Abstract
Bakgrunn
transkripsjonsfaktor Snail1 induserer epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), en prosess ansvarlig for kjøp av invasivitet under tumorigenesis. Flere transcriptomic studier har rapportert Snail1-regulerte gener i ulike celletyper, mange av dem er involvert i celle adhesjon. Imidlertid har bare noen få studier brukes proteomikk som et verktøy for karakterisering av proteiner som medierer EMT.
metodikk /hovedfunnene
Vi identifisert av proteomikk analyser ved hjelp av 2D-DIGE elektroforese kombinert med MALDI- TOF-TOF og ESI-lineær ion trap mass spectrometry en rekke proteiner med variable funksjoner hvis ekspresjon blir modulert ved Snail1 i SW480-ADH human colon cancerceller. Valideringen ble utført av Western blot og immunfluorescens analyser. Snail1 trykt flere medlemmer av 14-3-3 familien fosfoserin- /fosfotreoninmimetikumet bindende proteiner og også uttrykk for Proliferation-assosiert protein 2G4 (PA2G4) som var hovedsakelig lokalisert på atom Cajal organer. I motsetning til ekspresjonen av to proteiner involvert i RNA prosessering, spaltingen og polyadenylerings-spesifisitet faktor subenheten 6 (CPSF6) og skjøting faktor prolin /glutamin-rike (SFPQ), var høyere i Snail1-uttrykkende celler enn i kontrollene. Reguleringen av 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ og PA2G4 av Snail1 ble gjengitt i HT29 tykktarmskreftceller. I tillegg fant vi en invers korrelasjon mellom 14-3-3σ og Snail1 uttrykk i menneskelige kolorektal tumorer.
Konklusjon /Betydning
Vi har identifisert et sett av nye Snail1 target proteiner i tykktarmskreft som utvider de cellulære prosessene som påvirkes av Snail1 og dermed dens relevans for cellefunksjon og fenotype
Citation. Larriba MJ, Casado-Vela J, Pendas-Franco N, Peña R, García de Herreros A, Berciano MT, et al. (2010) Nye Snail1 Target Proteiner i Menneskelig Colon Cancer Identifisert av proteomikk-analyse. PLoS ONE 5 (4): e10221. doi: 10,1371 /journal.pone.0010221
Redaktør: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Spania
mottatt: 04.03.2010; Godkjent: 26 mars 2010; Publisert: 20 april 2010
Copyright: © 2010 Larriba et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Ciencia e Innovación av Spania (SAF2007-60341, BIO2006-07689, ISCIII-Retic- RD06 /0020/0009 og RD06 /0020/0040), Comunidad de Madrid (S-GEN-0266/2006) og European Union (MRTN-CT-2005-019496, NucSys). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
transkripsjonsfaktor Snail1 regulerer biologi av fibroblaster og dens oppregulering i epitelceller fører til en endring i en mesenchymatic fenotype, en prosess som kalles epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT). Dette er en transdifferensiering skifte i hvilken epitelceller mister klebrighet og polaritet og erverve spindelen morfologi og migrerende evne karakteristisk for fibroblaster som et resultat av en drastisk forandring i gen-ekspresjon profil [1], [2]. EMT spiller viktige fysiologiske roller under embryogenese og sårheling, og er også avgjørende for kjøpet av tumor invasivitet, [1], [2].
Snail1 vises det første trinnet av metastatisk kaskade i kreft for å ha en hoved~~POS=TRUNC rolle i EMT, selv om flere andre faktorer som Snail2 (Slug), Zeb1 (δEF1), Zeb2 (Sip1), Twist1, E47 og E2-2 er også kjent for å indusere eller bidra til EMT i ulike typer celler [2 ], [3]. Disse faktorer fremmer delvis forskjellige genekspresjonsprofiler som har til felles undertrykkelsen av gener som koder for adhesjonsproteiner (E-cadherin, Occludin og flere Claudins) og induksjon av mesenchymale markører slik som vimentin, Fibronectin, og proteaser og faktorer som fremmer cellebevegelse [ ,,,0],3], [4]. Snail1 var den første karakterisert repressoren for invasjonen suppressor genet
CDH1
som koder for de avgjørende bindingsproteinet, E-cadherin [5], [6]. I tillegg har Snail1 nylig blitt vist å aktivere Wnt /β-catenin signalering og Nukleær faktor
kappa
B-aktivitet [7], [8], og det opphever inhibering av Wnt /β-catenin reaksjonsvei som skyldes den antitumorforbindelsen 1α, 25-dihydroksyvitamin D
3 [9].
