Abstract
Bakgrunn
Hensikten med denne studien var å påvise muligheten for en longmer oligonukleotid microarray plattform for å profilere genkopitallet forandringer i prostata kreft cellelinjer og for raskt å indikere romanen kandidat gener som kan spille en rolle i kreftutvikling.
Funn
Metoder /Resultater og
Genome-wide screening for regioner av genetiske gevinster og tap på ni prostata kreft cellelinjer (PC3, DU145, LNCaP , CWR22 og avledet underlinjer) ble utført ved hjelp av komparativ genomisk hybridisering på 35.000 funksjon oligonukleotid mikromatriser (arrayCGH). Sammenlignet med konvensjonelle kromosom CGH, flere slettinger og små regioner av gevinster, særlig i pericentromeric regioner og regioner ved siden av telomerer, ble oppdaget. Som validering av høy oppløsning på arrayCGH vi videre analysert et lite fragment på 1,7 MB på 9p13.3, som ble funnet i CWR22 og CWR22-RV1. Økt kopiantall ble bekreftet ved fluorescens
in situ
hybridisering med BAC klone RP11-165H19 fra den forsterkede region bestående av de to genene interleukin 11 reseptor alfa (
IL11-RA
) og dynactin 3 (
DCTN3
). Ved hjelp av kvantitativ real time PCR (qPCR) kunne vi vise at
IL11-RA
er genet med høyest kopiantall gevinst i cellelinjene i forhold til
DCTN3
tyder
IL11-RA
å være forsterkningen målet. Screening av 20 primær prostata karsinom av qPCR avdekket en
IL11-RA
kopiantall gevinst i 75% av svulstene analysert. Gevinst av
DCTN3
ble bare funnet i to tilfeller sammen med en gevinst på
IL11-RA
.
Konklusjoner /Betydning
ArrayCGH bruker longmer oligonukleotid mikromatriser er gjennomførbart for høy oppløsning analyse av chomosomal ubalanser. Karakterisering av en liten opparbeidet område på 9p13.3 i prostatakreftcellelinjer og primære prostatakreftprøver av fluorescens
in situ
hybridisering og kvantitativ PCR har avdekket interleukin 11 reseptor alfa genet som kandidat mål forsterkning med en forsterkning frekvens på 75% i prostata karsinomer. Hyppig forsterkning av
IL11-RA
i prostata kreft er en mulig mekanisme for
IL11-RA
overekspresjon i denne svulsttypen
Citation. Kamradt J, Jung V, Wahrheit K, Tolosi L, Rahnenfuehrer J, Schilling M, et al. (2007) Påvisning av Novel amplikonene i prostatakreft ved Omfattende Genomisk Profilering av prostatakreft cellelinjer Bruke oligonukleotid-Based ArrayCGH. PLoS ONE 2 (8): e769. doi: 10,1371 /journal.pone.0000769
Academic Redaktør: Stefan Maas, Lehigh University, USA
mottatt: 5 juli 2007; Godkjent: 18 juli 2007; Publisert: 22 august 2007
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, Deutsche Forschungsgemeinschaft, gi nummer KA1793 /1-1, Bundesministerium für Bildung und Forschung, gi nummer 01GR0453, BioSapiens Network of Excellence:
Finansiering overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. , EU kontrakt nummer LSHG-CT-2003-503265
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Genetiske forandringer antas å være nøkkelen hendelser i utviklingen av de fleste tumorer, inkludert prostata cancer [1]. Tumorprogresjon ser ut til å avhenge av påfølgende oppkjøp av kromosomavvik som fører til gevinst eller tap av en del av tumorcellegenomet. Karakterisering av disse genomiske unormalt i prostata kreft kan derfor bidra til å forstå den molekylære patogenesen og kan avsløre genetiske markører for progresjon.
