Abstract
glioblastoma multiforme (GBM) er den vanligste voksen malignt gliom med dårlig prognose på grunn av motstand til strålebehandling og kjemoterapi, som kan være kritisk involvert i repopulation av kreft stamceller (cscs) etter behandling. Vi hadde de samme egenskapene av kreft stilk-lignende side befolknings (SP) celler sortert fra GBM celler undersøkt og studert effekten av Honokiol målretting på cscs. GBM8401 SP celler besatt stamcellemarkører, slik som nestin, CD133 og Oct4, og uttrykk for selvfornyelse relatert stemness gener, for eksempel
SMO
,
Notch3 Hotell og
IHH (indisk Hedgehog)
. Honokiol inhiberte proliferasjonen av begge GBM8401 parentale celler og SP-celler på en doseavhengig måte, IC
henholdsvis 50 var 5,3 ± 0,72 og 11 ± 1,1 uM. Andelene av SP i GBM8401 celler ble redusert ved Honokiol fra 1,5 ± 0,22% ned til 0,3 ± 0,02%, og 0,2 ± 0,01% ved doser på 2,5 uM og 5 uM, respektivt. De SP celler syntes å ha høyere uttrykk av
O
6-metylguanin-DNA metyltransferase (MGMT) og være mer motstandsdyktig mot Temozolomide (TMZ). Motstanden til TMZ kan være bare litt reversert av MGMT inhibitor
O
6-benzylguanine (
O
6-BG), men markert ytterligere forbedret med Honokiol tillegg. En slik betydelig forbedring ble akkompagnert med høyere induksjon av apoptose, større nedregulering av
Notch3
samt nedstrøms
Hes1
uttrykk i SP celler. Våre data tyder på at Honokiol kan ha kliniske fordeler for GBM pasienter som ikke responderer på TMZ behandling
Citation. Lai IC, Shih PH, Yao CJ, Yeh CT, Wang Peng J, Lui TN, et al . (2015) Elimination of Cancer Stem-lignende celler og Forsterkning av Temozolomide følsomhet ved Honokiol i glioblastoma multiforme Cells. PLoS ONE 10 (3): e0114830. doi: 10,1371 /journal.pone.0114830
Academic Redaktør: Waldemar Debinski, Wake Forest University School of Medicine, USA
mottatt: 1 april 2013; Godkjent: 14 november 2014; Publisert: 12 mars 2015
Copyright: © 2015 Lai et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Denne studien ble støttet av tilskudd fra departementet for helse og velferd, Taiwan (MOHW103-TD-B-111-01), National Health Research Institutes, Taiwan (03A1 CAPP33-014) og Ministry of Science and Technology, Taiwan (NSC 100-2632-B -038 til 001-My3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ondartet svulst i hjernen er en av de mest dødelige kreftformer hos voksne. Basert på WHO klassifisering, klasse I svulster er biologisk «godartet», mens klasse II svulstene er lav grad av malignitet med lengre kliniske kurs [1]. Grad III og IV er ondartet hjernesvulst som er dødelig i løpet av få år og 9-12 måneder, henholdsvis [2]. Høy grad av gliom (glioblastoma multiforme, GBM), den mest hyppige og ondartet hjernesvulst hos voksne er vanligvis resistente mot strålebehandling og kjemoterapi. Overlevelsen av GBM etter kirurgi og strålebehandling var begrenset i ett år. Kjemoterapi, for eksempel Temozolomide (TMZ), kan ytterligere forlenge overlevelsen opp til ca tjue måneder [3], men de fleste pasientene døde i løpet av to år. Dermed søker etter innovative terapeutiske midler og utvikle nye strategier for ildfaste GBM pasienter er viktig og presserende.