Snail1 blir oppregulert i flere humane kreftformer, og er ofte forbundet med invasivitet, metastase og dårlig prognose [3]. Snail1 RNA ikke påvises i normal tykktarmsslimhinne, men det blir oppregulert i 60-70% av kolon-kreft [10] – [12]. En fersk studie har vist at Snail1 protein er uttrykt i 79% av tykktarmskreft, vanligvis i svulsten-stroma inter. Snail1 er funnet i både de epiteliale tumorvev og tilstøtende stroma i 56% av tykktarmskreft, mens i 21% av tilfellene er det bare til stede i stromale celler med fenotype fibroblastisk [13].
En rekke studier har fokusert på transcriptomic analyse av EMT fremmes av Snail1 og andre transkripsjonsfaktorer, eller av gener eller midler slik som onkogene Ras eller transformerende vekstfaktor β som induserte dem [4], [14] – [17]. Imidlertid har bare noen få studier brukes proteomikk som et verktøy for karakterisering av proteiner medier EMT [18]. De fleste av disse studiene har anvendt 2D-PAGE etterfulgt av MALDI-TOF-massespektrometri for å identifisere proteiner som differensielt-uttrykt i tumorvev og /eller cellelinjer [18] – [20]. Noen få studier har brukt iTRAQ teknologien, etterfulgt av 2D-LC-separasjon av peptider og massespektrometri [18], [21], [22]. Her har vi brukt 2D-DIGE teknologi fulgt av MALDI-TOF-TOF og ESI-lineær ionefelle massespektrometri. Den kombinasjon av disse teknikker er en mer følsom og pålitelig metode for identifikasjon av små forskjeller i proteinekspresjon mellom humane tarmkreftceller med lave eller høye nivåer av Snail1. Disse teknikkene har gitt oss muligheten til å ta en dypere innsikt i proteomikk endringer knyttet til Snail1 overekspresjon. I denne studien har vi identifisert en rekke proteiner tidligere ukjente som Snail1 mål i menneskelige tykktarmskreftceller. Noen av dem er involvert i kontroll av celle genekspresjon og fenotype, og er sannsynlige formidlere av den tumorigent handlingen av Snail1.
Resultater
De fleste gener tidligere karakterisert som reguleres av Snail1 kode plasmamembranen proteiner involvert i celle adhesjon eller cytoskeletal komponenter. For å utvide vår kunnskap om Snail1 effekter i mennesketykktarmskreft, ansatt vi en integrerende strategi for å identifisere kjerneproteiner regulert av Snail1 i denne neoplasi (figur 1A). Vi brukte 2D-DIGE elektroforese kombinert med MALDI-TOF-TOF og ESI-lineær ionefelle massespektrometri å sammenligne mønsteret av proteiner tilstede i kjernefysiske ekstrakter fra menneskelige tykktarmskreft SW480-ADH celler som uttrykker et retroviralt-omsatte Snail1 cDNA (Snail1 celler) med den av mock-infiserte celler (mock celler). En undergruppe av de identifiserte proteinene ble validert av Western blot og immunfluorescens analyser av menneskelige tykktarmskreftceller, og ved immunhistokjemi av menneskelige tykktarmskreft biopsier. Vi har tidligere karakterisert mobil modellen som brukes i denne studien [7], [10] og fant at Snail1 overekspresjon fremmet anskaffelse av en mer stel celle morfologi (figur 1B), undertrykkelse av de epiteliale markører E-cadherin, Occludin og claudin -7, og induksjonen av mesenchymale protein Lef-1 (figur 1C).
(A) Reaksjonsskjema av arbeidsflyten som følges i denne studien. (B) Representative fase-kontrast mikrografer (øvre paneler) og confocal laser immunofluorescence bilder som viser F-aktin farging (nedre paneler) av SW480-ADH Mock og Snail1 celler. Scale bar, 20 mikrometer (øverste panelene) og 10 mikrometer (nedre paneler). (C) Western blot-analyse av hel-celle-ekstrakter fra SW480-ADH Mock og Snail1 celler som viser Snail1 overekspresjon og dens effekt på ekspresjonen av epitel (E-cadherin, Occludin og claudin-7) og mesenchymale (Lef-1) markører. β-Tubulin ble brukt som en lasting kontroll.
