Abstract
Det monoklonale IgM antistoff PAT-SM6 avledet fra humane tumorer induserer apoptose i tumorceller og er ansett som en potensiell anti-kreft agent. Et primært mål for PAT-SM6 er den ufoldede protein respons regulator GRP78, over-uttrykte utvendig på celleoverflaten av tumorceller. Liten vinkel røntgen-spredning (SAXS) studier av human GRP78 viste et to-domene manualformet monomer, mens SAXS analyse av PAT-SM6 avslørte en skål-formet struktur mende fem-gangers symmetri, i overensstemmelse med tidligere studier av relaterte proteiner. Sedimentehastighetsanalyse av grp78 og PAT-SM6 blandinger indikerte svak kompleksdannelse, karakterisert ved dissosiasjonskonstanter i høy mikromolare konsentrasjonsområde. I kontrast, enzymbundet immunosorbant analyser (ELISA) viste sterke og spesifikke interaksjoner mellom PAT-SM6 og immobilisert GRP78. Den tilsynelatende bindingskonstant estimert fra en PAT-SM6 metningskurve korrelert sterkt med konsentrasjonen av GRP78 som brukes til å belegge den mikrotiter skuffen. Eksperimenter med polyklonale antiGRP78 IgG antistoffer eller et monoklonalt IgG derivat av PAT-SM6 viste ikke en lignende avhengighet. Konkurranse eksperimenter med løselig GRP78 indikerte mer effektiv hemming av PAT-SM6 bindende ved lave GRP78 belegg konsentrasjoner. Disse observasjonene tyder på en grådighet binde- mekanisme som er avhengig av flere punkter feste av PAT-SM6 å GRP78 gruppert på overflaten av skuffen. Analyse av ELISA-data i høy grp78 beleggkonsentrasjoner ga en tilsynelatende dissosiasjonskonstant på ca 4 nM. Vi foreslår at den biologiske virkningen av PAT-SM6 i tumorceller apoptose kan avhenge av flerverdige natur PAT-SM6 og høy aviditet av sin interaksjon med flere grp78 molekyler gruppert på tumorcelleoverflaten
Citation.: Rosenes Z, Mulhern TD, Hatters DM, Ilag LL, Strøm BE, Hosking C, et al. (2012) The Anti-Cancer IgM monoklonalt antistoff PAT-SM6 bindes med høy aviditet til utfolding Protein Response Regulator GRP78. PLoS ONE 7 (9): e44927. doi: 10,1371 /journal.pone.0044927
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 21 juni 2012; Godkjent: 09.08.2012; Publisert: 19.09.2012
Copyright: © Rosenes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av den australske Research Council (LP100100392) med ekstra støtte fra Patrys Ltd. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser : Dette arbeidet støttes delvis av Patrys Ltd, et selskap gjennomfører for tiden kliniske studier av PAT-SM6 som en potensiell anti-kreft behandling
Innledning
Natural IgM-antistoffer spiller en viktig rolle i den. medfødte immunrespons, hvor de er involvert i tidlig deteksjon av fremmedpartikler, så vel som deteksjonen av modifiserte selv-strukturer, inkludert kjemisk modifiserte proteiner og amyloidfibriler [1], [2], [3]. IgM-antistoffer deltar også i gjenkjennelse og fjerning av transformerte celler som en viktig forsvar mot kreft [4]. Den siste utviklingen av humant hybridom-teknologi [5] førte til isolering av et stort antall monoklonale antistoffer av IgM-klassen fra tumorer i kreftpasienter [6]. En rekke av disse antistoffene spesifikt drepe ondartede celler ved å fremkalle apoptotiske trasé [7], fremhever potensialet bruk av monoklonale IgM-antistoffer i utviklingen av nye anti-kreft behandlinger.
Den menneskelige IgM monoklonalt antistoff, PAT-SM6 induserer død av tumorceller via en apoptotisk reaksjonsvei ledsaget av intracellulær akkumulering lipid [8]. PAT-SM6 er rettet mot tumorcellene, ved å binde seg til protein GRP78 som er over-uttrykt utvendig på celleoverflaten av tumorceller [9]. GRP78, også kjent som BiP (immunoglobulin tungkjedebindende protein), er et medlem av varmesjokkprotein 70 (HSP70) familie som hindrer stress-fremkalt apoptose. PAT-SM6 binder også low density lipoprotein (LDL) og oksidert LDL [8] som fører til en arbeidsmodell for den tumor-spesifikke apoptotiske aktivitet av PAT-SM6 hvorved PAT-SM6 leverer overskudd av lipid i form av bundet LDL eller oksidert LDL i tumorer ved å binde til modifisert GRP78 til stede på overflaten av tumorceller [8].