Siden sin første beskrivelse av Kallioniemi et al. (1992) [2] kromosom komparativ genomisk hybridisering (cCGH) har blitt den mest brukte teknikk for å påvise DNA kopi nummer endringer i kreft genomer. Vi og andre har analysert genomet av prostatakreftcellelinjer og primære prostatakreft prøver med denne teknikken [3] – [5]. Fluorescens
in situ
DNA hybridisering (FISH) og kvantitativ real time PCR har vist seg å være verdifulle verktøy for målet genet oppdagelse innenfor identifiserte kromosomale regioner av gain, f.eks
TLOC1 /SEC62
genet på 3q26.2 i prostatakreft [6]. Bruk av avanserte bioinformatiske modeller på cCGH data viste at mønstre av kromosomavvik inneholde verdifull prognostisk informasjon om en svulst [7].
På grunn av den relativt lave romlig oppløsning (~20MB) av cCGH og dens unøyaktighet i centromeric som samt telomeric regioner denne teknikken er verken i stand til å tilstrekkelig oppdage små områder av gevinst eller mister heller genomiske forandringer siden av cent eller telomere. Også for target genet identifikasjon i opparbeidet regioner som funnet av cCGH, fin-kartlegging med teknikker som FISH er arbeidskrevende og tidkrevende.
I forhold til cCGH, microarray-baserte CGH, referert til som matrise CGH (aCGH ) eller matrise CGH [8] – [9], har en omtrent 1,000 ganger høyere oppløsning (eller enda høyere) og tillater analyse av kromosomale regioner som har cent og telomere. Ulike tilnærminger til aCGH har blitt fulgt opp gjennom årene. Flere grupper som anvendes genomiske BAC matriser [10], mens andre har valgt cDNA eller oligonukleotid-matriser som opprinnelig ble konstruert for ekspresjon analyse [9], [11]. Arrays utformet for genuttrykk er en fordel for direkte sammenligning av genomisk endringer og genekspresjon på samme plattform. Flere studier har vist at denne tilnærmingen viser en signifikant sammenheng mellom genkopitallet og ekspresjonsnivået [12], [13]. Det siste, bruk av oligonukleotid arrays spesielt for aCGH utformet lenger ble rapportert [14] og er nå kommersielt tilgjengelig som en aCGH plattform. For aCGH analyser av prostatakreftcellelinjer samt kliniske prøver enten BAC eller cDNA arrays har blitt utnyttet [12], [13], [15] -. [20]
Her presenterer vi den første studien benytte en 35.000 funksjon 70-mer oligonukleotid array, opprinnelig laget for uttrykk analyse, for detaljert genomisk karakterisering av ni prostata kreft cellelinjer. Resulterende aCGH profiler er sammenlignet med cCGH resultater. Forekomsten av en nylig oppdaget lite fragment i pericentromeric 9p13.3 underbånd i ulike cellelinjer er validert av fisk og kvantitativ real time PCR og er også bekreftet i primær prostatakreft prøvene.
Materiale og metode
tumorcellelinjer og DNA
Den menneskelige prostata kreft cellelinjer DU145, PC3, LNCaP, CWR22 og CWR22-RV1 ble oppnådd fra American Type Cell Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) og dyrkes i henhold til de protokoller som er anbefalt av ATCC. Fra PC3 og DU145, to forskjellige grener var tilgjengelig, en holdt i laboratoriet av Kreft Genetic Branch, NHGRI, NIH (PC3
NIH
, DU145
NIH
) , den andre i urologisk laboratorium i Homburg (PC3
HOM
, DU145
HOM
). PC3-N, PC-125-1L, og DU145-MN1 ble etablert som tidligere beskrevet [21], [22]. LNCaP-CN4-2 ble vennlig levert av Z. Culig, Institutt for Urologi, Medical University, Innsbruck, Østerrike.
