-3′.
FGFR1
# 4 (TRCN 0000121310): 5’CAAGATGAAGAGTGGTACCAA-3 «
FGFR1
# 5 (TRCN 0000121311). 5’GAATGAGTACGGCAGCATCAA-3′.
LETM2
# 1 (TRCN 0000040243): 5’CGCACCTTCTACCTGATAGAT-3 «
LETM2
# 2 (TRCN 0000040244). 5′ CCCAGCACAAAGGAGATAGTT-3 «
LETM2
# 3 (TRCN 0000040245). 5’CCAGTTACATCATCACCCATA-3′.
LETM2
# 4 (TRCN 0000040246): 5’CCAGGAACTAGACTAATACAA-3 «
LETM2
# 4 (TRCN 0000040247). 5’GCATTGAGTGTATCAGAACTA-3′.
WHSC1L1
# 1 (TRCN 0000015613): 5’CGAGAGTATAAAGGTCATAAA-3 «
WHSC1L1
# 2 (TRCN 0000015614). 5’CCATCATCAATCAGTGTGTAT-3′.
WHSC1L1
# 3 (TRCN 0000015615): 5’CGAGAATATCATGTCCAGTTT-3 «
WHSC1L1
# 4 (TRCN 0000015616). 5’GCTTCCATTACGATGCACAAA-3′ .
WHSC1L1
# 5 (TRCN 0000015617). 5’GCAGGGAATTGTTTGAGTCTT-3 «
sekvensen målrettet av
GFP
shRNA er 5 «-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT-3». Lentiviruses ble fremstilt ved transfeksjon av 293T-celler emballasje med disse konstruksjoner ved hjelp av en tre-plasmid-systemet som tidligere beskrevet [54]. Målceller ble inkubert med lentivirus i 6 timer i nærvær av 8 mikrogram /ml polybren og igjen i friskt medium. Celler ble dyrket i to dager. Femti mikrogram totale cellelysater fremstilt fra de infiserte cellelinjer ble analysert ved Western blotting.
Vekst og proliferasjonsanalyser
For overlevelsesanalyser, 2 × 10
6 celler for hver svulst celle linje som uttrykker shRNAs konstruerer målretting
FGFR1
,
WHSC1L1
,
LETM2
eller
GFP
sammen med infiserte celler ble sådd i tre gjentak på en 6 brønners plate . Cell levedyktighet ble bestemt ved 24 timers tidspunkter for 4 påfølgende dager ved å telle celler ved hjelp Beckman Coulter Vi-Cell Automatisert celleviabilitet Analyzer følgende trypan blått fargestoff flekker. Prosentandelen av celle levedyktighet ble plottet for hver cellelinje av målinger innhentet på dag 4 i forhold til dag 1.
Soft agar forankringsuavhengig vekst analysen
For myke agar analyser, 2 × 10
4 NSCLC celler som uttrykker sh
FGFR1 Hotell og sh
GFP
ble suspendert i et toppsjikt av RPMI 1640 inneholder 10% kalveserum og 0,4% Velg agar (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, California, united States) og sådd ut på et bunnlag av RPMI1640 inneholdende 10% kalveserum og 0,5% agar Select på en 6 brønners plate. PD173074 eller Fiin-1 [55] ble lagt til som beskrevet til toppen agar. Etter 3-5 ukers inkubering kolonier ble tellet i tre eksemplarer. IC50s ble bestemt ved ikke-lineær regresjon ved hjelp Prism 5-programvaren (GraphPad Software).
cytotoksisitetsassayer
Avhengig av vekstkurver for hver cellelinje, mellom 800 og 2000 NSCLC celler ble sådd i 6 paralleller i 96-brønns plate. En dag etter plating, økende doser av FGFR hemmere PD173074 eller Fiin-1 ble tilsatt og spredning av celler ble vurdert 4 dager senere ved hjelp av WST-1-analysen (Roche Applied Science). Hvert datapunkt representerer medianverdien av seks replikate brønner for hver tumorcellelinje og inhibitorkonsentrasjon. IC50s ble bestemt ved ikke-lineær regressjon ved bruk av Prism software Graphpad.