(A) GRP78 ble uttrykt og renset fra
E.coli
-celler, og underkastet sirkulærdikroisme spektroskopi. Et representativt spektrum for 0,15 mg /ml av renset GRP78 ved 25 ° C (åpne sirkler) og den passform fra Dichroweb ved hjelp av filtersett sp175 (heltrukket linje) er vist. (B) Sedimentehastighetsanalyse av GRP78 ble utført ved sentrifugering av 0,4 mg /ml av GRP78 ved 28 000 rpm i en analytisk ultrasentrifuge. De resulterende sedimenter absorbans grenser ble overvåket ved 280 nm og representative data som er vist som åpne sirkler. Passer til de eksperimentelle data ved hjelp av en c (S) sedimentemodellen er vist som heltrukne linjer. For klarhet, er bare hver 10. skanning vist. (C) størrelsesfordeling tomter for 1,2 mg /ml av GRP78 (heltrukket linje) eller 0,6 mg /ml av GRP78 (stiplet linje) beregnet fra sluttende data som er representert i (B) til ac (S) sedimente modell.
Pre-kliniske modeller av kreft hos mennesker viser PAT-SM6 hemming av tumorvekst [8], tyder på en potensiell terapi for å behandle kreft. Sikkerhet og toleranse av PAT-SM6 som en anti-kreft antistoff for behandling av melanom er etablert i en fersk fase I klinisk studie [10]. Videreutvikling av PAT-SM6 som et effektivt middel mot kreft vil bli assistert av mer detaljert informasjon om den strukturelle basis og styrke av interaksjoner av PAT-SM6 med mål antigener. Denne kunnskapen er viktig for informert prediksjon av uønskede bivirkninger forbundet med terapeutisk bruk av PAT-SM6 alene eller i kombinasjonsterapier med andre midler. I denne studien har vi undersøkt struktur og interaksjoner av renset PAT-SM6 med rekombinant humant GRP78 uttrykt og renset fra bakterier. Ved hjelp av sedimentering hastighetsanalyse og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) vi viser at, mens PAT-SM6 har en relativt lav affinitet for de enkelte grp78 molekyler, er mye interaksjonen av PAT-SM6 med grp78-molekyler gruppert på overflaten av en mikrotiterplate sterkere og preget av tilsynelatende aviditet konstanter i lav nanomolar konsentrasjonsområdet.
Materialer og metoder
humant monoklonalt antistoff PAT-SM6 og en modifisert heksa derivat, PAT-SM6-hex, mangler sammenføyning J kjede, ble uttrykt og renset fra stabile suspensjonskulturer i en human cellelinje i serumfritt medium [11], [12]. Lignende prosedyrer ble anvendt for å uttrykke og rense en IgG-derivat (PAT-SM6 IgG) sammensatt av de tunge og lette kjedesekvenser av PAT-SM6. Isotypekontrollantistoff IgM ble hentet fra Jackson Immunoresearch Labs, inc, West Grove, PA. Den kodende sekvens for den fulle lengde ble det modne humane GRP78-genet innsatt i et pPOW varmeinduksjon vektor, noe som resulterte i en konstruksjon med en N-terminal sekvens pelB-sekresjon og C-terminale 6xHis-tag [13]. Proteinet ble uttrykt i
E. coli
BL21 (DE3) celler og deretter renset fra den løselige del av cellelysatet av nikkel affinitetskromatografi ved bruk av en 5 mL His-Trap-kolonne (GE Healthcare) i henhold til produsentens protokoll. Glukoseisomerase ble hentet fra Hampton Research, Aliso Viejo, CA.