Primær prostatakreft prøvene
Kvantitative genkopitallet målinger ble gjort på 20 primær prostata adenokarsinom prøvene, som ble hentet etter radikal prostatektomi fra tidligere ubehandlede pasienter med prostatakreft. Etter prostatektomi, ble prøvene dissekert av en patolog, hurtigfrosset og lagret ved -80 ° C. Bare prøver som inneholder . 50% tumorceller ble inkludert i studien
DNA isolering og kvantifisering
DNA ble isolert ved hjelp av QiAmp DNA kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og deretter kvantifisert av en fluorometrisk analyse (Quant-iT Pico Grønn dsDNA Kit, Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Fluorescens ble målt ved anvendelse av en TECAN (Salzburg, Østerrike) SpectrafluorPLUS mikroplateleser fluorescens med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 535 nm. DNA-konsentrasjonen ble beregnet fra en standardkurve av dobbeltkjedet kontroll-DNA levert med kittet som ble målt i triplikat ved konsentrasjonene 30, 3, 0,3 og 0,03 ng /ul (målt ved fluorometri).
Hele genom-amplifikasjon og rensing
Et volum på 2,5 mL av 4 ng /ul fortynninger fra cellelinjer og kontroll-DNA ble anvendt som utgangsmateriale for forsterkning. Den phi29-amplifikasjon ble utført i henhold til den Repli-G kit produsentens instruksjoner (Qiagen) ved hjelp av en inkubasjonstid på 16 timer. Repli-G reaksjoner ble sjekket av en sanntid basert intra
Alu
-PCR analysen. I tillegg DNA-konsentrasjonen ble fluorimetrisk kvantifisert med Quant-iT Pico Grønn dsDNA Kit (Invitrogen) og varierte mellom 10-30 mikrogram.
Alu-PCR assay
På grunn av en hyppig observert bakgrunn syntese i Repli-G forsterket no-mal kontroll, utførte vi en ekstra kvalitetskontroll på en fil (1:50 fortynning) av urenset phi29-amplifiserte DNA. En
Alu
spesifikt bånd bør være til stede i alle Repli-G amplifiserte prøver og fraværende i Repli-G forsterket no-templat kontroll. Hver 2 pl prøve ble sammenlignet med en pl seriefortynninger av hann-kontroll-DNA (Promega, WI, USA) (10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,01, 0,001 ng /ul). De 25 ul reaksjoner inneholdt 1 × Hot start SYBR grønn mester mix (Qiagen), 1,5 mM MgCl
2, 0,2 mM dNTP Mix, 400 nM primere hver (
Alu
-forw: 5′-GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT- 3 «og
Alu
-rev: 5′-ATTCAAAGGGTATCTGGGC TCTGG-3′). Syklusbetingelsene var som følger: 1 min ved 94 ° C; 35 sykluser av 20 sekunder ved 94 ° C, 20 s ved 55 ° C og 20 s ved 72 ° C; 10 min ved 72 ° C. De amplifiseringsprodukter ble sjekket ved smelting kurve analyse bruker LightCycler ™ kvantifisering programvare 3.5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og gel elektroforese. Amplifisering ble ansett som vellykket når mengden av humant
Alu
sekvenser i phi29 genererte DNA-fragmenter som varierte fra 10-30%, og når en smøre av DNA-fragmenter, som strekker seg fra 1 til 20 kb, var synlig ved hjelp av gelelektroforese.
ArrayCGH
10 ug av amplifisert og renset DNA ble merket ved bruk av BioPrime Array CGH Genomisk Labeling kit (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner i et volum på 50 ul med en modifisert dNTP-miks inneholdende 120 uM av hver av dATP, dGTP og dCTP; 60 iM dTTP; og 60 mikrometer Cy5-dUTP eller Cy3-dUTP. Merket DNA ble renset ved anvendelse av QIAquick PCR-rensekolonner (Qiagen). Svulst og referanse-DNA ble slått sammen, blandet med 50 ug Cot-1 DNA (Invitrogen) og konsentrert til et volum på 20 pl i en vakuumsentrifuge. DNA ble deretter blandet med en lik mengde av 2 x formamid buffer, denaturert ved 95 ° C i 5 minutter og preinkubert ved 37 ° C i 30 minutter i et vannbad.