Western avsetninger
Total protein ble ekstrahert og separert ved gelelektroforese ved lyseceller i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ), 150 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1% Triton X-100, og 0,25% IGEPAL. Proteasehemmere (Roche Applied Science) og fosfatase hemmere (Calbiochem) ble tilsatt før bruk. Før du legger til gel, prøvene var normalisert for total proteininnhold. Total protein lysater ble kokt i prøvebuffer, separert ved SDS-PAGE på 8% polyakrylamidgeler, overført til PVDF-membran og analysert over natten ved bruk av de passende primære antistoffer. Antistoffer brukes for immunoblotting var: anti- FGFR1 antistoff (# 3472, cellesignalisering Technologies, Danvers, MA, USA), anti- fosfor FRS2 Y436 (# 3861, cellesignalisering Technologies, Danvers, MA, USA), anti-fosfor -FRS2 Y196 (# 3864, cellesignalisering Technologies, Danvers, MA, USA), anti-FRS2 (# sc-17841, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). anti-WHSC1L1 monoklonalt antistoff (# sc-130 009, Santa Cruz Biotechnology), anti-LETM2 monoklonalt antistoff (# ab84626, Abcam), og anti-Actin monoklonalt antistoff (# sc-1615, Santa Cruz Biotechnology).
Statistisk analyse
Sammenligninger mellom SNP rekke kopitalldata for lunge adenokarsinom (AC) og plateepitelkarsinom (SCC) svulster som ble utført med Fishers eksakte T-test for å beregne tosidige p-verdier mellom prøvene husing høyt nivå forsterkning, definert som log2 ratio 0,7 eller 3,25 normaliserte DNA-kopier. P-verdier. 0,05 ble betraktet som signifikant
For å bestemme IC50 for FGFr hemmere, celle levedyktighet målinger av seks replikater i varierende konsentrasjoner av hemmere ble normalisert til ubehandlede kontrollceller. Sigmoidale doseresponskurver ble tilpasset til dataene etter ikke-lineær regresjon ved bruk av GraphPad Prism software. Standardavvik ble bestemt for gjennomsnittet av hver verdi ved hjelp av en innebygd modul av programvaren.
For shRNA eksperimenter utført i tre replikater ble celle nummer telles og gjennomsnitt og standardavvik ble bestemt ved hjelp av funksjonene i Microsoft Excel.
Resultater
FGFR1
forsterkes i ikke-småcellet lungekreft
Vi har undersøkt 8p11-12 genomisk region ved hjelp av Affymetrix 250K SNP matrise kopi talldata i en tidligere rapportert datasett av 732 NSCLC-prøver, (628 primærsvulster og 104) cellelinjer (tabell S1) [16], [20], [45], [50], [52]. Vi observerte høy forsterkning, definert som log2 ratio 0,7 eller 3,25 normaliserte DNA-kopier, av 8p11-12 kromosomsegment som omfatter
FGFR1
locus i 44 (6%) av NSCLC prøver (Figur 1a; Table S2). Hoveddelen (93%; 41/44) av disse amplifikasjonene var relativt kontaktarrangementer ( 50% av lengden av kromosom 8p) som angir foretrukket valg av de spesifikke målgener i samme område som forsterkning [52]. Det utledes kopiantallet av amplifikasjonene, normalisert til et kopiantallet av to for hver prøve, varierte fra 3,25 til 25 kopier (median = 2,8 eksemplarer). Den estimerte omfanget av regionen fokale presiseringer varierte fra 0,47 til 112,7 Mb (median = 2.74 Mb)
(A) Kopier nummer anslår at kromosom arm 8p11-12q for 44 NSCLC prøver (søyler,. Beordret av forsterkning av 8p11) med forsterkning som er større enn 3,25 kopier (log2-forhold på 0,7) fra en samling av 732 NSCLC primærprøvene og cellelinjer. Den horisontale linjen viser området som inneholder
FGFR1
,
LETM2 Hotell og
WHSC1L1
gener. Fargeskalaen går fra blått (sletting) til rød (forsterkning) med estimerte kopiantall vist. Grey regioner representerer fravær av SNP kopi talldata. (B) Bar graf som viser prosenter av prøvene huser 8p11-12 forsterkning i lunge adenokarsinomer (AC) og plateepitelkarsinom (SCC) viser at
FGFR1
forsterkning er observert i SCC på mye høyere frekvens enn AC. (C) FGFR1 uttrykket (øvre panel) vist i ti NSCLC-celler; åtte cellelinjer husing
FGFR1
forsterkning-HCC1734, HCC95, NCI-H2444, Calu3, NCI-H2077, NCI-H1703, NCI-H1581 og NCI-H520 (merket med en rød horisontale linjen nedenfor) -on NSCLC celle linjen husing sletting av regionen HCC15 (angitt med blå horisontale linjen nedenfor) – og tre NSCLC celler uten forsterkning-A427, NCI-H226, NCI-H2170 (angitt med svart horisontale linjen nedenfor) – ved hjelp av aktin som en lasting kontroll (vist i nedre panel).