sirkulærdikroismeanalyse (CD) Målinger
CD spektra for GRP78 (0,15 mg /ml) og PAT-SM6 (0,15 mg /ml) i fosfatbufret saltvann (PBS; 20 mM natriumfosfat, 140 mM NaCl, pH 7,4) ble ervervet ved å bruke en Aviv Model 62 DS CD spektrometer (Aviv Biomedical, Inc., Lakewood, New Jersey) ved 25 ° C med en 1 mm veilengde kvarts kuvette, en spektral båndbredde på 1 nm, et signal gjennomsnittstiden på 2 s og en dataintervall på 0,5 nm. Elliptisitet i millidegrees ble korrigert for målinger av buffer alene og omdannes til bety rest elliptisitet (MRE) ved hjelp av formelen MRE = elliptisitet x MRW /(10 x c x l) hvor MRW er den midlere rest vekt i g /mol, c er konsentrasjonen i mg /ml, og l det banelengden i cm. CD spektra ble analysert for å få estimater av sekundærstruktur ved hjelp Dichroweb [14].
(A) Den rå SaXs data er vist som sirkler som representerer gjennomsnittsintensitet
I
(
q
) som en funksjon av momentum transfer
q
. Feilfelt indikerer ± 1 standardavvik (σ). Svarte symboler:
I
(
q
) ≥ og belastningen, og grå symboler:
I
(
q
) σ. (B) Guinier tomt for disse SaXs data for q.Rg 1,3. (C) Krátky plott av SaXs data. (D E) Porod-Debye tomter som en funksjon av
q
3 og
q
4, henholdsvis. (F) Et SAXS-avledede
ab initio
form rekonstruksjon (gjennomsnitt filtrert form fra 10 rekonstruksjoner) er vist lagt på NMR-raffinerte domenet arrangement av de krystallografiske strukturer av de N-terminale og C-domener av bakteriell GRP78 homolog DnaK [26].
Small-vinkel x-ray spredning (SAXS)
SAXS data ble samlet inn ved Australian Synchrotron SAXS /waxs beamline i forbindelse med in- linje gelfiltreringskromatografi som beskrevet av Gunn og medarbeidere [15]. Lastende konsentrasjoner for den in-line gelfiltreringskolonne var 5 mg /ml for SM6 og 5 mg /ml for GRP78. Detector bildene ble analysert som gjennomsnitt av ti etterfølgende 2 s eksponeringer ved hjelp av SAXS15ID programvare (Australian Synchrotron), som så ble omgjort til individ
I
(
q
) SaXs profiler.
I
(
q
) er spredt X-ray intensitet som funksjon av omfanget av momentum transfer vektor
q
= (4πsinθ) /λ, der spredningsvinkel er 2θ og røntgenstrålebølgelengden er λ (1,0332 Å).
q
spenner over hvilke intensiteter ble samlet var 0,0047 til 0,2807 Å
1. SaXs profiler ble analysert ved hjelp av ATSAS (versjon 2.4) pakke med programmer [16]. Guinier analyse ble utført ved hjelp av AUTORG. Intensiteten på null vinkel
I
(0) og den maksimale dimensjon (
D
max
) av spredning partikler ble estimert fra
P product: (
r
) pair avstand vektor fordelingsfunksjoner ved hjelp AUTOGNOM. Volumene av de respektive sprednings partikler ble beregnet ut fra området under Krátky plott (
q
2
I
(q) /
I
(0) vs .
q
) som beskrevet av Svergun og Fegin [17]; der, ble Krátky tomter ekstrapolert ved lav
q plakater (
q
q
min) bruker Guinier tilnærming og ekstrapolert ved høy
q
(
q
der
i
(
q
)
/i
(0) 0,01) ved hjelp av Porod tilnærming [18].
Ab initio
form rekonstruksjoner fra spredning av data ble utført ved hjelp av DAMMIF [19] og i gjennomsnitt filtrerte former regnet fra ensembler av 10 rekonstruksjoner med DAMAVER pakke med programmer [20]. Stiv kropp raffinement med tillegg av manglende segmenter ble utført ved hjelp CORAL [21] for flere kjeden modeller. Teoretiske spredning profiler fra strukturelle modeller ble generert og sammenlignet med eksperimentelle SaXs data ved hjelp CRYSOL [22]. Strukturelle modeller og form konvolutter hvor optimalt lagret hjelp SUPCOMB [23]. Statistiske sammenligninger av godhet anfall av teoretiske spredning profiler av strukturelle modeller til eksperimentelle SaXs data ble utført ved beregning
F
-statistic for par rykk og integrere den aktuelle
F
-distribution [ ,,,0],24].