Hybridiseringer ble utført på tilpasset (skrives de NHGRI /NIH Microarray Kjerne Facility) glass som inneholder Operon 70mer oligonukleotid satt versjon 3 med 34.580 oligonukleotider. Oligonukleotidene ble opprinnelig utviklet for uttrykk analyse. For arrayCGH alle oligonukleotider ble sekvens justert mot menneskelige genom (build 34), EnsEMBL, RefSeq, dbEST og UCSC kjente gener resulterer i 29.383 oligonukleotider med en bestemt kromosom kartlegging.
DNA-prøver ble hybridisert på array for 16 -18 timer ved 42 ° C utnytte MAUI 4-bay hybridisering system og MAUI Mixer A0 (BioMicro system, Salt Lake City, Utah, USA). Etter hybridisering matriser og Maui Mixer ble demontert i 42 ° C 1 x SSC og 0,05% SDS (vaskeoppløsning 1) og deretter vasket to ganger i vaskeløsningen en i 5 minutter etterfulgt av to vaskinger i 0,1 x SSC (vaskeløsning 2) for 5 minutter. Tørkede array-lysbilder ble skannet med en ScanLite Express microarray scanner (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA). Rå bildefiler til gruppene ble behandlet ved hjelp DeArray programvare [23] og resulterende bildedata ble importert til R-miljø med bioconductor pakker [24] for videre analyse.
Databehandling og statistisk analyse av microarray data
Den statistiske analyser for å identifisere kromosomale regioner med endrede kopiantall i enkle matriser besto av to trinn. Først etter å kartlegge de målte genkopitallet pålogginger forhold til sine respektive kromosom steder, utjevning ble brukt. Den adaptive vekter utjevning basert algoritme GLAD [25] for å identifisere områder med konstant kopiantallet ble brukt. Denne algoritmen passer en stykkevis konstant funksjon langs kromosomet å logg-prosenter. Deretter, for hver prøve regioner som er forsterket eller slettet ble identifisert. Her ble normalfordelinger montert i en robust måte å smoothed log-prosenter av hver matrise. Spesielt ble median og interkvartilt område beregnet, og en normalfordeling er tilpasset til disse parametrene. Til slutt ble konstante regioner med verdier over eller under spesifiserte tidsavgrensninger oppdaget som vunnet eller tapt regioner, henholdsvis. For å skille mellom svake og sterke signaler, median pluss eller minus en eller to standardavvik ble valgt som tidsavgrensninger for svake og sterke avvik, henholdsvis. Algoritmene ble implementert i R programmeringsspråk (www.r-project.org). Resultatene ble oppnådd ved bruk av R-versjon 2.3 og GLAD biblioteket levert av Bioconductor prosjektet (www.bioconductor.org), versjon 1.7.
kromosom CGH
Hybridisering ble utført som beskrevet tidligere med mindre modifikasjoner [26]. 500 ng biotin-merket probe-DNA, 500 ng digoksigenin-merket referanse-DNA (human hann referanse-DNA, Promega, WI, USA) og 50 ug human umerket cot-DNA (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) ble utfelt med 0,3 M natriumacetat i 2,5 fold volum av etanol og oppløst i 2,5 ul avionisert formamid. Etter 30 minutter ble 2,5 pl av den doble hybridiseringsblandingen (100 mM natriumfosfatbuffer, 4 x SSC og 20% dekstran-sulfat, pH 7,0) tilsatt og denaturert i 5 min ved 75 ° C etterfulgt av 15 min preannealing ved 37 ° C. Hybridiseringen ble utført under forseglet dekkglass i 3 dager ved 37 ° C i et fuktig kammer. Etter hybridisering, ble platene vasket tre ganger i 5 minutter i en vaskeløsning (50% formamid i 2 x SSC pH 7,0) ved 45 ° C, to ganger i 2 x SSC (pH 7,0) ved 45 ° C, og en gang i 0.1 × SSC (pH 7,0) ved 45 ° C.
Biotinylated probe DNA ble påvist med FITC-merket streptavidin (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Den digoxigenized kontroll DNA ble påvist med rhodamin-merket anti-digoxigenin antistoffer (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Til slutt ble objekt motfarget, og en antifade løsning påføres i det samme trinnet (Vectashield med DAPI, Vector Laboratories).