TMZ er et alkylerende kjemoterapeutisk middel som brukes i dag til behandling av GBM. Den terapeutiske nytte av TMZ avhenger av dets evne til å alkylat /metylat atom syre, som oftest forekommer ved de N-7 eller O-6-posisjonene til guaninrester [4]. Dette metylering skader DNA replikering av mispairing
O
-6-alkylguanine med tymin og utløser død av kreftceller. Det er vist at kreftceller hvis uttrykte høyere aktivitet av
O
6-metylguanin-DNA-metyltransferase (MGMT), til en DNA-reparasjonsenzym fjerne TMZ-DNA-addukt, kan redusere den terapeutiske effekt av TMZ og synes å være mer motstandsdyktig og ildfaste til TMZ terapi. Kombinert med MGMT hemmer, O
6-benzylguanine (
O
6
-bg), kan forsterke cytotoksisitet av TMZ [3]. Men fase II klinisk studie av
O
6-BG med TMZ viste ikke responsen fordel for GBM unntatt pasienter med anaplastisk astrocytom (AA) [5]. Årsakene til dette avvik kan skyldes de forskjellige ondartede virkemåter, inkludert tilstedeværelsen av høyere andel av kreft stamceller (CSC) i GBM [6]. Denne kliniske bevis ga opphav til vår motivasjon til å søke hvilken som helst therapeutics som er i stand til å målrette på CSC av TMZ-resistente GBM.
Forskningen for CSC eller tumor initiere celle (TIC) ble en interessant feltet siden 2000. uansett hva slags metoder som brukes for å identifisere den CSC, hadde flere solide tumorcellelinjer inneholdende CSC blitt rapportert i medulloblastom, neuroblastom, gliom, brystkreft, magekreft og kreft i tykktarmen, etc. [7] det hadde også vært demonstrert at pasienter med tilbakefall og motstandsdyktige overfor TMZ korrelerte med den høyere andel av CSC forble i tumormasse [6]. Derfor søker etter nye legemiddel målretting på CSC blir en ny strategi for å oppnå en bedre klinisk resultat av ildfaste GBM pasienter.
cscs ha kjennetegnene til selvfornyelse evner, tumorigenesis og avstamning differensiering i ikke-stilk tumorceller så vel som ekspresjon av multimedikament-resistens proteiner. I tillegg til å bruke CD markører for å identifisere cscs, en vanlig metode for å isolere den cscs er side populasjonen (SP) teknikken, som ble stadig mer populær siden 2004. Denne sortering teknikk for å isolere SP-celler ved dobbel-bølgelengde flowcytometri er basert på evnen til disse cellene til dyseutstrømningen den fluorescerende DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342 [8]. Fenotypen av SP-celler som er karakterisert ved høy ekspresjon av brystkreftresistent protein-1 (BCRP1 eller ABCG2), en av ATP-bindende kassett (ABC) transportører, som er assosiert med resistens mot flere legemidler i mange kreftformer ved å pumpe ut medikamentene [ ,,,0],9]. Siden multiresistens er en viktig egenskap ved cscs, har det også blitt vist at de sorterte SP-celler er anriket på cscs [10]. Dermed sortering SP celler er antatt å være en rik kilde til cscs og representerer en teknologiplattform for screening therapeutics som er i stand til å målrette på cscs.
Tradisjonell kinesisk medisin har blitt mye brukt i sykdomskontroll i tusenvis av år .
Magnolia officin
, også kalt Houpo i kinesisk eller Saiboku-tu på japansk, er en gammel slekten distribueres hovedsakelig i Sør- og Øst-Asia, samt Østen og Nord-Amerika. Flere aktive forbindelser avledet fra sine Barks hadde blitt identifisert, slik som Magnolia, Honokiol, 4-
O
-methylhonokiol, Obovatol og andre neolignan forbindelser som besatt mange ulike biologiske funksjoner, inkludert forbedring av allergiske og astmatiske reaksjoner [11 ]. Honokiol, en av de biphenolic bioaktive komponenter, besitter multifunksjonelle aktiviteter, som antioksidant, anti-inflammatorisk, chemopreventive og nervecellene effekter [12, 13, 14, 15]. Som litteratur rapportert, Honokiol spesielt hemmet PI3K /mTOR signale aktivering i hjernesvulst [16]. I tillegg viser våre nylige funn foreslått at Honokiol kunne reise gjennom blod-hjerne-barrieren (BBB), noe som indikerer muligheten for ondartet gliom behandling [17]. Men det er lite informasjon om sin anti-kreft effekt mot GBM celler, særlig effekt på cscs.
I denne artikkelen, undersøkte vi effekten av Honokiol på eliminering av cscs og tilbakeføring av TMZ motstand i GBM8401 SP celler, og studerte hva de underliggende mekanismene er ansvarlig.