Sedimente Velocity Analysis
Sedimentation hastighetsforsøk ble utført ved bruk av et XL-i analytisk ultrasentrifuge (Beckman Coulter, Fullerton, CA) utstyrt med en An-60 Ti rotor ved 20 ° C . Proteinprøver ble tilsatt til dobbeltsektor EPON fylt centre med 20 mM natriumfosfat, pH 7,0, 100 mM NaCl, 55 mM arginin i referansekammeret. Radial absorbans dataene ble innsamlet ved en rotorhastighet på 28000 opm, ved bruk av en bølgelengde på 280 nm, og med radiale trinn på 0,003 cm i kontinuerlig skannemodus. De sedimenterende grenser ble utstyrt med en modell som forutsatt en fordeling av sedimenterings koeffisienter for ikke-interagerende art, C (S), ved hjelp av programmet SEDFIT [25]. Data ble tilpasset ved anvendelse av en regularisering av parameter p = 0,95 og flytende friksjonsgraden.
(A) 0,15 mg /ml av PAT-SM6 ble underkastet sirkulærdikroisme spektroskopi. Et representativt spektrum ved 25 ° C (åpne sirkler) og den passform fra Dichroweb ved hjelp av filtersett sp175 (heltrukket linje) er vist. (B) Sedimente hastighet analyse av PAT-SM6 ble utført ved sentrifugering 0,4 mg /ml PAT-SM6 på 28 000 rpm i en analytisk ultrasentrifuge. De resulterende sedimenter absorbans grenser ble overvåket ved 280 nm og representative data som er vist som åpne sirkler. Passer til de eksperimentelle data ved hjelp av en c (S) sedimentemodellen er vist som heltrukne linjer. For klarhet, er bare hver tredje skanning vist. (C) Størrelse distribusjons tomter for pentamer PAT-SM6 (heltrukket linje) og heksa PAT-SM6 (stiplet linje) beregnet fra montering data er representert i (B) til ac (S) sedimente modell.
enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)
antigener ble belagt på 96-brønners mikrotiter-brett (Nunc Maxisorp) ved inkubering over natten ved 4 ° C. Plater ble deretter vasket 3 ganger i PBS, 3 ganger i PBS + 0,1% Tween 20, 3 ganger i PBS og blokkert med 5% (w /v) BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur, deretter vasket igjen som ovenfor. Alle antistoffpreparater ble tatt opp i 5% (w /v) BSA i PBS. For indirekte ELISA forsøk ble antistoffer påføres direkte på plate og inkubert i 1 time. For konkurrerende ELISA, ble antistoffer inkubert i oppløsning sammen med forskjellige mengder av antigen før påføring på mikrotiterplaten. Etter vasking på nytt som ovenfor, peroxidise-konjugert sekundært antistoff (geite-anti-kanin-IgG (Calbiochem), kanin-anti-humant IgG (Calbiochem), eller kanin-anti-humant IgM (Dako), avhengig av det primære antistoff kilden og klasse) var påført platen og inkubert i en time i henhold til produsentens instruksjoner. Etter en endelig vask, antistoff-binding ble bestemt ved anvendelse av 100 ul per brønn av 3,3 «, 5,5»-tetrametylbenzidin substratløsning (Sigma) og måling av fargeendring ved 655 nm. Tidsforløpet for fargeutvikling ble hovedsakelig lineær over optisk tetthet serien 0-3. Målinger ble tatt 15 minutter etter tilsetning av substrat. I kontrolleksperimenter som involverer direkte belegging av platene med PAT-SM6, over konsentrasjonsområdet 0-2,5 ug /ml, var en systematisk økning observert i ELISA-signal med øket belegg konsentrasjon, noe som tyder på en direkte korrelasjon mellom ELISA-signalet og den mengden av antistoff bundet til platen. ELISA-data for titrering av primære antistoff-binding til immobilisert GRP78 ble analysert anta en enkel Langmuir spesifikk binding isotermen beskrevet av forholdet Y = K
a /(1-K
a) hvor Y er størrelsen av ELISA-signalet og K
a er den tilsynelatende bindingskonstant forutsatt en enkelt klasse av bindingssteder.