Objektglassene ble analysert ved bruk av et digitalt bildeanalysesystem (MetaSystems, Altlussheim, Tyskland), basert på en Olympus AX 70 mikroskop utstyrt med et avkjølt CCD-kamera (fotometriske, Tuscon, Arizona, USA). For å analysere differensial fluorescens data vi brukte MetaSystems ISIS 3 programvare. De tre fargebilder med rød, grønn og blå ble kjøpt fra 15-20 meta. Kromosom ubalanser ble detektert på grunnlag av fluorescens-forholdet profilen, som avviker fra den balanserte verdi (FITC: rhodamin = 1). For hvert kromosom Endelig forhold verdiene ble fremstilt fra gjennomsnittsverdier for minst ti kromosom homologues fra separate metafase sprer seg. CGH resultatene ble plottet som en serie av grønt til rødt ratio profiler, og tolkning av resultatene fulgt tidligere beskrevet protokoller [3].
Fluorescens in situ hybridisering
FISH ble utført på kjerner og meta sprer av cellelinjer CWR22 og CWR22-RV1. Metafase sprer av lymfocytter fra en frisk donor ble benyttet som kontroll. Den BAC klone RP11-165H19 (9p13.3, GenBank tilgangsnummer AQ382511) ble hentet fra BacPac Resource Center, Children Hospital (Oakland Research Institute, Oakland, CA, USA) og cohybridized med en sonde spesifikk for cent av kromosom 9 (D9Z1; Oncor, Gaithersburg, MD, USA). Bakteriekulturer og DNA ble utført i henhold til BacPac Miniprep protokollen (https://www.biologia.uniba.it/rmc).
Alu
-PCR produkter av BAC ble brukt som prober og ble biotinylert bruker nick oversettelse. Tofargede fluorescens
in situ
hybridisering og påvisning av fluorescens-signaler ble utført som beskrevet tidligere [6].
Kvantitativ sanntid PCR
Kvantitativ sanntid PCR for genkopitallet målingen ble basert på en nylig beskrevne metode [27]. I den foreliggende studien brukte vi ferdige og godkjente SNP analyser (Applied Biosystems, CA, USA) med AB 7900 system (Applied Biosystems). For validering av 9p13.3 amplicon to gener innenfor amplicon (IL-11RA, AssayID: C__11340987_10 og DCTN3, AssayID: C__25472566_10) og et gen på på 3p24.2 ligger i et ikke endret region i prostatakreft (TOP2B, AssayID :. C__8063527_10) ble analysert
i et første trinn, alle SNP analysene brukt i denne studien ble kjørt på en fortynningsserie av normale blod-DNA for å bestemme PCR effektivitet (E) av hver primer angitt ved formelen E = 10
-1 /s, hvor s representerer den absolutte verdi av hellingen i et plott av terskelsyklusen (C
T) mot log av inngangs beløp. Alle primere ble vist å ha en lik virkningsgrad på ca. E = 2 og i relative effektivitet plott å sammenligne de forskjellige primere (log av inngangs mengde
vs.
A C
T) den absolutte verdi av hellingen var mindre enn 0,1. Relativ genkopitallet ble da beregnet etter equitation: 2
-ΔΔCT (Bruker bulletin # 2, Applied Biosystems). For kalibrering normale blod-DNA ble tilsatt i hver PCR-løp. For gener som har begge alleler som detekteres ved analysen C
T verdi ble subtrahert av en basert på den viste effektiviteten av 2. For å bestemme hvorvidt resultatene oppnådd av sanntids-PCR-analyse av prostatakreft prøvene var signifikant forskjellig fra de som ble oppnådd for prøver fra friske individer, bestemte vi et toleranseintervall (TI) for den relative gen kopiantall, ved hjelp av standardavviket (SD) av C
T-verdier for mål- og referanse gener i 8 friske individer i henhold til ligningen: TI = 2 ± (SDΔC
T x 2). TI varierte 1,62 til 3,17 for
DCTN3 Hotell og 1,77 til 2,94 for
IL11-RA
.