Differensial protein uttrykk analyse av kjernefysiske fraksjoner fra menneskelige tykktarmskreftceller med høy eller lav Snail1 uttrykk
Nuclear utdrag fra SW480-ADH Mock og Snail1 celler ble analysert ved 2D-DIGE som beskrevet i materialer og metoder. Protein mønster endringer ble kvantitativt og statistisk analysert ved hjelp av DeCyder programvaren v.6.5 vurderer de 12 stikk kart inkludert i studien. Figur 2 viser et representativt 2D-kart av atom SW480-ADH proteiner. Hver gel ble analysert individuelt for å beregne volumforhold mellom de enkelte prøver og det indre basseng, som ble brukt som standard referanse. Deretter ble alle bildene kombinert og analysert sammen ved hjelp av BVA modulen. Det ble ikke observert noen variasjoner i protein overflod mellom Mock og Snail1 celler. En paret
t
-test ble brukt til å velge 22 plassene som uttrykk variasjon mellom begge celletypene var statistisk signifikant (Student
t
-test,
p
0,05) . Disse stedene ble valgt som steder av interesse og kommentert på master gel (figur 2). Protein identifikasjon ble utført av to metoder: (1) peptid mass fingerprinting bruker MALDI-TOF-TOF og (2) ESI-lineær ionefelle og MS /MS peptid-sekvensering (påføring av en restriktiv falsk positiv funnrate (FDR) cut-off, FDR≤1%). I begge tilfeller, identifikasjon med mer enn ett peptid var nødvendig. Ved å bruke denne doble tilnærmingen, ble 19 proteiner identifisert i 17 av 22 plasser (tabell 1). Bare fem proteiner ble identifisert ved MALDI-TOF-TOF på grunn av de lave nivåer av ekspresjon. Atten proteiner ble identifisert ved ESI-lineær ionefelle, med to flekker som inneholder mer enn ett protein. I disse tilfellene ble proteinene oppført i henhold til antall identifiserte peptider. Fire proteiner ble identifisert ved begge teknikkene (tabell 1).
Nuclear utdrag fra SW480-ADH Mock og Snail1 celler ble ulikt merket med Cy3 og Cy5 fargestoffer. En intern standard kombinere proteiner fra begge ekstrakter ble inkludert i alle geler etter merking med Cy2 fargestoff. 3-10 NL IPG strips ble brukt til IEF og standard SDS-PAGE for andre dimensjonen. Representative 2D-bilde viser sted kartet som tilsvarer den interne standarden, som er felles for alle geler analysert. Flekker som er merket med piler var informativt for protein identifikasjon ved massespektrometri (se tabell 1 for kode oppdrag). Utvalgte flekker viste en statistisk varians av volumforholdene innen den 95. sikkerhetsnivå (Student
t
-test,
p
0,05).
protein ontologi analyse av identifiserte proteiner
Blant de proteinene endret av Snail1 overekspresjon vi identifiserte α-catenin (CTNNA1), den PI3K regulatoriske subenhet α (PIK3R1), Caldesmon (CALD1), spalting og polyadenylerings spesifisitet faktor subenheten 6 (CPSF6), og vimentin (VIM) som oppregulert proteiner; og Proliferation-assosiert protein 2G4 (PA2G4, også kjent som ErbB3-bindende protein eller en EBP1), Ran-spesifikk GTPase-aktivert protein (RANBP1), og flere medlemmer av 14-3-3 proteinfamilie (YWHAE, YWHAH og YWHAQ ) blant de downregulated proteiner (tabell 1). Til tross for arbeidet med atom ekstrakter, bare 7 av 19 proteiner ble tildelt atomrommet (CPSF6, WTAP, ENO1, PA2G4, HNRNPH3, RANBP1 og PPIA), mens de resterende var fortrinnsvis cytosolic eller assosiert til cytoskjelettet. Men vi kan ikke forkaste at sistnevnte proteiner var delvis eller midlertidig oppholder seg i atomrommet. Når det gjelder biologisk funksjon, ble flere proteiner involvert i celle adhesjon (CTNNA1) eller komponenter av cytoskjelettet (CALD1, VIM og LASP1). Men de fleste av proteiner ble innblandet i signaltransduksjon (PI3KR1, RANBP1 og 14-3-3 familiemedlemmer) og RNA prosessering (CPSF6, WTAP og HNRNPH3) (tabell 1). Noen av disse proteiner ble valgt for validering. Gitt den høye homologi eksisterende blant 14-3-3 proteiner og mellom noen av de identifiserte peptider (dvs. -VISSIEQK- for 14-3-3τ og -VLSSIEQK- for 14-3-3σ, noe som gjør dem nesten umulig å skille), vi bestemte seg for å inkludere alle medlemmer av familien i valideringen analyser.