Materiale og metode
Cells and Materials
Honokiol (5,3′-Diallyl-2,4′- dihydroksybifenyl), sulforhodamin B (SRB), Hoechst 33342, verapamil, reserpin,
O
6
-benzylguanine (
O
6
–
BG) og Temozolomide (TMZ) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (Shanghai, Kina). Trizol RNA ekstraksjon reagens ble oppnådd fra MDBio Co. (Frederick, MD, USA). Menneskelig glioblastoma multiforme (GBM8401, BCRC No. 60163) og menneskelig glioblastom /anaplastisk astrocytom (U-87 MG, BCRC No. 60360) cellelinjer ble kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC) av Taiwan Food Industry Research and Development Institute . Andre høy klasse reagenser ble kjøpt fra kommersielle selskaper.
Cell Kultur
Menneskelig glioblastom multi GBM8401 celler ble opprettholdt med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og menneskelig glioblastom /anaplastisk astrocytom U87 MG celler ble opprettholdt i Eagle er Minimum Essential Medium (MEM). Celler ble holdt i komplett medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 x ikke-essensielle aminosyrer og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin /
L-glutamin (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA ) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære.
SRB celleviabilitet assay
Cytotoksisitet virkning av Honokiol ble bestemt ved anvendelse av en modifisert SRB kolorimetrisk anticancer-drug screening-analyse [18]. Kort sagt ble passende mengder av celler sådd ut på 96-brønns flatbunnede plater i 200 ul medium. Etter en 24 timers inkubering ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Honokiol (oppløst i DMSO, ble sluttkonsentrasjonen ble justert til mindre enn 0,05%), etterfulgt av inkubasjon i 3 dager ved 37 ° C, 5% CO
2. Mediet ble deretter suget av, og cellene ble fiksert på plastkonstruksjonen ved tilsetning av 100 ul 10% trikloreddiksyre (TCA) og inkubering i 2 timer ved 4 ° C. Platene ble vasket fem ganger med vann for å fjerne TCA, og lufttørket i minst 1 time. Dette ble etterfulgt av farging med 200 ul av 0,065% SRB (sulforhodamin B) i 30 minutter ved romtemperatur, vasket fem ganger med 1% eddiksyre for å fjerne ubundet fargestoff, og deretter luft-tørking. Bundet fargestoff ble oppløst med 200 ul 10 mM Tris-base (pH 10,5). Absorbansen ble avlest ved hjelp av et spektrofotometer ved 570 nm.
Isolasjon av Side Befolkning (SP) og ikke-SP (NSP) Cells
Identifikasjon av side befolkningen ble utført med liten endring som tidligere beskrevet [19]. GBM8401 eller U-87 MG-celler (10
6 /ml) ble inkubert i medium inneholdende Hoechst 33342 (5 ug /ml) med eller uten positiv kontroll (ABC transporter inhibitor, Verapamil eller reserpin) i 3 timer ved 37 ° C . Etter inkubering ble cellene analysert ved hjelp av en Fluorescent-Activated Cell Sorting system med en diva programvare (FACSAria III, Becton Dickinson). Levende celler ble gated ved hjelp av propidiumjodid og analysert ved bruk av en kombinasjon av et 450 nm (Hoechst blå) og et 675 nm (Hoechst Red) filter etter eksitasjon med en 350 nm laser NUV. De SP celler ble definitivt identifisert ved behandling av spesifikke hemmere mot ATP-bindende kassett transportører. Den store cellepopulasjon, heter non-SP (NSP) celler, ble betydelig farget med Hoechst 33342. Både SP og ikke-SP celler ble sortert og høstet henholdsvis for videre studier. SP-celler ble opprettholdt med HEscGro medium (Millipore, Billerica, MA, USA) inneholdende epidermal vekstfaktor (EGF 10 ng /ml) pluss basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, 8 ng /ml), men uten serum, og ikke-SP celler ble inkubert med DMEM komplett medium.
