Abstract
Overbevisende bevis har antydet at høy mobilitet gruppe box-en (HMGB1) genet spiller en avgjørende rolle i kreftutvikling og progresjon. Denne studien forsøkte å evaluere effektene av enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i
HMGB1
genet på overlevelsen av magekreft (GC) pasienter. Tre tag SNPs fra
HMGB1
genet ble valgt og genotypet ved hjelp Sequenom Ipex genotyping system i en kohort av 1030 GC pasienter (704 i treningssettet, 326 i valideringssettet). Multivariat Cox proporsjonal risikomodell og Kaplan-Meier kurve ble brukt til prognosen analyse. AG /AA genotyper av SNP rs1045411 i
HMGB1
genet var signifikant assosiert med bedre total overlevelse (OS) i et sett med 704 GC pasienter sammenlignet med GG genotyper (HR = 0,77, 95% CI: 0.60-0.97
P
= 0,032). Dette prognostisk effekten ble bekreftet i en uavhengig validering sett og samlet analyse (HR = 0,80, 95% KI: 0,62 til 0,99,
P
= 0,046; HR = 0,78, 95% KI: 0,55 til 0,98,
P
= 0,043, henholdsvis). I lagdelt analyse, den beskyttende effekten av rs1045411 AG /AA genotyper var mer fremtredende hos pasienter med uønskede strata, sammenlignet med pasienter med gunstig strata. Videre ble sterke felles prediktive effekter på OS fra GC pasienter bemerket mellom rs1045411 genotyper og Lauren klassifisering, differensiering, scene eller adjuvant kjemoterapi. I tillegg funksjonell analyse indikerte en signifikant effekt av rs1045411 på
HMGB1
uttrykk. Våre resultater tyder på at rs1045411 i
HMGB1
er signifikant assosiert med kliniske utfall av kinesiske GC pasienter etter operasjonen, særlig hos pasienter med aggressiv status, noe som tilsier ytterligere validering i andre etniske populasjoner
Citation.: Bao G, Qu F, Han L, Zhao H, Wang N, Ji G, et al. (2016) Prognostic Betydningen av Tag SNP rs1045411 i
HMGB1
av Aggressive Gastric Cancer i en kinesisk befolkning. PLoS ONE 11 (4): e0154378. doi: 10,1371 /journal.pone.0154378
Redaktør: Qing-Yi Wei, Duke Cancer Institute, USA
mottatt: 23 januar 2016; Godkjent: 12 april 2016; Publisert: 26 april 2016
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:.. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr 81272201 og nr 81572916 GB, No. 81200330 til NW)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
. introduksjon til
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste kreftformen i verden, med om lag 8% av nye krefttilfeller og 10% av kreftdødsfall [1]. Av disse tilfellene forekom 70% i utviklingsland, og halvparten av verdens totale skjedde i Øst-Asia, hovedsakelig i Kina [2]. I løpet av de siste tiårene, til tross for betydelig økning i investeringer og fremskritt i diagnostikk og behandling av GC total overlevelse (OS) for avansert GC er fortsatt dystert, med en 5-års overlevelse på mindre enn 25% [3 ]. Foreløpig overlevelse og prognose av GC pasienter fortsatt avhengig av scenen av svulsten ved diagnosetidspunktet. Imidlertid, på grunn av de klart viktige forskjeller innenfor samme trinn, er tumorstadium alene ikke er tilstrekkelig til å forutsi den prognose av GC [4]. Derfor, for å oppdage nye molekylære signaturer som pålitelige prognostiske markører for GC er svært viktig og krevende. I de senere årene, har studier fokusert på etterforskningen av genetiske varianter som disponerer for utvikling og progresjon av GC [5].