Validering av kandidat target proteiner
for en kvantitativ estimering av uttrykket av kandidat target proteiner i SW480-ADH Mock og Snail1 celler, analyserte vi ved Western blot tre kjernefysiske ekstrakter fremstilt uavhengig (N1, N2, N3). I tillegg ble de cytosoliske ekstrakter fra et av forsøkene (C1) som er inkludert i analysen (figur 3A). Variabel nedregulering (20% til 70%) av 14-3-3 β, ε, σ, x og f-proteiner ble funnet i kjernen av Snail1 celler. For dem alle, unntatt 14-3-3σ den nedregulering var svakere i cytosol enn i kjernen (figur 3A). Vi har ikke kunnet avgjøre 14-3-3η uttrykk verken i kjernen eller i cytosol, mens det av 14-3-3γ var upåvirket av Snail1 overekspresjon (data ikke vist). PA2G4 ekspresjon var også lavere i både kjernen og cytosol av SW480-ADH Snail1 enn i Mock-celler (figur 3A).
(A) Western blot analyse av ekspresjonen av utvalgte proteiner i cytosol (C) og kjerne ( N) ekstrakter av SW480-ADH Mock og Snail1 celler. HNRNPH3 isoformer (1-4) er indikert. Tallene under gels indikere kvantifisering av endring i uttrykket mellom Snail1 og Mock celler etter normalisering p-Tubulin eller Lamin B (cytosoliske og atom kontroll, henholdsvis). Den statistiske betydningen av kjernefysiske uttrykk endringer som fremmes av Snail1 ble vurdert av to-tailed uparede Student
t
-test. Det var
p
0,001 for 14-3-3ε, 14-3-3σ, 14-3-3ζ, CPSF6 og isoformene 3 og 4 i HNRNPH3;
p
0,01 for 14-3-3τ; og
p
0,05 for 14-3-3β og PA2G4. Reguleringen av SFPQ (
p
= 0,057), og at av isoformene 1 + 2 av HNRNPH3 (
p
= 0,058) ikke nådde statistisk signifikans, men en klar tendens ble observert. (B) Western blot analyse av ekspresjonen av utvalgte proteiner i cytosol (C) og kjerne (N) brøkdeler av HT29 Mock og Snail1 celler. Tallene under gels indikere kvantifisering av endring i uttrykket mellom Snail1 og Mock celler etter normalisering p-Tubulin eller Lamin B (cytosoliske og atom kontroll, henholdsvis). (C) Kvantitativ RT-PCR studie av PA2G4 uttrykk i SW480-ADH og HT29 Mock og Snail1 celler. 18S rRNA-ekspresjon ble anvendt for normalisering. Statistisk signifikans ble vurdert av to-tailed uparede Student
t
-test, indikerer enkelt stjerne
p
. 0,05
I motsetning nivået CPSF6 var høyere i Snail1 celler enn i Mock celler (figur 3A). Vi har også analysert uttrykk for skjøting faktor prolin /glutamin-rike (SFPQ), et protein som finnes 1,59-ganger oppregulert i proteomikk analyse, men fraværende fra tabell 1 fordi det ble bare identifisert med en peptid på plass 609. Vi gjorde så fordi både SFPQ og CPSF6 er involvert i pre-mRNA prosessering og lokalisert i kjernekraft paraspeckles [23], noe som antyder en mulig koordinert virkning av Snail1. Faktisk fant vi at Snail1 økt atom SFPQ uttrykk og også det lave nivået av SFPQ oppdaget i cytosol (figur 3A).