flowcytometrisk analyse av Differensiering og Cell-overflatemarkører
Enkeltcellesuspensjoner celle~~POS=TRUNC suspen~~POS=TRUNC ble valgt ved hjelp av en 4-laser FACSCalibur (BD Science) og farget med en rekke av antistoffer mot CD-markører som er sterkt uttrykt i kreft stamceller: antihumant CD24-FITC; anti-human CD26-FITC; anti-human CD29-FITC; anti-human CD90-FITC, antihuman CD133-PE, anti human CD44-PE. Sperre, SP og ikke-SP-celler ble inkubert med spesifikke antistoffer som er nevnt ovenfor i 1 time, og deretter analysert ved strømningscytometri etter vask. Ved å studere evnen til differensiering SP-celler, ble det differensierte SP (d-SP) celler oppnådd etter dyrking i komplett medium i en uke. D-SP, SP og parentale celler ble deretter inkubert med fluorescerende fargestoff-konjugerte antistoffer som henholdsvis anti-GFAP-PE og anti-MAP2B-Alexa Fluor488,, i 1 time. Intensitetene av cellulær fluorescens ble deretter analysert ved strømningscytometri etter vask. Alle de fluoriserende antistoffer ble kjøpt fra BD Biosciences, San Jose, CA, USA, bortsett fra anti-human CD24-FITC (eBioscience, San Diego, CA, USA).
Reverse Transcription PCR-analyse
Celler ble behandlet med Honokiol eller temozolomid i 48 timer, totalt cellulært RNA ble isolert ved hjelp av MasterPure RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens protokoller, og deretter kvantifisert ved en absorbans ved 260 nm. RNA renhet ble bestemt ved å bruke A260 /A280-forhold (gjennomsnittlig ≥ 1,8). Total RNA fra hver prøve ble først revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av en MMLV revers transkriptase første-Strand cDNA Synthesis Kit (Epicentre Biotechnologies), og deretter målet gener ble amplifisert ved bruk av Taq DNA polymerase Master Mix (Ampliqon, Lars Quist, Danmark). Prøvene ble underkastet 30 sykluser med amplifikasjon (cDNA-syntese ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av pre-denaturering ved 94-C i 2 minutter, og PCR-amplifisering ble utført med denaturering ved 94 C i 30 sekunder, annealing ved 58- 60 ° C i 30 sek, forlengelse ved 72 ° C i 1 min, og den endelige forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter). PCR-produktene ble blandet med EZ-Vision DNA Dye (Amresco, Solon, OH, USA) og deretter underkastet elektroforese på en 1,8% agarosegel, endelig visualisert ved hjelp av UV-Visible Transilluminators System. Dataene ble deretter kvantifisert med bilde J programvare.
Western blotting
Etter behandling ble cellelysatene utarbeidet etter ReadyPrep Protein Extraction Kit (Bio-Rad) i henhold til instruksjonene. Totale cellelysater (20 ug) ble separert elektroforetisk med en 10% polyakrylamid SDS-PAGE-gel og overført til en polyvinylidenfluorid-membran ved hjelp av Bio-Rad Mini-Protean overføringssystem. Membranen ble beskåret og videre inkubert over natten ved 4 ° C med spesifikke antistoffer mot CD133 (St John laboratorium Ltd, London, UK), MGMT (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) og tubulin (Abcam, Cambridge, MA, USA ), respektivt. Etter inkubasjon med primære antistoffer, ble beskåret membranene vasket med TBST 3 ganger, og deretter inkubert med pepperrot peroksidase-merket sekundært antistoff i 90 minutter ved romtemperatur. Etter vask med TBST 3 ganger, ble endelig deteksjon utført med forbedret chemiluminescence (ECL) Western blotting reagenser (Minipore) og BioSpectrum Imaging System (UVP, Upland, CA, USA).
Cell Cycle Evaluering
Celler ble behandlet med Honokiol eller temozolomid i 48 timer. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene høstet og fiksert med 70% etanol over natten og deretter inkubert med et 25 ug /ml PI, 0,5% Triton X-100, og 0,2 ug /ml RNase A oppløsning i 30 minutter etter vasking med kald PBS . Til slutt, ble cellene resuspendert i 500 ul PBS, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri (Cytomics FC500, Beckman Coulter). Data ble samlet inn fra 10.000 celler og evaluert av cxp programvare.