Resultater
Minimale tilbakevendende regioner av endringer
på grunn av deres høyt endret genomer og det store volumet av data som genereres av rekke analyser, enkel visuell inspeksjon av endret loci viste seg ineffektivt å identifisere minimal tilbakevendende regioner av aberrasjon. For å analysere datasettet, kombinert vi automatisk aberrasjon identifikasjon med en modifisert frekvensplott prosedyre. Anvendelse av vektet frekvensanalyse til autosomer av prostatakreft cellelinjer avdekket flere regioner av svært tilbakevendende endringer. I forhold til vår cCGH analyser flere små amplifikasjoner og slettings enheter ble bare detektert ved aCGH, spesielt i pericentromeric regioner og regioner i nærheten av telomerer (fig. 1). Størrelsen på de minste delene av aberrasjon kunne fastsettes til 110 kb for tap på 19q13.41 i cellelinjer DU145
NIH
, DU145-MN1, PC3 125-1L og CWR22-RV1, og 760 kb for gevinster ved 14q32.11-q32.12 i PC3
HOM
, PC3-N og PC3-125-1L. De fleste kromosomavvik som oppdages av cCGH ble også sett i aCGH. Men mer tap ble påvist med mikromatriser og flere store områder av gevinster med meta teknikk. For de som vanligvis oppdages regioner av avvik, ble ingen avvik mellom de to metodene å tildele gevinst eller tap for den enkelte region observert (tabell 1).
Et lite område av gevinst ved 9p nær Centromer (B, pilspiss) og en liten sletting på 14q (D, pilspiss) er bare oppdages ved arrayCGH.
Cytogenetisk konstitueringen av ulike grener av prostatakreftcellelinjer og foreldrecellelinje vs. underlinjen sammenligning
de aCGH resultatene av foreldrecellelinjer PC3
HOM
, DU145
HOM
, LNCaP og CWR22 og deres underlinjer er oppsummert i figur 2. for PC3 og DU145, kan to forskjellige grener sammenlignes (
HOM vs. NIH
). Mest utrolig, cytogenetisk konstitueringen av PC3
HOM
skilte seg markant fra PC3
NIH
. Fra totalt 54 avvik i begge cellelinjer, kunne bare seks sterke avvik finnes i vanlige: tap på 1Q, 8p, 10p og 13 og gevinster ved 10Q og VED BETJENING 17Q. Gevinsten av 8q11.2-8q24.3 i PC3
HOM
ble også observert i PC3
NIH
viser en minimal størrelse variant av 100 kb. For DU145
HOM Hotell og DU145
NIH
, en god samlet samstemmighet av den genetiske sammensetningen ble funnet.
Tall over tomten viser kromosomtall og vertikale linjer grensene mellom kromosomer.
Sammenligning av cellelinjer PC3
HOM
, DU145
HOM
, LNCaP og CWR22 med sin avledet underlinjer PC3 -N, PC3-125-1L, DU145-N, LNCaP-CN4-2 og CWR22-RV1, henholdsvis en høy kongruens av cytogenetisk avvik mellom de tilsvarende cellelinjer ble gitt av aCGH. Det er verdt å nevne at i tillegg mindre variasjoner i antall ekstra regioner med gevinster eller tap av genetisk materiale forskjeller mellom foreldrecellelinjer og underlinjer hovedsakelig gjaldt omfanget av tilsvarende regioner med kopi nummer endringer, som for eksempel ble observert for regionene med gevinster på 12q og 15Q i PC3
HOM vs.
PC3-N og for regionene med tap i 2Q, 4Q, 6Q og 13q21.33 i LNCaP
vs
. LNCaP-CN4-2.