Reguleringen av Snail1 ble komplekset i tilfelle av heterogene kjernefysiske ribonucleoprotein H3 (HNRNPH3) som presenterer flere isoformer resultat av alternativ spleising [24]. Peptidene som anvendes i proteomikk studie for å identifisere HNRNPH3 indikere at downregulated stedet kan kun tilsvare isoformer 1, 2 eller 3. Analysen av Western blot viste at ekspresjon av isoformer 1 og 2 (forutsagte MW 36,9 og 35,2 kDa, respektivt) ble oppregulert ved Snail1, mens det av isoformer 3 og 4 (forutsagte MW 31,5 og 22,3 kDa, respektivt) ble sterkt nedregulert i både kjernen og cytosol av Snail1-celler (figur 3A). Derfor må proteinet identifisert i proteomikk analyse være isoform 3 av HNRNPH3.
undertrykkelse av 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ og PA2G4 av Snail1 i atom ekstrakter ble gjengitt i to uavhengige forsøk i en annen human koloncancer cellelinje, HT29 (figur 3B). I tillegg kvantitativ RT-PCR-analyse avdekket et redusert nivå av PA2G4 RNA i både SW480-ADH og HT29 celler som uttrykker Snail1 i forhold til sine respektive Mock celler (Figur 3C).
subcellulære fordeling av Snail1 target proteiner
ekspresjonen av noen av de Snail1 målproteinene validert ved Western blot ble ytterligere undersøkt ved immunfluorescens og konfokal mikroskopi-analyser. Som vist i figur 4, nivået av 14-3-3 β, ε og σ var mye lavere i både kjernen og cytosol av SW480-ADH Snail1 celler enn i Mock celler. I alle tre tilfeller ekspresjon var høyere i cytosol enn i kjernen med et variabelt forhold: β σ ε. Immunofluorescensanalyse viste også en reduksjon av både kjernekraft og cytosolic uttrykk for PA2G4 i Snail1 celler sammenlignet med Mock celler (figur 5A). Ekspresjonen av PA2G4 hadde en fin punktformet mønster i både kjernen og cytosol, og var spesielt kraftig i noen få runde og skarpt definerte kjerne foci på omtrent 0,5 mikrometer i diameter (figur 5). Double flekker ved hjelp av antistoffer mot Coilin (markør for Cajal organer), TMG-cap av spliceosomal snRNAer (markør for Cajal organer og atom flekker av skjøte faktorer), Fibrillarin (markør for kjerne) og PML (markør for PML organer) indikerte at PA2G4-positive atom foci tilsvare Cajal organer (Figur 5B). Dette resultatet ble bekreftet i nerveceller (data ikke vist), celletypen hvor Cajal legemene er mest fremtredende [25]. Den beste forstått funksjon Cajal kropper er biogenesis av små atom og nukleolære RNPs (snRNPer, snoRNPs) involvert i pre-mRNA spleising og pre-rRNA behandling, henholdsvis [25], [26]. Den doble fargings Forsøkene viste også en svak farging av PA2G4 i kjerne (se figur 5B, PA2G4 og Fibrillarin co-farging), slik det er tidligere beskrevet [27].
Representative konfokal mikroskopi bilder som viser ekspresjonen og lokalisering av 14-3-3 β, ε og σ (rød) i SW480-ADH Mock og Snail1 celler. GFP uttrykk (grønn) var uendret ved Snail1 og ble brukt som en kontroll. Scale bar, 10 mikrometer.
(A) Representative konfokal mikroskopi bilder viser uttrykket og lokalisering av PA2G4 (rød) i SW480-ADH Mock og Snail1 celler. GFP uttrykk (grønn) var uendret ved Snail1 og ble brukt som en kontroll. Scale bar, fem mikrometer. (B) Representative Konfokalmikroskopi bilder som viser dobbelt immunolabeling for PA2G4 (rød) og for molekylære markører (blå) av Cajal organer (Coilin), Cajal organer og atom flekker av spleise faktorer (TMG-cap), kjerne (Fibrillarin) og PML organer (PML) i SW480-ADH Mock celler. Den rosa fargen i flette bildene indikerer eksistensen av colocalization. Scale bar, fem mikrometer.