Statistical Analysis
Alle forsøkene ble utført minst tre ganger og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikante forskjeller ble basert på sammenligning med de ubehandlede grupper, og ble beregnet ved en ett- eller to-veis variansanalyse (ANOVA) og Student
t
-test statistisk programvare. Verdier av p 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Isolering av Side Befolkning (SP) Celler fra GBM8401 og U-87 MG cellelinjer
Andelen Verapamil-. sensitive SP celler av GBM8401 eller U-87 MG ble analysert ved hjelp av strømningscytometri basert på utelukkelse av den DNA-bindende Hoechst 33342 fargestoff. Som vist på fig. 1 er det 1,3 ± 0,2% og 1,7 ± 0,3% av SP-celler som detekteres i U-87 MG og GBM8401 celler, respektivt. De SP-celler ble deretter dyrket i et opphengningssystem med stilk cellekulturmedium. Kulene dukket opp i suspensjonen ble det tydelig observert på dag 7-10, som kan bli høstet for påfølgende molekylære analyser.
(A) SP prosent ble analysert i GBM8401 og U-87 MG-celler etter farging og Hoechst flowcytometri. Cellene ble inkubert med fravær eller nærvær av spesifikk inhibitor Verapamil (100 uM) i 3 timer. SP-analysen ble utført, etterfulgt av farging av cellene med Hoechst33342 (5 ug /ml) i 90 min. Morfologien av GBM8401 (B) og U-87 MG (C) paren og SP-celler ble overvåket og fotografert etter utførelsen av SP strømningscytometri. De SP-celler ble inkubert i serumfritt kondisjonert medium for en uke, og den sfæroide morfologi ble observert. De SP celler ble differensiert i ikke-SP (NSP) celler for langsiktig kultur i fullstendig serum som inneholder medium.
Differensiering Mulighet for SP Cells
Ved å studere differensiering evnen til SP cellene ble differensiert SP (d-SP) celler oppnådd etter dyrking i fullstendig medium for en uke. Som vist på fig. 2 (A), GBM8401 SP-celler besatt mye lavere ekspresjon av neuronal markør MAP2B (2 ± 0,4%), noe som indikerer deres udifferensierte status. Når GBM8401 SP-cellene ble differensiert til d-SP-celler, ekspresjon av neuronal markør MAP2B ble like høy som i parentale celler (50 ± 1,9% i foreldre og 55 ± 2,7% i d-SP-celler). Tilsvarende ekspresjon av astrocytt-spesifikk markør GFAP (glial fibrillært surt protein) i U-87 mg SP-celler (1,7 ± 0,2%) var mye lavere enn i foreldrecellene (30 ± 1,8%). Når disse U-87 mg SP-cellene ble differensiert til d-SP-celler, ble ekspresjonen av GFAP markert øket til 8 ± 1,1% (fig. 2 (B)).
Foreldre, SP og SP differensiert ( D-SP) celler ble innhøstet for å analysere ekspresjon av spesifikke markørprotein slik som mikrotubul-assosiert protein 2B (MAP2B) i GBM8401 (A) og glial fibrillært surt protein (GFAP) i U-87 MG (B) celler. Signaler ble justert ved å trekke på bakgrunn av respektive isotype kontroll.
Karakterisering av GBM8401 SP Celler med Cancer Stem Cell overflatemarkører
CD24, CD26, CD29, CD44, CD90 og CD133 har blitt mye brukt til å identifisere cscs av faste tumorer [20]. Ekspresjonen av disse CD markører i de friske SP og ikke-SP-celler sortert fra GBM8401 celler ble vist i fig. 3. uttrykk for CD24, CD26, CD44 og CD133 i SP-cellene var signifikant (p 0,05) høyere enn de i de ikke-SP-celler, graden av foldene var 1,8 ± 0,2, 2,5 ± 0,3, 1,7 ± 0,1 og 1,8 ± 0,2, respektivt. Det var ingen signifikante forskjeller i uttrykket av de to andre markører, CD29 og CD90 (data ikke vist).
GBM8401 SP og ikke-SP celler ble sortert og deretter inkubert med spesifikke anti-CD markør antistoffer eller med isotypekontroll i 1 time, respektivt. Etter vask med PBS og sentrifugering ble cellene resuspendert med PBS og analysert ved hjelp av strømningscytometri. De histogrammer av strømningscytometri-analyse av CD133 (A), ble CD24 (B), CD26 (C), og CD44 (D) som er vist. Uttrykkene for de ovenfor nevnte stemness markører i SP-celler var betydelig høyere enn de som er i ikke-SP-celler. Men de uttrykk for andre markører som CD29, CD90, og SSEA-4, ikke var tilsynelatende annerledes (data ikke vist).