Validering av den forsterkede pericentromeric regionen 9p13.3 hjelp FISH analyse og kvantitativ real time PCR
En roman 1,7 Mb region med kopitall gevinster ble konsekvent anerkjent i cellen linjer CWR22 og CWR22-RV1 og ble kartlagt til pericentromeric 9p13.3 underbånd. Tilstedeværelsen av dette fragment i den cellelinjer CWR22 og CWR22-RV1 ble bekreftet ved metafase FISH hjelp av en BAC-klon (RP11-165H19) fra den amplifiserte regionen og en probe som er spesifikk for cent av kromosom 9 (Fig. 3A og B). Optimal signal og mangel på kryss-hybridisering ble verifisert ved hjelp av normale metafase sprer (Fig. 3C). Dette BAC klone inneholdt to gener,
IL-11RA Hotell og
DCTN3
, som allerede var tenkt å spille en rolle i prostatakreft vekst [13].
Identifikasjon av økt kopier av signalene fra BAC-klon RP11-165H19 mappet til 9p13.3 amplikonet i cellelinje CWR22 og CWR22-RV1 (A og B). C Optimal signal og mangel på kryss-hybridisering ble verifisert ved hjelp av normal metafase marginene som viser to signaler for hver sonde. BAC klone RP11-165H19 signaler er grønne; røde signaler tyder på kromosom 9 cent (D9Z1).
Basert på genet lokalisering og kommentert gen-funksjon, har vi valgt disse to kandidatgener for genkopitallet målinger i prostatakreftcellelinjer og 20 primær prostata carcinom prøver ved hjelp av kvantitativ real time PCR.
IL-11RA
viste en signifikant økning i genkopitallet over normalen i CWR22 og CWR22-RV1 og i 15 av 20 (75%) primært prostatakreft tumorprøver (Fig. 4). For
DCTN3
ble ingen kopi nummer gevinst påvist i noen cellelinje og i bare 2 av de 20 (10%) prostatakreft tumorprøver. Kontrollen genet
TOP2B
3p24.2 ble bevist uendret i forhold til normal blod (data ikke vist).
IL-11RA
viste en signifikant økning i genkopitallet over normalen i CWR22, CWR22-RV1, DU145
HOM Hotell og DU145-MN1 og i 15 av de 20 (75%) prostatakreft prøvene. For
DCTN3
ble ingen kopi nummer gevinst påvist i noen cellelinje og i bare 2 av de 20 (10%) prostatakreft prøvene. Verdier over cut off line blir tildelt som økt genkopitallet i forhold til normalen.
Diskusjoner
Selv om prostatakreft cellelinjer har tidligere blitt analysert av aCGH utnytte cDNA microarray plattformer [12] [13], [15] – [20], viser vi i denne studien gjennomførbarheten av en longmer oligonukleotid sett, opprinnelig laget for uttrykk analyse, for en høy oppløsning genomisk profilering av ni prostata kreft cellelinjer. Microarray data for denne studien har blitt sendt til NCBI GEO med tiltredelse GSE7376. Sammenlignet med cCGH, vi har oppdaget flere slettinger og små regioner av gevinster med aCGH, spesielt i pericentromeric regioner og regioner ved telomerer, hvor cCGH er kjent for ikke å levere pålitelige opplysninger om DNA ubalanser. På den annen side ble store regioner av gevinster som åpenbart av cCGH som omfatter nesten hele armen av kromosom oversett av aCGH. Lignende observasjoner ble også rapportert av Saramaki et al. (2006) [13] med cDNA-baserte aCGH. Foruten normaliserings gjenstander kan man argumentere for at disse forskjellene kan resultere fra DNA amplifikeringstrinn for aCGH i vår studie, mens ikke-amplifiserte DNA ble brukt for cCGH. Selv hel-genom forsterkning av phi29 polymerase kan legge noen skjevhet og øke bakgrunnsstøy, anses det mest objektiv tilnærming i forhold til PCR-basert DNA amplifikasjonsprosedyrer [28]. Som enhver DNA amplifikeringstrinn virker uunngåelig i studiet av primær prostatakreft prøver, brukte vi en forsterkning skritt i vår studie, selv om DNA antallet var ikke en begrensende faktor når du arbeider med cellelinjer.
Våre aCGH funn er i god overensstemmelse med de data som er rapportert i litteraturen for PC3, DU145, LNCaP og CWR22 [12], [13], [15] – [20]. Men en interessant side aspekt ved vår studie er observasjon av en markert cytogenetisk forskjell mellom de to PC3 grener, som ble holdt i to forskjellige laboratorier (PC3
HOM vs.