(A) den rå SaXs data er vist som sirkler som representerer gjennomsnittsintensitet
i
(
q
) som en funksjon av momentum transfer
q
. Feilfelt indikerer ± 1 standardavvik (σ). Svarte symboler:
I
(
q
) ≥ og belastningen, og grå symboler:
I
(
q
) σ. (B) Guinier tomt for disse SaXs data for
q
R
g
. 1,3. (C) Krátky plott av SaXs data. (D E) Porod-Debye tomter som en funksjon av
q
3 og
q
4, henholdsvis. (F)
ab initio
form gjenoppbygging (gjennomsnitt filtrert form fra 10 rekonstruksjoner med eksplisitt P5 symmetri) er vist oppå den stive kroppen raffinert SAXS modell, generert ved hjelp av Fab og Fc fragmenter sammen med en fleksibel 8-rest poly-Gly linker. Orienteringen av de fire konstante Ig-domener av hver Fc-fragmenter ble modellert på krystallstrukturen av IgE og den relative orientering Fc ble begrenset av avstandsbegrensninger påtvinge inter-kjede disulfidbindinger [33].
resultater
Karakterisering av Purified GRP78
Menneskelig GRP78, knyttet til en pelB N-terminal forlengelse og Hans-Tag [11] ble uttrykt og renset fra
E. coli
. Massespektrometri av det rensede produkt ga en masse på 73270,7 Da sammenlignet med en teoretisk verdi på grunnlag av sammensetningen av 73269,9 Da. CD-spektrofotometri indikerte en foldet struktur med en CD-spektra karakterisert ved en dobbel minima ved omtrent 208 og 221 nm (figur 1). Analyse av spektra ga estimater av 22,1% og 29,1% for ett og et -struktur, henholdsvis. Disse verdiene kan sammenlignes med estimater av 36% a-heliks og 27% a-ark for den sekundære strukturen bestemmes ut fra den tredimensjonale struktur av bakteriell HSP70 homolog, DnaK [26]. Ytterligere bevis for den korrekte sammenfolding av renset human GRP78 ble oppnådd ved analyse av rest ATPase-aktivitet. Anvendelse av en kombinert pyruvat kinase-laktat dehydrogenase-analyse [27] er angitt en spesifikk aktivitet på omtrent 4 nmol ATP hydrolysert per sekund per pmol av GRP78.
A. 0,4 mg /ml av PAT-SM6 og 0,4 mg /ml av GRP78 ble inkubert sammen og sentrifugert ved 28 000 rpm. De resulterende sedimenter absorbans grenser ble overvåket ved 280 nm og representative data som er vist som åpne sirkler. Passer til de eksperimentelle data ved hjelp av en c (S) sedimentemodellen er vist som heltrukne linjer. B. Tilsvarende c (S) størrelsesfordeling tomter for dataene som er gitt i (A) for PAT-SM6 (svart stiplet linje), grp78 (grå stiplet linje), og blandingen av de to proteiner (heltrukket linje). C. Radial distribusjoner oppnådd etter sentrifugering ved 28 000 rpm i 72 min for PAT-SM6 (0,4 mikrometer, grå sirkler), GRP78 (10 mikrometer, svarte sirkler) og blanding av PAT-SM6 (0,4 mm) og GRP78 (10 mikrometer, solid linje). Den faste grå linjen er summen av de radiale distribusjonene innhentet for PAT-SM6 og GRP78 alene, forutsatt ingen interaksjon.
Sedimentasjon hastighetsdata for renset GRP78 viste en eneste stor sedimenter grense (figur 1). Analyse av disse data å anta en kontinuerlig størrelsesfordeling av ikke-veksel art indikerte en dominerende art som kjennetegnes ved en sedimente koeffisient, friksjonskoeffisienten og molekylvekt i overensstemmelse med tilstedeværelsen av GRP78 monomer (tabell 1). I tillegg til dette hovedarter, dataene identifisert en konsentrasjonsavhengig større artene (s20, w på omtrent 7,2 S) tilbakeføres til nærværet av en dimer i langsom likevekt med de dominerende artene monomere.