The Expression of Stemness Gene er forskjellig i SP og ikke- SP (NSP) Cells
for ytterligere å undersøke differensial uttrykk for stemness gener i SP og ikke-SP celler, undersøkte vi mRNA uttrykk for
Oct-4
,
CD133
,
nestin
,
β-tubulin-III
,
Notch3
,
IHH Hotell og
SMO
i GBM8401 foreldre, SP og ikke-SP-celler. Bortsett fra
β-tubulin-III
, uttrykk for mRNA-er som er nevnt ovenfor var alle signifikant (p 0,05). Høyere i SP-celler sammenlignet med foreldre og de ikke-SP-celler (figur 4 (A ) og 4 (B)). Videre er det mRNA-nivået av multimedikamentresistent protein, for eksempel
MDR1
og
ABCG2
, og
MGMT
ekspresjon i SP-celler var også høyere enn de i foreldre og ikke-SP-celler (fig. 4 (A) og 4 (B)). I samsvar med mRNA-data, protein nivåene av GBM CSC markør CD133 og strålebehandling resistens-assosiert protein MGMT åpenbart var mye høyere i SP-cellene sammenlignet med foreldre og ikke-SP-celler (Fig. 4 (C)).
(A) RT-PCR-analyse for de uttrykk for stemness markører (
CD113
,
Oct-4
), nevrale differensiering markører (
nestin
,
β-tubulin III
), DNA-reparasjon enzym (
MGMT
), stemness signalveien (
Notch3
,
IHH
,
SMO
) og stoff-resistensgener (
ABCG2
,
MDR1
,
MGMT
). Bortsett fra neuronal differensiering markør
β-tubulin III
, alle stemness genene uttrykk i SP celler var betydelig høyere enn i foreldrenes og ikke-SP (NSP) celler.
β-Actin Hotell og
GAPDH
ble brukt som lasting kontroll. (B) Kvantitativ og statistisk analyse av data fra (A) og to uavhengige lignende eksperimenter. *, P 0,05 sammenlignet med foreldreceller. (C) Western blot-analyse for proteinnivåer GBM CSC markør CD133 og strålebehandling resistens-assosiert protein MGMT. Begge CD133 og MGMT proteinnivåer var åpenbart mye høyere i SP celler sammenlignet med foreldrenes og ikke-SP celler. Den Tubulin ble brukt som lasting kontroll.
Honokiol Eliminerer SP og Hemmer spredning av GBM8401 Cells
GBM8401 foreldre og SP celler ble behandlet med forskjellige doser av Honokiol. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved SRB-analysen og andelen av SP-celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Resultatet viste at Honokiol inhiberte proliferasjonen av GBM8401 paren og SP-celler på en doseavhengig måte (fig. 5A). De GBM8401 SP-celler var mer resistente overfor Honokiol sammenlignet med foreldreceller, IC
50 var 11,2 ± 1,1 og 5,3 ± 0,7 uM, respektivt. Følsomheten av ikke-SP (NSP) celler for å Honokiol var lik den i parentale celler (S1 fig.). På den annen side ble andelen av SP-populasjonen i parentale celler minskes ved Honokiol fra 1,5 ± 0,23% ned til 0,3 ± 0,02%, og 0,2 ± 0,02% ved doser på 2,5 uM og 5 uM, henholdsvis, slik som vist i fig. 5B.
(A) GBM8401 paren eller SP-celler ble inkubert med konsentrasjoner av Honokiol serie i 48 timer og cellelevedyktigheten ble undersøkt ved SRB-analysen. (B) GBM8401-celler ble inkubert med fravær eller nærvær av spesifikk inhibitor Verapamil (50 uM) og Honokiol (2,5 og 5 uM) i 48 timer, henholdsvis. Etter å ha vasket med PBS og sentrifugering ble SP-målingen ble utført, fulgt av beising av cellene med Hoechst33342 (5 ug /ml) i 90 min.