Høy mobilitet gruppe box-en (HMGB1), et viktig medlem av høy mobilitet gruppe protein-superfamilien, inneholder to 80-aminosyre DNA-bindende domener (A-boks og B-boks) og en sur karboksylgruppe hale [6]. Det fungerer som et kromatin strukturelle proteiner i kjernen, og et proinflammatorisk cytokin ekstracellulært. Som en kjernefysisk protein, binder HMGB1 ikke-spesifikt til mindre spor av DNA og forenkler monteringen av stedsspesifikke DNA-mål [7]. I motsetning til dette, ekstracellulære HMGB1 fungerer som et cytokin som forplanter infection- eller skade-fremkalte inflammatoriske responser [8]. Den konstante utgivelsen av HMGB1 fra nekrotiske kreftceller kan skape en mikromiljøet som ligner kronisk betennelse; en tilstand som er kjent for å bidra til utvikling av epiteliale kreftformer, spesielt inflammasjons forbundet kreft [9]. Faktisk har mange studier demonstrert tidligere over-ekspresjon av HMGB1 i mange typer kreft [10-13], inkludert GC [14]. Dessuten har overbevisende bevis ytterligere bekreftet at HMGB1 overekspresjon er nært beslektet med tumorutvikling ved mediering av den spredning, invasjon og migrering av kreftceller [15, 16]. Derfor kan HMGB1 være en interessant kandidat som en roman prognostisk markør eller terapeutisk mål for GC.
Akkumuler bevis har antydet at genetiske bakgrunn kan påvirke risiko og prognose for GC [17]. Enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) er den vanligste genetiske variasjon, og kan være lovende surrogat biomarkører for pasientenes genetiske bakgrunn for å forutsi behandlingsrespons og prognose [18]. Genetiske varianter har blitt identifisert i humant
HMGB1
genet [19], men sammenhengen mellom
HMGB1
genet polymorfi og GC overlevelse utfallet er aldri blitt fastslått. Gitt den avgjørende rollen HMGB1 i utvikling og progresjon av kreft, er det sannsynlig at polymorfismer av
HMGB1
kan påvirke de kliniske resultatene av GC. Heri, vurderte vi effekten av tre tag SNPs i
HMGB1
på kliniske utfall av 1030 kinesiske GC pasienter (704 i treningssettet, 326 i den uavhengige valideringssett) som fikk radikal reseksjon behandling. I tillegg er effekten av et identifisert relevante kode SNP på regulering av genekspresjon ble ytterligere undersøkt ved hjelp av et
in vitro
funksjonell analyse. Så langt vi kjenner til, er dette den første undersøkelsen av sammenhengen mellom polymorfismer av
HMGB1 Hotell og klinisk resultat av GC.
Materialer og metoder
Etikk
Denne studien ble godkjent av Ethic Komiteen den fjerde Military Medical University. Prosedyrene ble utført i henhold til vedtatte retningslinjer og til 1964 Helsinkideklarasjonen og dens senere endringer eller sammenlignbare etiske standarder. Den signerte informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker inkludert i studien.
Study befolkningen
Det er totalt 1030 Han-kinesere pasienter med primær adenokarsinom i ventrikkel ble registrert fra to uavhengige nettsteder, Tangdu Hospital og Xijing Hospital of Digestive Disease, i Xi’an, Kina. Alle GC tilfeller fått kirurgisk reseksjon og hadde ingen tidligere historie med andre kreftformer eller preoperativ kreft behandling eller blodoverføring innen 3 måneder før operasjonen. Det var ingen alder, kjønn, eller sykdoms scene restriksjoner for saken rekruttering. Blant dem ble 704 pasienter (Department of General Surgery, Tangdu Hospital, mellom juli 2008 og juni 2013) brukes som et treningssett i denne studien. En annen gruppe av 326 pasienter (Xijing Hospital of Digestive Disease, mellom januar 2008 og desember 2010) ble brukt som en uavhengig validering sett. Målet var å identifisere klinisk signifikant prognostisk verdi av SNPs innenfor
HMGB1
gen fra treningssettet og testet den i den uavhengige valideringssettet.