FGFR1
kopiantall status og 8p11-12 fragment lengde bestemmes av SNP matrise er angitt nedenfor celler som forsterkning. Av notatet, ble NCI-H2077 og NCI-1581 funnet å være genotypisk identisk med fingeravtrykk analyse.
For å identifisere områder av betydelig kopitall endring, søkte vi GISTIC (Genomisk Identifisering av vesentlige mål i Cancer ) [53], og identifisert en 170 Kb region på 8p11 (38,28 til 38,45 Mb) som betydelig forsterket. Mens den generelle mønsteret av 8p11 forsterkning var i overensstemmelse med litteraturen om lungekreft som rapportert, vår utvalgsstørrelse og oppløsning gitt mer makt til å nøyaktig identifisere og lokalisere både store og fokale kromosom endringer i forhold til tidligere rapporter [45], [52 ]. De eneste gener innen regionen av forsterkning identifisert i vår analyse på tvers av alle prøvene var
FGFR1 Hotell og
LETM2
. I våre kopi talldata,
WHSC1L1
ble vanligvis forsterket med
FGFR1 Hotell og
LETM2 product: (41/44 prøver), men hele
WHSC1L1
gen gjorde ikke faller innenfor GISTIC peak (chr8: 38,284,229-38,451,475). Spesielt tre primære tumorprøver med forsterket
FGFR1 Hotell og
LETM2
gener hadde amplicon stoppunkter innenfor
WHSC1L1
, forklarer utelukkelse av
WHSC1L1
fra GISTIC forsterkning peak (figur S1 Figur S2). Amplikonet stoppunkter innenfor
WHSC1L1
er i overensstemmelse med en manglende forsterkning av den funksjonelle SET domene (chr8: 38,265,630-38,255,125) assosiert med histon-metyltransferase-enzymatisk aktivitet av genproduktet [56]. Disse resultatene kan ikke utelukke
WHSC1L1
som mål for forsterkning på 8p11 sammen med
FGFR1
men foreslår at det histone metyltransferase aktivitet er ikke sannsynlig å være spesielt rettet for forsterkning.
i sammenligne undergrupper av NSCLC primære svulster og cellelinjer, 3,4% (20/588) av adenokarsinomer og 21% (12/57) av plateepitelkarsinom næret 8p11 presiseringer, noe som indikerer at mens 8p11 forsterkes ved merk frekvenser over både store NSCLC subtyper, er det fortrinnsvis forsterkes i SCCS (
p
0,001, Fisher eksakt test) (Figur 1b). Ingen statistisk ble observert signifikante sammenhenger mellom tilstedeværelsen av 8p11 presiseringer og tilgjengelige kliniske parametere inkludert histologi, grad av histologisk differensiering, scenen på kirurgisk fjerning av svulster og alder, kjønn, eller rapportert etnisitet av pasientene (Tabell S3). I tillegg målrettet sekvensering av kinase domene
FGFR1
i 52 NSCLC cellelinjer og av hele
FGFR1
kodende sekvens i tre cellelinjer (NCI-H1581, NCI-H1703, NCI-H2170 ) viste ingen tegn til kinase domene mutasjoner (data ikke vist).