Honokiol ytterligere forbedrer Cytotoksisitet og apoptose indusert ved en kombinasjon av temozolomid og MGMT Inhibitor
O
6
-bg i GBM8401 SP Cells
Som fig. 6a viser, GBM8401 SP-celler var ekstremt høyere resistente mot TMZ enn foreldrecellene, IC
50 var 490 ± 5,3 uM og 15 ± 0,4 uM, henholdsvis. Lignende resultat ble også observert i de U-87 MG paren og SP-celler. Som GBM8401 celler var relativt motstandsdyktig mot TMZ enn U-87 mg celler, så valgte vi GBM8401 cellene til å undersøke effektene av Honokiol på denne motstanden SP celler til TMZ. Ved en dose på 50 uM, TMZ bare litt redusert omtrent 20% av SP-celle-levedyktighet. Samtidig behandling med enten
O
6
–
BG (10 mm) eller Honokiol (5 mm), cellelevedyktigheten til 50 mikrometer TMZ-behandling gruppe ble svakt redusert fra 80% til 60% og 40%, henholdsvis (fig. 6B). Samtidig behandlingseffekt på 50 mikrometer TMZ pluss 10 mikrometer
O
6
-bg kunne ikke bli ytterligere forbedret ved å øke dosen av
O
6
-bg til 20 mikrometer (fig. 6B). Imidlertid kan det være betydelig forbedret ved Honokiol på en doseavhengig måte. Den cellelevedyktigheten ble ytterligere betydelig redusert til 23% (p 0,05) og 10% (p 0,01) ved Honokiol i doser på 2,5 uM og 5 uM, henholdsvis, sammenlignet med 50 uM TMZ pluss 10 uM
O
6
-bg-behandlede gruppen (fig. 6C). I tråd med dette ble det bare minimale apoptotiske effekter indusert ved monoterapi alene ble observert og ingen vesentlig økning av sub-G1 prosenter observert hvis kombinert TMZ med enten
O
6
–
BG eller Honokiol. Men slående økning av apoptose (ca 30% sub-G1-celler, p 0,05) ble funnet mens celler ble behandlet med TMZ (10 mm),
O
6
–
BG (10 mm) og Honokiol (5 mm) sammen (figur 7.). De sub-G1 proporsjoner GBM8401 SP celler behandlet med Honokiol og TMZ med eller uten
O
6
–
BG ble vist i tabell 1.
(A) U-87 MG og GBM8401 parentale celler og SP-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TMZ. Både GBM8401 og U87 MG SP-celler var mer resistente overfor TMZ enn foreldreceller. (B) Effekten av
O
6
-bg (mm) eller Honokiol (mm) på TMZ (mm) -suppressed GBM8401 SP celle levedyktighet. *, P 0,05 sammenlignet med blind; #, S 0,05 sammenlignet med 50 uM TMZ-behandlede gruppen. Ingen signifikant forskjell mellom hver to pund sign grupper. (C) Kombinasjonen effekter av Honokiol og TMZ pluss
O
6
-bg på cellelevedyktigheten av GBM8401 celler. *, P 0,05; **, P 0,01 sammenlignet med andre grupper som er angitt i søylediagram. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved SRB-analysen med triplikate prøver. H, Honokiol; T, TMZ; B,
O
6
-bg.
GBM8401 SP celler ble behandlet med 0,05% DMSO (A), 5 mikrometer Honokiol (B) , 10 mm TMZ (C), 5 mikrometer Honokiol kombinert med 10 mm TMZ (D), 10 mm TMZ pluss 10 mikrometer
O
6
-bg (E), og 5 mikrometer Honokiol kombinert med 10 mm TMZ pluss 10 mikrometer
O
6
-bg (F) i 72 timer, henholdsvis. Etter høsting ble cellene fiksert og farget med PI i 30 min og cellesyklusen ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri. Honokiol forbedret
O
6
-bg kombinert med TMZ-mediert cytotoksisitet gjennom å fremme apoptotisk celledød. H, Honokiol; T, TMZ; B,
O
6
-bg.
Honokiol i kombinasjon med
O
6
–
BG Videre Hemmer Temozolomide-indusert Notch3 /Hes1 Cascade i GBM8401 SP Cells
Som vist i fig. 8 (A) og 8 (B), mRNA nivåer av
MGMT
samt
Notch3 Hotell og dens nedstrøms
Hes1
var signifikant (p 0,05) økte med TMZ (100 uM) behandling sammenlignet med kontrollgruppen. Honokiol (5 mm) effektivt avskaffet TMZ-indusert uttrykk for
Hes1 Hotell og
MGMT
. I nærvær av
O
6
–
BG (20 uM) ble proteinnivået MGMT markert redusert (Fig. 8 (C)) . Når det kombineres med
O
6
–
BG (20 mm), Honokiol videre (p 0,05) redusert TMZ-indusert uttrykk for
Notch3 Hotell og
Hes1
mRNA, indikerer potensielle rolle Honokiol i kombinasjon med
O
6
–
BG for å reversere TMZ motstand i GBM SP celler.