Demografiske og kliniske data
demografiske og kliniske data ble samlet inn gjennom i-person intervjuer på første besøk eller oppfølging på klinikkene, medisinske poster, eller samråd med behandlende leger, inkludert alder, kjønn, etnisitet, bolig region, diagnosetidspunktet, tidspunktet for kirurgi og /eller adjuvant kjemoterapi (ACT), tidspunkt for tilbakefall og /eller død, tumorstadium, Lauren klassifisering, differensiering, histologisk type, og behandlingsprotokoll. Oppfølging informasjonen ble oppdatert 6-måneders intervaller gjennom stedlig intervju, telefonkommunikasjon, eller gjennomgår medisinske poster av kvalifisert forskning spesialister. Den siste oppfølgingsdato var juni 2015 og median oppfølging varighet var 51 måneder (variasjon 6-89 måneder). Andelen av pasienter som går tapt ved oppfølging var 9,8%. OS ble definert som tiden fra kirurgi til GC-spesifikk død. RFS (Gjentakelse overlevelse) ble definert som tiden fra kirurgi til datoen for den første tilbakefall eller fjernmetastaser fra GC. Pasienter i live ved siste oppfølging ble sensurert.
Innsamling, bearbeiding og konservering av prøver
Før kirurgi, 5 ml venøs blod ble samlet inn fra hver GC pasienter til å trekke ut DNA med E.Z.N.A. blod DNA Midi Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA). Seksti mage kreft vev ble samtidig samlet fra valideringssettet for sanntids kvantitativ revers transkripsjon PCR (RT-PCR) analyser.
SNP utvalg og genotyping
Kandidaten tag SNPs utvalg av
HMGB1
-genet ble utført som en to-trinns prosedyre. Først brukte vi et sett av web-baserte SNP utvalg verktøy (https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) for å søke kandidat SNPs av
HMGB1 product: [20]. Alle validerte polymorfismer i
HMGB1
gen region, inkludert 5 kb oppstrøms fra det første ekson, og 5 kb nedstrøms fra den siste ekson, ble ansett for å være kandidat SNP’er. Disse SNPs med en mindre allel frekvens ≥ 5% i HapMap CHB (Han-kinesere i Beijing) befolkning og en parvis koblingsulikevekt squared korrelasjonskoeffisient (r
2) 0.8 ble valgt som kandidat SNPs. Dernest ble tag SNPs valgt fra disse kandidat SNPs bruker International HapMap Prosjekt fase II-databasen av den kinesiske befolkningen (https://www.hapmap.org/, åpnes den 18 november 2013) og HAPLOVIEW versjon 4.2. Til slutt, tre tag SNP’er (bety r
2 = 0,981) ble valgt: rs1045411 (G A), rs1412125 (T C) og rs2249825 (C G) .Genotyping ble utført ved anvendelse av Sequenom iPLEX genotyping system (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Laboratorie personer som har utført genotyping analysene ble blindet for pasientens informasjon. Interne kvalitetskontroller og negative kontroller ble brukt for å sikre genotyping nøyaktighet, og 5 prøver ble tilfeldig valgt og genotypet i to eksemplarer med 100% samstemmighet. Takst for genotyping varierte mellom 99,3% og 99,7%. Den detaljerte informasjonen av SNPs og genotyping resultater ble oppført i S1 tabell.