SNP rekke data viste en forhøyet
FGFR1
genkopitallet i 11 NSCLC cellelinjer ut av 104 NSCLC cellelinjer analysert (figur S3) med presiseringer observert i 36% (4/11) av plateepitel NSCLC cellelinjer analysert. Vi undersøkte FGFR1 protein uttrykk ved immunoblot analyse i 8 primære NSCLC cellelinjer som havn brennvidde eller bred 8p11 forsterkning over en log2 ratio på 1,6 eller 6,0 normaliserte DNA-kopier (NCI-H1703, NCI-H2444, NCI-H520, NCI-1581, NCH -H2077, Calu3, NCI-H1734, og HCC 95), tre som har tilnærmet nøytral
FGFR1
kopiantall (NCI-2170, NCI-H226 og A427) og 3 som havn
FGFR1
delesjon (NCI-H1781, NCI-H1563 og HCC15) ved immunoblotanalyse. Vi fant 6 av 8
FGFR1
forsterket NSCLC cellelinjer overuttrykker FGFR1 i forhold til cellelinjer som ikke havna forsterkning, med unntak av NCI-H1703 og Calu3 celler (Figur S4 Figur 1c). I samsvar med dette funnet, NCI-H1703, som huser en 8p11 forsterkning, har vist seg ikke å være avhengig av
FGFR1 product: [44], men på forsterket
PDGFRA product: [19], [20] . Videre ble et forhøyet nivå av fosforylering av FGFR1 substratet FRS2 observert i NCI-H1581 storcellet karsinom celler som bærer navet amplifikasjon av
FGFR1
, men ikke i celler som inneholder forholdsvis bredere nivåer
FGFR1
forsterkning (figur S4).
FGFR1
er nødvendig for å overleve i en NSCLC cellelinje husing samlings forsterkning
Basert på vår kopi nummer analyse,
FGFR1
og
LETM2
falt innenfor GISTIC definerte regionen statistisk signifikant forsterkning med
WHSC11
umiddelbar nærhet. For å bestemme den cellulære kravet om gener i regionen målrettet av forsterkningen, vurdert vi kravet om
WHSC1L1
,
LETM2 Hotell og
FGFR1
uttrykk for svulst vedlikehold av tappe dem individuelt ved hjelp shRNA. Transfeksjon med fem shRNA konstruerer rettet mot enten
WHSC1L1
eller
LETM2
hadde ingen differensial effekt på overlevelse av celler som fokal eller bred 8p11-12 forsterkning i forhold til å kontrollere celler uten forsterkning (data ikke vist).
i motsetning til tre av fem shRNA konstruerer målretting
FGFR1
, som alle førte til en 3- til 5-fold nedgang i FGFR1 protein nivå i forhold til shRNA kontroller (Figur 2a), betydelig hemmet celle overlevelse i en NSCLC cellelinje som bærer et samlings
FGFR1
forsterkning (NCI-H1581, figur 2b). shRNA konstruerer # 3 og # 4, som førte ikke til betydelige knockdown av FGFR1 protein nivåer, ikke påvirker overlevelse av celler som 8p11 forsterkning (figur 2b). Det var ingen observerte overlevelses effekter av
FGFR1
shRNA på cellelinjer som bærer relativt bredere
FGFR1
forsterkning (NCI-H1703, HCC95, HCC1734, Calu3, ikke vist) eller uten
FGFR1
forsterkning (NCI-H2170; fig. 2c HCC15, NCI-H1563 og NCI-H1781; ikke vist). Samlet er disse resultatene hevder at
FGFR1
uttrykk er nødvendig for levedyktigheten til minst en NSCLC cellelinje bærer en
FGFR1
forsterkning.