SAXS data for grp78 er vist i figur 2A. Den Guinier plottet fra disse dataene (figur 2B) var lineær ved lave
q plakater (der
q
Rg
. 1,3) og treghetsradius (
R
g
) oppnådd fra skråningen var 45,5 ± 2,2 Å. Massen av GRP78 monomer ble beregnet fra arealet under Krátky plottet (figur 2C) for å være 89,5 kDa, noe som er 22% høyere enn den teoretiske verdi på 73,2 kDa. Gitt at in-line gelfiltreringskromatografi mulig for oss å eliminere spredningsbidrag fra en dimer, denne analysen gir et monomert protein densitet på 0,85 g.cm
-1, som er et tegn på den diffuse elektrontettheten av et meget fleksibelt molekyl [28]. Inspeksjon av Porod-Debye plott (figur 2D 2E) viste GRP78 SaXs data ikke platå som
I
(
q
)
q
. 4 vs.
q
4, men gjorde platå som
I
(
q
).
q
3 g
q
3, noe som ytterligere støtter forslaget om at GRP78 er svært fleksibel, men inneholder betydelig foldet struktur [28]. Som en kontroll ble lignende analyse gjennomført på SAXS data registrert fra en kompakt globulært protein, glukose isomerase. Disse analysene viste et platå i både
I
(
q
).
q
3 g
q
3 og
i
(
q
).
q
4 vs.
q
4 tomter og ga en tetthet på 1,32 g.cm
-1, som er i utmerket overensstemmelse med tidligere studier av dette molekylet [28].
konsentrasjonen av GRP78 som brukes til å belegge brønnene var 30μg /ml. A: Primære antistoffer ble brukt var PAT-SM6 (kolonnene 1 og 3), anti-GRP78 (kolonne 2) og styre isotype IgM-antistoff (felt 4). I felt 3 det første beleggingstrinnet med GRP78 ble utelatt. B: Primær antistoff som ble brukt var PAT-SM6. Inkubasjoner ble utført i 20 mM natriumfosfatbuffer med noe tilsatt NaCl (felt 5), 140 mM NaCl (spor 6), og 500 mM NaCl (spor 7). C: Primær antistoff som ble brukt var PAT-SM6. Inkubasjoner ble utført i 20 mM natriumfosfatbuffer, 140 mM NaCl ved pH-verdier på 6 (spor 8), 7,4 (kolonne 9) og 8 (kolonne 10).
ab initio
form modellering av GRP78 ble utført etter estimering av partikkelvektor avstand fordelingsfunksjon
P product: (
r
) ved indirekte Fourier transformasjon. Den maksimale dimensjon (
D
max
) fra
P product: (
r
) analyse ble anslått til å være 134 Å. Figur 2F viser den resulterende gjennomsnittlige volum filtrert SAXS modell lagret på NMR-raffinerte hele lengden av struktur DnaK [26]. Den generelle formen og gjennomsnittlig relativ orientering av N-domenet og C-domenet til GRP78 er forenlig med NMR-data for DnaK, videre etablere overveiende monomere natur og korrekt folding av bakterie uttrykte humane GRP78 produkt.
Karakterisering av Purified PAT-SM6
strukturen og løsningsorientert adferd renset PAT-SM6 ble også preget. CD-spektra til PAT-SM6 avslørte et enkelt minimum ved omtrent 215 nm, noe som tyder på en overveiende β-ark sekundærstruktur (figur 3). Resultatene tåler sammenligning med tidligere CD-studier på sekundærstruktur av IgM antistoff [29]. Analyse av CD data for PAT-SM6 indikert sekundærstruktur består av ca 3,8% a-spiraler, 51% A-tråder, 7,7% svinger og 35,8% uordnet struktur. Sedimentehastighetsdata for PAT-SM6 viste en enkelt stor grense (figur 3). Analyse av dataene, forutsatt at en kontinuerlig sedimente koeffisient fordeling av ikke-interaksjons art, avslørte tilstedeværelsen av en større og en mindre populasjon karakterisert ved en gjennomsnittlig sedimente koeffisientene til 17 S og 24 S, henholdsvis (tabell 1). Disse resultatene er i overensstemmelse med tilstedeværelsen av monomere og dimere IgM-arter [30]. Den optimale verdi som oppnås for friksjonsforhold, f /fo, ble brukt til å analysere den generelle formen på PAT-SM6 monomer. Dataene indikerer et asymmetrisk form som svarer til en flattrykt ellipsoide med parametrene som er oppført i tabell 1. Sedimentehastighetsdata ble også oppnådd for en heksa PAT-SM6 derivat, PAT-SM6-hex, mangler en kjede J [11]. Size-distribusjon analyse av dataene indikerer en stor sedimenter arter preget av s20, w og f /f verdier på 17,6 S og 1,95 henholdsvis
De primære antistoffer som ble brukt var:. A. PAT-SM6; B. polyklonale anti-GRP78; C. PAT-SM6-hex og D. PAT-SM6 IgG. Konsentrasjonene GRP78 belegg var 30 ug /ml (lukkede sirkler), 15 pg /ml (åpne invertert trekanter), 7,5 ug /ml (lukkede firkanter), 3,75 ug /ml (åpne diamanter), 1,88 ug /ml (lukkede trekanter) , 0 ug /ml (åpne sirkler). De heltrukne linjene er best tilpasning linjer som beregnes for et enkelt bindende isotermen.