Funksjonell analyse
De funksjonelle effekter av tag SNP rs1045411 ligger i 3’UTR av
HMGB1
genet ble undersøkt gjennom bruk av luciferase reporter analysen. I korthet ble 49-bp dobbel tråd DNA bærer enten vill genotype eller variant genotype av rs1045411 syntetisert og klonet inn i pMIR-RAPPORT vektor (Ambion, Austin, Tex, USA) ved hjelp av restriksjonsenzymer Spe I og Hind III (Takara, Dalian, Kina). Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Menneske GC cellelinjer SGC-7901 og humane embryonale nyrecellelinje HEK-293T, der har-MIR-505 ble identifisert til å være positivt uttrykt ved hjelp av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) som tidligere beskrevet [21], ble ko-transfektert med enten pMIR-rs1045411-A eller pMIR-rs1045411-G (200 ng /brønn) med eller uten anti-MIR-505 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og den interne kontrollen reporter plasmid pRLTK (Promega, Madison, WI, USA) (20 ng /brønn) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i en 24-brønns plate med 2 × 10
5 celler per brønn. SGC-7901 og HEK293 cellelinjer ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (CAS) (Shanghai, Kina), hvor de ble verifisert av mycoplasma deteksjon, DNA-fingerprinting, isoenzym deteksjon og celle vitalitet deteksjon. En frossen ampulle av hver cellelinje 147, noe som umiddelbart ble ekspandert og frosset når det blir mottatt fra leverandøren, ble gjenopplivet og anvendt i denne studien. Etter 48 timer ble cellene samlet opp for å bestemme luciferase-aktivitet ved hjelp av en dobbel-luciferase-rapportøranalysesystem kit (Promega, Madison, WI, USA) med et luminometer (Tecan, Mannedorf, Sveits). Alle transfections ble utført i tre paralleller, og alle forsøk ble uavhengig gjentatt tre ganger.
For å vurdere effekten av tag SNP rs1045411 genotyper på uttrykk for
HMGB1
mRNA videre, total RNA ble isolert fra 60 vevsprøver GC (30 med AA genotype og 30 med AG /GG genotyper av rs1045411) i samsvar med produsentens anvisninger. Deretter cDNA ble syntetisert ved hjelp PrimeScript RT reagenssett (Takara, Dalian, Kina). RT-PCR ble utført ved hjelp av følgende
HMGB1
primere: fremover, 5′-TAAGAAGCCGAGAGGCAAAA-3 «; omvendt, 5»-AGGCCAGGATGTTCTCCTTT- 3 «, og β-aktin ble benyttet som en intern kontroll (primere: forover, 5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3′, omvendt, 5»-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3 «) [13]. Relativ uttrykk for
HMGB1
mRNA nivåer ble bestemt ved hjelp av den relative kvantifisering metode og 2
-ΔΔCt analyse.
Statistisk analyse
Statistikk analyser ble utført ved hjelp av IBM SPSS statistikk 19,0 programvare (IBM). Normalfordelte kontinuerlige variabler ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD, mens unormalt distribuerte kontinuerlige variabler ble uttrykt som median og rekkevidde. Pearsons χ
2-test ble anvendt for å teste forskjeller i kategoriske variabler. Forskjellen fra normalfordelte kontinuerlige variabler mellom to grupper ble analysert ved hjelp av Student «s
t
-test, mens Mann-Whitney U-test ble anvendt for sammenlikning av unormalt fordelte kontinuerlige variabler. Multivariat Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell ble brukt for å vurdere effekten av individuelle SNP og pasientenes egenskaper på OS eller RFS. Hazard ratio (HRS) og 95% konfidensintervall (CIS) ble estimert med justering for alder, kjønn, Lauren klassifisering, differensiering, TNM stadium og ACT. Kaplan-Meier-kurver og log-rank tester ble også brukt for å evaluere virkningen av de enkelte SNP på overlevelsestiden. Statistikk signifikans ble satt til et nivå på 0,05 og alt
P
verdier rapportert i denne studien var tosidig.
Resultater
Fordeling av pasientenes egenskaper og prognose analyse
GC pasientenes egenskaper ble oppsummert i S2 tabell. På grunn av sen sluttdatoen for pasienten påmelding for treningssettet, median oppfølgingstid var kortere i treningssettet (46 måneder, fra 6 til 80 måneder) enn i den uavhengige valideringssett (72 måneder, alt fra 6-89 måneder). Dermed sammenlignet med pasientene i uavhengig validering sett, de i treningssettet hadde lavere forekomst av tilbakefall (58,4%
vs
. 66,8%,
P
= 0,005) og død (41,4%
vs
. 55,8%,
P
= 0,001). Det var ingen forskjell mellom treningssett og validering satt når det gjelder alder, tumorlokalisering, Lauren klassifisering, TNM stadium, differensiering og ACT (
P
verdi varierende 0,082 til 0,898). Senest oppfølging, 641 pasienter (423 og 218 i opplæring og valideringssettet, henholdsvis) utviklet tilbakefall og 482 døde (300 og 182 i opplæring og valideringssett, henholdsvis). Multivariat Cox regresjonsanalyse viste at det var signifikant høyere død og gjentakelse risiko hos pasienter med diffus typen, dårlig differensiering og tumor stadium III og IV sammenlignet med pasienter med tarmtypen, brønn /moderat differensiering og tumor trinn I og II mellom treningssett, valideringssett og samlet analyse. I tillegg, platina-basert ACT etter operasjonen viste en signifikant beskyttende effekt på både OS og RFS av GC pasienter (S3 tabell).