Analyse av menneskelige colontumorer
undertrykkelse av flere 14-3-3 familiemedlemmer av en tumor-assosiert transkripsjonsfaktor som Snail1 bedt oss å studere ekspresjon av disse proteiner i human tykktarmskreft. Som 14-3-3σ var medlem som uttrykket ble sterkere trykt av Snail1 både i kjernen og i cytosol, vi valgte det for studien på humane prøver. Først, analyserte vi 14-3-3σ ekspresjon av immunhistokjemi i en vevet matrise inneholdende sammenkoblet normale og tumorprøver fra 46 pasienter med kolorektal kreft, og fant at 14-3-3σ ble sterkt uttrykt ved både normale og tumor epitelceller men ikke av stromal celler (Figur 6A). Ettersom dette uttrykket mønster av 14-3-3σ var samstemt med sin undertrykkelse av en induktor av EMT slike oss Snail1, bestemte vi oss for å utføre en mer detaljert studie av 14-3-3σ og Snail1 uttrykk i påfølgende skiver av fem tykktarmskreft biopsier. I overensstemmelse med tidligere studier [13], vi hovedsakelig finnes Snail1 immunoreaktivitet i cellekjernen med mesenchymale fenotype i tumoren (figur 6B). Disse cellene kan tilsvare tumor epitelceller som har gjennomgått EMT og /eller fibroblaster som er blitt aktivert av svulsten mikromiljøet [13]. Følgelig med data innhentet fra vevet matrise, ble 14-3-3σ uttrykt i både kjernen og cytosol av tumor epitelceller, men det var fraværende i stromale celler (Figur 6B). Derfor 14-3-3σ og Snail1 har motsatt uttrykk mønstre (epitel og stromal, henholdsvis) i tykktarmskreft. I tillegg 14-3-3σ uttrykk ligner den for Snail1 målgen
CDH1
/E-cadherin og, som foreslått for dette genet, er det mulig at Snail1 undertrykker 14-3-3σ ekspresjon i mesenchymale celler.
(A) immunhistokjemi bilder som viser 14-3-3σ uttrykk i representative normal og tumor kolon prøver av 46 analysert i vevet matrisen. Linjene indikerer forstørrelse. Seksjoner ble kontra med haematoxylin. (B) immunhistokjemi bilder som viser 14-3-3σ og Snail1 uttrykk i to påfølgende skiver av en representant tykktarmskreft svulst i fem analysert. Linjene indikerer forstørrelse. Seksjoner ble kontra med haematoxylin. Høyre paneler er en 3X-forstørrelse av regionen angitt i venstre panel.
Diskusjoner
Identifisere proteiner regulert av Snail1 utvider dagens kunnskap om biologien til denne transkripsjonsfaktor og kaster nytt lys på mekanismene for EMT og kreft progresjon. Vi valgte tykktarmskreft som et fungerende system fordi Snail1 oppreguleres ved både RNA og proteinnivå i denne neoplasi og bidrar til dens gnise [10] – [13]. Tidligere var det genekspresjonsprofiler indusert av Snail1 i ulike systemer blitt studert av transcriptomic analyser, og de fleste av de Snail1 målgener identifiserte kodet for proteiner som er involvert i cellulær adhesjon, ekstracellulær matriks og cytoskjelettet [4], [15], [28] . I denne studien utførte vi en proteomikk analyse av kjernefysiske ekstrakter som mål å identifisere nye proteinene regulert av Snail1 som kunne megle sine brede effekter på cellefysiologi og fenotype.
Vår studie viser en bemerkelsesverdig bevaring i det globale mønster av atom protein uttrykk i humane tykktarmskreftceller som uttrykker høye eller lave nivåer av Snail1. Likevel, en rekke tidligere uncharacterized Snail1 regulerte proteiner involvert i ulike cellefunksjoner har blitt identifisert. Tjueto flekker ble funnet som betydelig deregulert mellom begge celletyper med en
p
0,05 (Student
t
-test). Nitten forskjellige proteiner ble identifisert, de fleste av dem ved hjelp av ESI-lineære ionefelle instrument i kombinasjon med et nano-HPLC. Bare fem proteiner ble identifisert ved MALDI-TOF-TOF, sannsynligvis på grunn av den lave ekspresjon av proteiner tilstede i flekker. To flekker (1419 og 1926) inneholdt mer enn ett protein. Men i stedet 1419, vimentin var signifikant mer rikelig (basert på antall identifiserte peptider) enn de andre proteinene og vi tilordnet det forskjeller i ekspresjon. I flekk 1926, antallet identifiserte peptider var ganske lik mellom LASP1 og HNRNPH3, noe som gjør det vanskeligere utvisning av den differensielle ekspresjonen.