PC3
NIH
). Den antatte genomisk ustabilitet i cellelinjer kan føre til genetisk uoverensstemmelse, hva som skal vurderes når man sammenligner resultatene fra forskjellige laboratorier på tilsynelatende samme cellelinjer. En kvalitet styringssystem, som inkluderer detaljer om den genetiske sammensetningen av de individuelt brukte cellelinjer, virker fornuftig.
Når det gjelder sammenligning av foreldrecellelinjer og underlinjer, ble det ikke brutto forskjeller i cytogenetisk sammensetningen funnet av aCGH. Forskjeller hovedsakelig opptatt av grensene for tilsvarende områder med kopi nummer endringer. Disse funnene er i motsetning til våre tidligere cCGH studier som viser flere ekstra regioner av DNA kopiantall endringer i underlinjer i forhold til foreldrecellelinjer [4]. En forklaring kan være tekniske, som tidligere rapportert forskjeller i hovedsak involverte store kromosomregioner, som er oppdaget med en lavere følsomhet ved aCGH forhold til cCGH, som ble omtalt ovenfor.
Som en validering av den høye oppløsningen på aCGH , vi videre analysert en liten forsterkningsenhet av 1,7 MB i pericentromeric region av kromosom 9 ved 9p13.3, som ble funnet i de xenograft-avledede cellelinjer og CWR22 CWR22-RV1 etter aCGH men ikke etter cCGH. Interessant, Saramaki et al. (2006) [13] syntes også dette område ved aCGH som skal forsterkes i prostata cancer xenograft LuCaP35. De bekreftet sine resultater etter BAC-FISH og demonstrert forsterkning og overekspresjon av ubiquitin-konjugering enzym genet E2R2 (
UBE2R2
), den dynactin 3 genet (
DCTN3
) og WD gjenta domene 40A gen (
WDR40A
) på 9p13.3. Ved hjelp av en sanntid PCR-teknikken, vi ytterligere tallkopiantallet av interleukin 11 receptor alpha-genet (
IL-11RA
) og dynactin 3-genet (
DCTN3
) begge avsløre den høyeste log2 forholdet i aCGH innen 9p13.3.
IL-11RA
ble funnet med høyest kopiantall gevinst i CWR22, CWR22-RV1, DU145
HOM Hotell og DU145MN1 tyder
IL-11RA
som den antatte målrette genet av dette fragment. Vi har derfor vist 20 primær prostatakreft prøver og fant 75% av svulstene huse en
IL-11RA
kopiantall gevinst alene, ingen av
DCTN3
alene, og 10% av både gener . Gjennomsnittlig kopi nummer gevinst for
IL-11RA
var omtrent 4 ganger. Disse dataene understreker vår første antagelse at
IL-11RA
representerer forsterkning målet i stedet for
DCTN3
. Denne hypotesen er ytterligere styrket ved immunhistokjemiske studier [29], [30] og kreft profilering database Oncomine ™ (www.oncomine.org) som både avdekker høy overekspresjon av
IL-11RA
i prostatakreft sammenlignet med normal prostatavevet.
IL-11RA
koder for en spesifikk reseptor for IL-11 og tilhører familien av gp130-avhengige cytokinreseptorer, som inkluderer reseptorer for IL-6, leukemiinhiberende faktor, ciliær neurotrofisk faktor, onkostatin M, og cardiotrophin [31]. En viktig signalsystem aktiveres av
IL-11RA Hotell og andre medlemmer av denne reseptoren familien er Janus kinase-signal svinger og aktivator av transkripsjon (Jak-STAT) sti med STAT3 å ha en godt studert betydning i prostata kreftutvikling [ ,,,0],32]. Videre er aktivert STAT3 antas å spille en nøkkelrolle i androgen reseptor aktivering i fravær av androgener, en forklaring av hormon ildfast veksten av prostata kreft [33]. Enten
IL-11RA
er utløsende i prostatakreft vekst må undersøkes i videre studier.