Association of
HMGB1
SNPs med klinisk utfall i GC pasienter
Vi vurderte foreningen av
HMGB1
SNP genotyper med GC klinisk utfall ved hjelp av multivariat Cox regresjonsanalyse med justering for alder, kjønn, tumorlokalisering, Lauren klassifisering, differensiering, TNM stadium og ACT (som er vist i tabell 1). Resultatene viste at tag SNP rs1045411 var signifikant assosiert med OS av GC pasientene i treningssettet. Sammenlignet med pasienter med GG genotype, de med variant alleler (AG og AA genotyper) hadde en signifikant lavere dødsrisiko (HR = 0,77, 95% KI: 0,60 til 0,97,
P
= 0,032). Denne betydelige funn ble bekreftet i den uavhengige valideringssett og samlet analyse, med timer med 0,80 (95% KI: 0,62 til 0,99;
P
= 0,046) og 0,78 (95% KI: 0,55 til 0,98;
P
= 0,043), henholdsvis. Kaplan-Meier-kurver analyse også en sterk sammenheng med OS. Pasienter som frakter AG /GG genotyper av rs1045411 hadde bedre OS enn gjorde de med GG genotype i treningssettet (
P
= 0,024, fig 1A), validering sett (
P
= 0,017, fig 1B ) og samlet analyse (
P
= 0,001, figur 1C).
OS fra GC pasientene stratifisert ved SNP rs1045411 i treningssettet (A), validering sett (B) og samlet analyse ( C). Pasient tallene kan ikke legge opp til 100% av tilgjengelige fag på grunn av manglende genotyping data.
Stratifisert analyse på sammenslutning av rs1045411 med OS av vertsvariabler
Vi har utført stratifisert analyser for å vurdere sammenhengen mellom genotyper av rs1045411 og OS av GC pasienter etter alder, Lauren klassifisering, differensiering, TNM stadium og ACT. De betydelige beskyttende effekt er tillagt etter rs1045411 var mer fremtredende i ugunstige undergrupper med en HR område 0,39 til 0,69 (figur 2A). For detaljer, betydelig redusert dødsrisiko knyttet til varianten inneholder genotyper (AG /AA) av rs1045411 ble observert hos eldre pasienter (HR = 0,69, 95% KI: 0,48 til 0,99), diffuse typen (HR = 0,67, 95% KI: 0,47 til 0,95), dårlig differensiering (HR = 0,66, 95% KI: 0,45 til 0,95), klinisk stadium III og IV (HR = 0,58, 95% KI: 0,37 til 0,93) og uten ACT (HR = 0,39, 95 % KI: 0,20 til 0,76). Videre er den foreliggende lagdelt analyse viste en lignende trend for RFS med en HR område 0,44 til 0,79 (figur 2B). Resultatene indikerte at AG /AA genotyper av rs1045411 overdro den mer gunstig prognose i uønskede grupper.
Stratifisert analyser av sammenhengen mellom genotyper av rs1045411 og OS av GC pasienter etter alder, Lauren klassifisering, differensiering, TNM stadium og ACT (2A), og effekten på RFS av rs1045411 AG /AA genotyper i uønskede grupper (2B). Pasient tallene kan ikke legge opp til 100% av tilgjengelige fag på grunn av manglende genotyping data.