Våre resultater er enig med den transkripsjonelle repressoren rolle Snail1, som i 12 ut av 17 flekker med identifiserte proteiner uttrykket var lavere i Snail1-uttrykke celler enn i Mock celler, mens bare fem av dem uttrykket var høyere i Snail1 celler. Den undertrykkelse av de downregulated proteinene kan være en direkte effekt av Snail1, særlig i tilfelle av PA2G4 hvis RNA-nivået ble også redusert med Snail1. I motsetning til dette må den induksjon av proteinekspresjon ved Snail1 være indirekte, mediert av andre transkripsjonsfaktorer, som det har blitt rapportert for matriks-metallproteaser 2 og 9 [29], [30]. I tillegg fant vi at Snail1 endrer spleising mønster av HNRNPH3 i SW480-ADH celler. Dette er i tråd med studier som beskriver at Snail1 endrer mønsteret for skjøting av P120-catenin og
Zonula okkludens
-1 av uncharacterized mekanismer [31], [32].
Etter avtale med forrige transcriptomic studier, viser vi her at Snail1 forandrer uttrykket av proteiner involvert i celle adhesjon og cytoskjelettet (CTNNA1, CALD1, VIM og LASP1). I tillegg, og så vidt vi vet for første gang, rapporterer vi at Snail1 regulerer proteiner involvert i andre cellulære funksjoner som RNA modning (CPSF6, HNRNPH3 og SFPQ) og intracellulær signalering (PI3KR1, RANBP1 og 14-3-3 protein familie). Den nesten generelle undertrykkende effekt av Snail1 på ekspresjon av 14-3-3 familiemedlemmer er overraskende, og stemmer overens med den nylig foreslått kreft-beskyttende rolle av visse av disse proteiner [33], [34]. De 14-3-3 proteiner har lenge vært kjent som fosfoserin /fosfotreoninmimetikumet bindende proteiner i stand til å binde og modulere interaksjonen mellom proteinene og som er involvert i celleprosesser som signalering, cellesykluskontroll, apoptose, intracellulær handel, cytoskeletal struktur og transkripsjon [34 ], [35]. Bare i de siste årene har flere 14-3-3 familiemedlemmer har vært knyttet til en rekke kreft prosesser. Mens 14-3-3σ har blitt foreslått som en tumor suppressor gen som er forstummet eller inaktiveres under utviklingen av melanom og bryst, mage, hepatocellulær, eggstokkreft og plateepitelkarsinom [33], [36] – [40]; Det har blitt funnet overuttrykt i bukspyttkjertelkreft [41]. I tillegg er en proteomikk analyse viste at 14-3-3σ ekspresjon nedregulert i invasive overgangscelle karsinomer i urinblæren gjennomgår EMT [19]. Dette er i samsvar med våre data fra humane tykktarmskreft biopsier som viser en motsatt uttrykk mønster av 14-3-3σ og Snail1. Spesielt, kan 14-3-3 ε, ζ og η danne en trefoldig kompleks med Chibby og β-catenin tilrettelegging atom eksport av β-catenin, og dermed motvirke sin transkripsjonen aktivitet som er en viktig driver i tykktarm kreft [42]. Derimot har samarbeider 14-3-3ζ med ErbB2 å fremme EMT og progresjon av duktale brystcarsinomer til invasiv kreft [43], og dets overekspresjon forbinder med brystkreft [44]. I denne studien har vi identifisert 14-3-3 β, ε, σ, τ og ζ som nedregulert etter Snail1 uttrykk i menneskelige tykktarmskreftceller. Virkningen av 14-3-3 proteinene kan moduleres ved interaksjon med forskjellige partnere i et romlig og tidsmessig måte, og også blir utsatt for regulering av fosforylering. Derfor kan den samme 14-3-3 familiemedlem har flere, og til og med motsatte roller noe som gjør analyse av effekten av individuelle 14-3-3 proteiner meget komplekse og avhengig av integrering av tilleggssignaler [45]. Derfor er det vanskelig å forutsi den rolle disse proteinene i Snail1 aksjon i tykktarmskreft, som kan være relatert til mutasjoner som typisk er tilstede i denne neoplasi.