(A) RT-PCR-analyse for uttrykket av
Notch3
,
Hes1 Hotell og
MGMT
mRNA i SP celler. GBM8401 SP-celler ble behandlet med 2,5 og 5 uM Honokiol (spor 2 og 3, henholdsvis), 100 uM TMZ (felt 4), 100 uM TMZ pluss 5 uM Honokiol (felt 5), 100 uM TMZ pluss 20 uM
O
6
-bg (spor 6), og 2,5 og 5 mikrometer Honokiol kombinert med 100 mikrometer TMZ pluss 20 mikrometer
O
6
-bg (spor 7 og 8, henholdsvis) i 48 timer.
18S
ble brukt som lasting kontroll. Honokiol i kombinasjon med
O
6
–
BG Videre undertrykt Temozolomide-indusert heving av
Notch3 Hotell og
Hes1
mRNA. (B) Kvantitativ og statistisk analyse av data fra (A) og to uavhengige lignende eksperimenter. (C) Western blot-analyse for proteinnivået av MGMT i GBM8401 SP-celler behandlet med midler som er beskrevet i (A). Den Tubulin ble brukt som lasting kontroll. CTL, DMSO mock kontroll; H, Honokiol; T, TMZ; B,
O
6
-bg. *, P 0,05 sammenlignet med DMSO mock kontrollgruppen. #, P 0,05 sammenlignet med 100 mikrometer TMZ-gruppen behandlet
Diskusjoner
«side befolkningen» (SP) teknikken er en veletablert metode for å isolere kreft stem-. lignende celler. Nylig, Fukaya og hans kolleger hadde publisert en artikkel med SP teknikk for å isolere kreft stilk-lignende celler fra ulike menneskelige glioblastom cellelinjer [21]. Deres studie viste at SP-celler hadde høyere medikament-utstrømning kapasitet, mer stemness gener ekspresjon og større tumorigenesity sammenlignet med ikke-SP-celler. Tilsvarende i denne studien, SP isolert fra GBM8401 celler syntes å ha CSC egenskaper. I tillegg til
nestin
,
Notch-1 Hotell og
ABCG2
, vi hadde også viste andre stemness gener, for eksempel
CD133
,
Oct4
,
MGMT Hotell og
MDR1
, ble mer uttrykt i SP celler sammenlignet med ikke-SP celler. Videre kan SP-celler differensierer til forskjellig fenotype av celler med differensieringsmarkører som GFAP og MAP2B. De selvsagt mye høyere CD133 og MGMT proteinnivåer av SP-celler, videre karakterisert sin stilk-lignende celleegenskaper, og derfor den GBM8401 SP representerte en anriket populasjon CSC.
Glioma cscs kunne isoleres og identifiseres av celleoverflatemarkører, slik som nestin og CD133, som også ble sterkt uttrykt i våre SP-celler. CD133 er de vanligste celleoverflatemarkører for hjernesvulst stamcelle identifisering og isolasjon; imidlertid prosentandelen av CD133-positive celler isolert fra human hjerne tumor vev var ikke konsekvent, varierte fra 3% til 45% [22]. Derfor er det ikke convincible å karakterisere kreft stamceller ved å bruke bare en spesifikk celleoverflatemarkør [23]. Basert på våre funn, ble andre markører som CD24, CD26 og CD44 også mer uttrykt i GBM8401 SP celler sammenlignet med ikke-SP celler, varierte fra 1,7 til 2,5 folder. CSC egenskaper av SP-celler ble ytterligere bekreftet ved bevis på høyere uttrykk for flere stemness markører som er beskrevet ovenfor.
Det ble demonstrert at CD133-høyt uttrykte celler lokalisert i den sentrale delen av tumor viste mer motstandsdyktig mot TMZ kontrast til de som befinner seg ved den perifere lag [6]. Følgelig TMZ motstandsdyktig GBM hadde blitt vist å inneholde høyere andel av CD133
+ celler, og de TMZ motstandsdyktig SP-celler i denne studien hadde også høyere nivå av CD133.