Joint effekt mellom rs1045411 og Lauren klassifisering, differensiering scenen eller ACT på OS
Tidligere studier har vist at både genetiske variasjoner og kliniske karakteristika samhandler for å spille kritiske roller i GC progresjon [17]; og at der interaksjoner eksisterer, virkningene av kliniske elementer på tumorprogresjon vil bli modifisert av genotyper. Derfor ble en felles analyse utført for å vurdere potensialet modulerende effekten av rs1045411 i disse kliniske kjennetegn (Lauren klassifisering, differensiering, scene og ACT) som representerer status for tumorprogresjon på OS fra GC pasienter. Som vist i tabell 2, var det en signifikant interaksjon mellom genotyper av rs1045411 og Lauren klassifisering, differensiering, scene eller ACT (alle
P
samhandling 0,001). Forhold til enkeltpersoner som frakter AG /AA genotyper og tarmtype, de med GG genotype og diffuse typen hadde en signifikant økt dødsrisiko (HR = 2,09, 95% KI: 1,42 til 3,08,
P
0,001). Lignende resultater ble også funnet i pasienter bærende GG genotype med dårlig differensiering (HR = 2,48, 95% KI: 1,70 til 3,62,
P
0,001) hos pasienter med GG genotype av stadium III /IV ( HR = 2,99, 95% KI: 2,04 til 4,38,
P
0,001), og hos pasienter som bærer GG genotype med ACT (HR = 4,49, 95% KI: 2,70 til 7,45,
P
. 0,001) sammenlignet med tilsvarende referansegruppen
Funksjonell effekter av rs1045411 på genekspresjon
Bioinformatikk analyse (https://www.microrna.org/microrna /home.do) viste en nærhet av tag SNP rs1045411 til den anslåtte mikroRNA bindingsseter (HSA-MIR-505) i 3′-utranslaterte område (3’UTR) av
HMGB1
genet [22] (fig 3A). Vi først bekreftet uttrykk for MIR-505 i SGC-7901 og HEK-293T cellelinjer, og funnet ut at MIR-505 hadde en relativt høyere uttrykk nivå (figur 3B). For å undersøke om de genotyper av tag SNP rs1045411 i 3’UTR av
HMGB1
genet kan endre genuttrykk, to cellelinjer ble transfektert med luciferase reporter plasmider som inneholder enten vill (GG) eller variant (AA) genotype av SNP rs1045411 (fig 3C). Resultatene viste at SNP rs1045411 viste en effekt på den normaliserte luciferaseaktiviteten i begge transfekterte celler i betydelig grad. Sammenlignet med celler transfektert med konstrukter som bærer vill genotype (GG) av SNP rs1045411, celler transfektert med konstrukter som bærer variant genotype (AA), viste en betydelig redusert luciferase-aktivitet. Effekten av anti-MIR-505 på luciferaseaktiviteten av rapportør plasmider ble også undersøkt i studien. Resultatene viste at luciferaseaktiviteten av to UTR-konstruksjonene (p-MIR-G og p-MIR-A) ble signifikant øket ved hjelp av anti-MIR-505 i begge cellelinjer med elimineres forskjeller på luciferaseaktiviteten mellom to rapportør plasmider. Videre har vi brukt kvantitativ RT-PCR for å undersøke effekten av SNP rs1045411 genotyper på HMGB1 mRNA-ekspresjon i 60 GC vev (30 GG med genotype og 30 med AG /AA genotyper) fra valideringssettet. Som vist i figur 3D, fant vi at mRNA uttrykk nivået HMGB1 var betydelig høyere i de bærere med vill (GG) genotype av rs1056560 enn de som utførte variant (AG /AA) genotyper (1,04 ± 0,50
vs
. 0,79 ± 0,37,
P
= 0,004).