Vi fant at Snail1 undertrykker også PA2G4 ekspresjon i humane tykktarmskreft celler. Dette proteinet reagerer med det cytoplasmatiske domene av reseptoren ErbB3 downregulating ErbB signaltransduksjon og demping av heregulin drevet vekst av brystkreftceller [46], [47]. PA2G4 ligger ikke bare i cytosol, men også i kjernen hvor den oppfører seg som en pleiotropisk protein som interagerer med en rekke proteiner og RNA som er involvert i regulering av transkripsjonen og translasjonen kontroll [48], [49]. Således hemmer PA2G4 E2F1- og androgen reseptor-mediert transkripsjon gjennom dets interaksjon med retinoblastom protein, androgen reseptor, flere histoner deacetylases og Sin3A [50] – [53]. Lokalisering av PA2G4 i Cajal organer som vi nå har rapportert tyder på at dette multifunksjonelle protein er også involvert i modningen av snRNA og snoRNA. Videre induserer PA2G4 overekspresjon differensiering av humane brystcancerceller [54], inhiberer proliferasjon av humane fibroblaster, og undertrykker vekst og metastasering av spytt Adenoid cystiske carcinoma celler [55]. Fra alle disse studiene er det tenkelig at PA2G4 undertrykkelse kan bidra til den tumorgene virkningen av Snail1.
Interessant Snail1 oppregulerer ekspresjonen av CPSF6 og SFPQ proteiner involvert i RNA-polyadenylering og spleising, henholdsvis [56], [57 ]. Begge proteiner har nylig blitt funnet å være til stede i paraspeckles, en subnuclear kupé foreslått å være stedet for pre-mRNA prosessering og retensjon [23]. Av notatet, både CPSF6 og SFPQ er fusjonspartnere for tyrosin kinaser i hematologisk kreft [58]. Snail1 endrer også skjøting mønster av HNRNPH3, et annet protein som er involvert i spleiseprosessen [24]. Intriguingly de HNRNPH3 isoformene indusert av Snail1 inneholder to kopier av et RNA-bindende domene (RNA gjenkjennelse motiv) som vanligvis finnes i proteiner som binder enkeltkjedet RNA, mens disse isoformer trykt ved Snail1 inneholde bare en [24]. Imidlertid er den funksjonelle konsekvens av denne forskjell er ukjent. Derfor vår studie viser at Snail1 kan modulere flere trinn i RNA modning, slik som polyadenylering og skjøting, og så mRNA stabilitet og oversettelse. Til sammen tyder disse data på at i tillegg til sin anerkjent transkripsjon undertrykkelse aktivitet, kan Snail1 regulere genekspresjon post-transkripsjonelt ved å modulere nivå av proteiner involvert i pre-mRNA prosessering og plassering.
Som konklusjon, våre funn implisere Snail1 som en regulator av tidligere uforutsette cellefunksjoner i tillegg til intercellulær adhesjon og cellemorfologi. Den inngående studie av virkningsmekanismer av de nylig identifiserte Snail1 target proteiner vil bidra til å definere presist komplekse biologiske aktiviteten til Snail1 og så innsikt av prosessen med EMT under embryogenese og tumorigenesis.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av etisk komité for Instituto de Salud Carlos III (Madrid, Spania) og Etisk Komité for klinisk forskning av Institut Municipal d’Assistência Sanitaria (Barcelona, Spania). Alle pasienter forutsatt skriftlig informert samtykke til uttak av prøver og påfølgende analyse.
Cell kultur
SW480-ADH og HT29 menneskelige kolon kreftceller stabilt uttrykker Snail1 (Snail1 celler) eller en tom vektor ( mock celler) ble generert ved retroviral transduksjon hjelp PRV-Snail1-IRES-GFP (Snail1 celler) eller PRV-IRES-GFP (mock-celler) vektorer som vi tidligere har rapportert [10].