(A) Effekter av fem
FGFR1
shRNA konstruerer på FGFR1 protein uttrykk i NCI-H1581 celler som analysert ved immunoblotting. shRNAs # 1, # 2 og # 5 effektivt slå ned endogen FGFR1 uttrykk i NCI-H1581 celler infisert med shRNA-uttrykke lentiviruses mens shRNAs # 3 og # 4 ikke. Actin vises som en lasting kontroll (nedre panel).
(B Hotell og
C)
, infeksjon med tre uavhengige FGFR1-undertrykke hårnåler (# 1, # 2 og # 5) hemmer overlevelse av NCI-H1581 celler i løpet uttrykker
FGFR1
(B), men ikke hemmer overlevelse av celler ikke huse
FGFR1
forsterkning, NCI-H2170 (C) som vurderes av WST analysen. NI, ingen infeksjon. shGFP, kontrollerer hårnål spesifikk for grønt fluorescerende protein anvendt som en negativ kontroll. Alle resultater normalisert til overlevelse av celler infisert med shGFP.
For ytterligere å validere spesifisitet av cellen levedyktighet endringer knyttet shRNA-indusert FGFR1-utarming, vi undersøkte muligheten for ektopisk uttrykk for
FGFR1
cDNA å redde effektene av FGFR1 slå ned. Villtype
FGFR1
cDNA, mangler den 3′-utranslaterte område (UTR) av endogene FGFR1 mRNA målrettet av FGFR1 shRNA # 1, ble over-uttrykt i NCI-H1581 celler transfektert med dette shRNA konstruere. Rekonstituert nivåer av villtype FGFR1 protein resulterte i betydelig redning av overlevelse hemming fenotype (figur 3a, c), men hadde ingen innvirkning på
FGFR1
-Uavhengig NCI-H2170-celler (figur 3b). Kollektivt, disse eksperimentene implisere
FGFR1
som en kritisk onkogen mål av 8p11-12 forsterkning.
(A) Bar graf for redning analysen. Dødelighet på grunn av utarmet nivåer på endogent FGFR1 nivå i NCI-H1581 blir reddet av over uttrykk for villtype (wt) full lengde
FGFR1
kodende sekvens. (B) Ingen virkning på overlevelsen av NCI-H2170-celler ble observert på grunn av over ekspresjon av villtype form FGFR1. NCI-H2170 er ikke avhengig av FGFR1 aktivitet. NI, ingen infeksjon. shGFP, kontrollerer hårnål spesifikk for grønt fluorescerende protein anvendt som en negativ kontroll. Alle resultatene er normalisert til overlevelse av celler infisert med shGFP. Dataene som vises, er som gjennomsnittet av tre replikater. (C) Validering av FGFR1 unnsetning ved immunoblotting. Utarmet nivåer av endogen FGFR1 nivå i NCI-H1581 celler infisert med
FGFR1
shRNA-uttrykke lentiviruses rettet mot FGFR1 3’UTR (kolonne 1) er reddet av overekspresjon av vill type form for FGFR1 cDNA mangler 3’UTR (spor 2) med samtidig beskjeden redning i nivåer tyrosin rester fosforylering av FGFR1 underlaget FRS2 (midtre panelet). Actin vises som en lasting kontroll (nedre panel).
Interessant, en NSCLC cellelinje som bærer et samlings
FGFR1
forsterkning, NCI-H2444 (figur S3), var ikke sensitiv til knockdown av FGFR1 (data ikke vist). Denne cellelinje havner også en aktiverende
KRAS
G12V mutasjonen [57], [58], som er assosiert med resistens av kolorektal kreft til EGFR-rettet terapi cetuximab [25]. NCI-H2444 viser ikke FRS2 fosforylering (figur S4). Denne observasjonen tyder på at samtidig forekomst av andre aktiverende onkogener kan avlaste
FGFR1
avhengighet og spesielt at primær motstand mot FGFR1 hemming kan være styrt av
KRAS
mutasjonsstatus.