(A) sekvensen inkludert SNP rs1045411 i 3’UTR av
HMGB1
genet. (B) Relative uttrykk nivåer av HSA-MIR-505 i SGC-7901 og HEK-293T celler. (C) Effekten av SNP rs1045411 genotyper på uttrykk for
HMGB1
genet i SGC-7901 og HEK-293T celler. (D) Relativ mRNA uttrykk nivå av
HMGB1
genet i 60 GC vev med ulike SNP rs1045411 genotyper. Rekombinant vektor (pMIR-rs1045411-G eller pMIR- rs1045411-A) og PTL-TK ble ko-transfektert inn SGC-7901 og HEK-293T celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av tre uavhengige eksperimenter. Elevens
t
test ble brukt til å undersøke statistisk forskjell.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi foreningen av genetisk polymorfisme i
HMGB1
genet med prognosen for GC pasienter ved to-trinns analyse av trening og valideringssett. Vi viste at AG /AA genotyper av tag SNP rs1045411 i
HMGB1
3′-UTR er signifikant assosiert med en bedre OS i et sett med 704 GC pasienter sammenlignet med GG genotyper. Denne betydelige forening ble bekreftet i en uavhengig valideringssett av 326 GC pasienter, så vel som en samlet analyse av alle 1030 GC pasienter. Funksjonell analyse indikerte at SNP rs1045411 genotyper hatt en betydelig innflytelse på mRNA uttrykk for
HMGB1
i GC vev samt to tumorcellelinjer. Videre gunstig prognostisk effekt av rs1045411 var mer tydelig i de negative undergrupper av GC pasienter. I tillegg er felles analyse fant en signifikant interaksjon av gene-klinisk elementer. Så langt vi kjenner til, denne studien for første gang rapportert sammenhengen mellom
HMGB1
genet polymorfismer og GC prognose. Når de er bekreftet,
HMGB1
SNP rs1045411 kan brukes som en prognostisk markør i kombinasjon med tradisjonelle kliniske prognosefaktorer for beslutningstaking av GC individuell behandling.
Den økende bevis tyder på at forhøyet HMGB1 er assosiert med tumormetastaser og dårlig prognose [16, 23-26], noe som gjør HMGB1 en attraktiv svulst biomarkør. Det har blitt foreslått at HMGB1 fungerer som et potensielt onkogene protein for å fremme tumor fremgang [15, 27, 28], og dets overekspresjon i kreftceller påvirker den anti-kreft-T-cellerespons ved aktivering av intracellulær signalisering [15, 29]. Faktisk har forhøyet uttrykk for HMGB1 påvist hos pasienter med GC og andre typer kreft [30-32], og dens uttrykk er nært forbundet med tumorigenesis [33], tumorinvasjon og metastase [29]. Videre, Chung et al [34] har vist at serum HMGB1 nivåer ble også signifikant assosiert med tumorinvasjon, metastase, vekst, så vel som dårlig prognose. Sammen er disse funnene støtter en viktig rolle HMGB1 i kreft transformasjon, tumorvekst og invasjon.
Til tross for omfattende undersøkelser av HMGB1 uttrykk i vev og den tilsvarende serologisk aktivitet på kreft evolusjon, er det noen studier som fokuserer på effekten av SNPs i
HMGB1
genet på kreft prognose eller behandling svar så langt. I en gruppe kinesiske pasienter med lungekreft, to SNPs, rs141215 og rs2249825, har vært forbundet med platinabasert kjemoterapi respons [35]. Tilsvarende, i pasienter med oral plateepitelkarsinom, en annen
HMGB1
polymorfisme på SNP rs3742305 har vært forbundet med tumorprogresjon og tilbakefall overlevelse [36]. Men ekskludert vi SNP rs3742305 fra denne studien fordi den er i sterk koblingsulikevekt med SNP rs1045411. I denne studien fant vi at varianten inneholder (AG /AA) genotyper av tag SNP rs1045411 var signifikant assosiert med en bedre OS hos pasienter med GC, som støtter en viktig rolle HMGB1 i GC evolusjon.