FGFR kinase hemmere hemmer veksten av
FGFR1
forsterket NSCLC celler
for å vurdere muligheten for at målretting
FGFR1
i 8p11 forsterket SCCS kunne representere en ny terapeutisk strategi i SCCS, vi studerte effekter av pan-FGFR inhibitor PD173074 på NSCLC cellelinjer.
FGFR1
-amplified NCI-H1581 celler som var følsomme for behandling med PD173074 som analysert ved kolonidannelse i bløt agar med IC
50s i området fra 10 til 20 nM (figur 4a og figur S5). I kontrast, NCI-H2170 celler med villtype
FGFR1
kopiantall var ufølsom for PD173074 (figur 4a). Vi har også utført PD173074 dose responskurver på celle overlevelse i flytende kultur for å sammenligne følsomheten av celler som
FGFR1
forsterkning og de uten og igjen fant at NCI-H1581 celler ble drept ved IC50 verdier på 14 nM, mens de uten forsterkning krevde mer enn 100 ganger høyere doser av PD173074 å hemme spredning (figur 4b). Etter avtale med disse resultatene, har vi også observert at en andre FGFR irreversibel inhibitor, Fiin-1 hemmer spredning av NCI-H1581 celler med fokus
FGFR1
forsterkning i forhold til NCI-H2170 uten
FGFR1
forsterkning, med IC50-verdier på 2,5 nM versus større enn 10 mikromolar, henholdsvis (fig S6).
(A) Behandling med de indikerte konsentrasjoner av pannen FGFR-inhibitor PD173074 inhibert bløt agar-kolonidannelse av NCI-H1581 NSCLC cellelinjer husing
FGFR1
forsterkning, sammenlignet med NCI-H2170 linje, som ikke havnen
FGFR1
forsterkning. Kolonier ble fotografert og kvantifisert etter 4 uker. (B) Behandling med de indikerte konsentrasjoner av PD173074 hemmet overlevelse av NCI-H1581-celler, men ikke fra NCI-H2170-celler, som bestemt ved WST-målingen ble utført etter 4 dagers behandling. IC50s indikeres.
Diskusjoner
Her har vi vist at
FGFR1
ofte forsterket i lungekarsinom og at denne forsterkningen er beriket i lunge SCCS. I det minste en NSCLC cellelinje med fokalt forsterkede
FGFR1
krever genet som demonstrert ved shRNA uttømming, og er også følsomme for hemming med FGFr kinase-inhibitorer.
andre enn Genes
FGFR1
det er foreslått å være den funksjonelle målet for forsterkning på kromosom segment 8p11-8p12, særlig
WHSC1L1 product: [44] og
BRF2 product: [21]. Vi mener imidlertid at bevisene som presenteres her, så vel som i en fersk rapport [22] argumenterer for
FGFR1
som funksjonell målet for forsterkning i minst én NSCLC cellelinje. I tillegg, i våre datasett
WHSC1L1
ikke forsterkes i alle
FGFR1
amplifiserte prøver, og hevder at det er usannsynlig å være den eneste relevante forsterket gen i 8p11-12 amplicon. Cellelinjen som ble vist å kreve
WHSC1L1
for sin overlevelse, NCI-H1703 [44], ikke over-express FGFR1 (figur 1c), viser ikke FRS2 fosforylering (figur S4), og er ikke avhengig av et annet forsterket tyrosinkinase onkogen,
PDGFRA product: [19], [20]. I kontrast, knockdown av
WHSC1L1
hadde ingen innvirkning på
FGFR1
-amplified,
FGFR1
-expressing NCI-H1581-celler, noe som tyder på at forsterkning av enten genet kan bidra til mobilnettet transformasjon i den aktuelle mobilnettet sammenheng.
en fersk studie karakteriserer DNA forsterkning i NSCLC antydet at
BRF2
, som koder for en transkripsjonsstart kompleks underenhet av RNA polymerase III, er målet for forsterkning i 8p11 amplikon [21]. Vi sammenlignet
FGFR1
forsterkning til
BRF2
forsterkning i lys av denne rapporten, og fant at av 12 prøver med høyest forsterkning av
FGFR1
i vårt datasett (log2 ratio