Siden SNP rs1045411 ligger i 3’UTR-regionen i
HMGB1
gen, kan det påvirke ekspresjonen av
HMGB1
genet i GC pasienter. Til dags dato, men det finnes ingen studier for å evaluere funksjonene i SNP rs1045411. Vi fant at rs1045411 er i umiddelbar nærhet til en forutsagt mikroRNA bindingssete (has-MIR-505) [22], som tyder på at en slik variasjon i denne posisjon kan påvirke stabiliteten av mRNA og bindingsaktivitet til mikroRNA, for derved å modulere genekspresjon [ ,,,0],37]. Faktisk våre luciferaserapportørplasmid analyser bekreftet en betydelig påvirkning av rs1045411 på post-transcriptional regulering av
HMGB1
genet i en MIR-505-avhengig måte. Videre, ved å undersøke HMGB1 mRNA uttrykk nivå i 60 GC vevsprøver med genotype data av SNP rs1045411, fant vi at vev bærer variant holdig (AG /AA) genotyper hatt betydelig redusert HMGB1 mRNA uttrykk nivåer sammenlignet med de med homozygot vill (GG ) genotype. Til sammen våre eksperimentelle data indikerte at den gunstige prognostiske effekten gitt av variant holdig (AG /AA) genotyper av rs1045411 var nært forbundet med avvikende uttrykk for
HMGB1
.
Vår nåværende studien viste at de betydelige eller border beskyttende effekten av variant holdig (AG /AA) genotyper av SNP rs1045411 på OS og RFS av GC pasienter ble funnet nesten helt i stress (men ikke i gunstige) strata pasienter. Dette stemmer med tidligere studier som viser at SNPs påvirke kreft overlevelse mer fremtredende i spesifikke undergruppe pasienter. For eksempel, Wang
et al product: [38] har rapportert at
PSCA
rs2294008 er signifikant assosiert med overlevelse utfall blant diffus-type magekreft, men ikke intestinal-type magekreft. Pu
et al product: [39] har også antydet at mikroRNA-relaterte genetiske varianter er mer bemerkelsesverdig assosiert med ikke-småcellet lungekreft overlevelse i tidlig stadium pasienter. Vi har også observert en betydelig samspilleffekter mellom rs1045411 genotyper og kliniske elementer som Lauren klassifisering, differensiering, klinisk stadium, og adjuvant kjemoterapi i moduler prognosen for GC. Disse signifikante korrelasjoner antydet at SNP rs1045411 kan ha potensielle modulerende roller i disse kliniske kjennetegn som representerer tumorprogresjon. Men de underliggende mekanismene gjenstår å bli undersøkt videre i fremtiden.
I denne studien har flere forskjellige funksjoner. Først de inkluderte pasientene i hovedsak kommer fra Shaanxi og tilstøtende områder, som er egnet for å gjennomføre populasjonsbasert forskning på grunn av den geografiske stabilitet med lav mobilitet rate. For det andre, den relative store befolkningsstørrelse registrert i denne studien mulig for oss å gjennomføre scene-stratifisert analyse i trening og valideringssett, som begrenset konfunderende faktorer av svulsten og behandling heterogenitet. En viktig begrensning med denne studien er at den relative liten befolkning i valideringssettet kan føre til falske-negative. Dessuten, siden vår studie var begrenset til Han-kinesere, vi kan ikke utelukke generalizability problemet. Fremtidige studier i større populasjoner og andre etniske grupper er garantert.
Totalt sett som den første studien observere effekten av
HMGB1
genet polymorfismer på GC prognose i en kinesisk befolkning, våre data sterkt at tag SNP rs1045411 i
HMGB1
genet har en betydelig effekt på det kliniske utfallet av GC pasienter, særlig for pasienter med avansert stadium eller annen aggressiv clinicopathological status. Denne studien har potensial klinisk betydning i å bidra til å avgrense terapeutiske avgjørelser i behandling av GC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Informasjons og genotyping resultatene av HMGB1 SNPs
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154378.s001 plakater (DOC)
S2 Table. Valgt demografiske og kliniske kjennetegn ved magekreft pasient
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154378.s002 plakater (DOC)
S3 Table. Fordeling av pasientenes egenskaper og prognose analyse i treningssettet og validering sett
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154378.s003 plakater (DOC)