A. Bindende konstanter for PAT-SM6 (lukkede sirkler) og PAT-SM6-hex (åpne sirkler). B. Bindende konstanter for PAT-SM6 IgG (lukkede sirkler) og anti-GRP78 (åpne sirkler).
SaXs data for PAT-SM6 er presentert i figur 4A. Den Guinier tomten (figur 4B) er lineær ved lave
q plakater (
q
R
g
. 1,3) og
R
g
hentet fra skråningen var 122,0 ± 1,4 Å.
D
max
ble estimert fra
P product: (
r
) analyse for å være ~4.2 nm og den molekylære massen stammer fra området under Krátky tomten ( Figur 4C) var 1,06 × 10
6 Da. Disse estimatene av masse,
R
g Hotell og
D
max
verdier for PAT-SM6 er i god overensstemmelse med de fra tidligere SaXs studier av IgM [31]. Igjen, tilstedeværelse av et platå i handlingen i
I
(
q
).
q
3 g
q
3 (figur 4D) og mangel på et platå i
i
(
q
).
q
4 vs.
q
4 plott (figur 4E) indikerte en foldet struktur med betydelig fleksibilitet [28].
Ab initio
form modellering av PAT-SM6 ikke samles på en fysisk realistisk form uten ileggelse av eksplisitte symmetri begrensninger. Snarere enn vilkårlig imponerende fem ganger symmetri, ble godhet tilpasning av de teoretiske SaXs profiler av modeller med ulike symmetrier (P2, P3, P4, P5 og P6) til SaXs data i forhold [24]. Fem ganger symmetri ga best mulig passform, som var betydelig bedre at de passer med fire ganger eller seks ganger symmetri (
P product: (
F
) verdier av 0,036 og 0,004, henholdsvis) . Den gjennomsnittlige SAXS formen modell av PAT-SM6 monomer med fem ganger symmetri enige godt med generelle funksjoner preget i forrige elektronmikroskopi, SaXs og homologi modellering studier av IgM [31], [32], [33]. Multi-kjede stivt legeme avgrensning mot SAXS data ble utført ved å bruke Fab-fragmentene fleksibelt koblet til Fc-fragmenter basert på IgE [34], i henhold til nyere EM modellering [33]. P5 symmetri ble pålagt og den relative orientering av Fc fragmenter ble begrenset av avstand begrensninger som tilsvarer de inter-subenheten disulfidbindinger [35]. Den SAXS
ab initio
form modellen vises kledde på den stive kroppen raffinert SAXS modell (figur 4F). Begge SAXS modeller antyder asymmetri i den relative plassering av de to Fab-fragmenter innenfor hver av de fem tungkjede-lettkjede-par, noe som er konsistent med den EM-form rekonstruksjonene [35]. Disse strukturelle studier bekrefter den relative homogenitet PAT-SM6 forberedelse og egnethet for løsnings undersøkelser vedrørende interaksjoner med spesifikke antigener.
A. Konsentrasjonen av GRP78 brukes til å belegge brønnene var 7,5 ug /ml. De primære antistoffene som ble anvendt PAT-SM6 (5 ug /ml, lukkede sirkler) og polyklonale anti-grp78 (åpne sirkler). Resultatene er også presentert for kontrollforsøk utelate GRP78 belegge valgt som primære antistoffer PAT-SM6 (5 mg /ml, lukkede trekanter) eller anti-GRP78 (åpne firkanter). B: Bindingen av PAT-SM6 (5 ug /ml) til immobilisert GRP78 ved forskjellige GRP78 beleggkonsentrasjoner i fravær (svarte søyler) eller nærvær (grå søyler) av oppløselig GRP78 (4 mg /ml). C: Løselig GRP78-indusert hemming av PAT-SM6 binding til immobilisert GRP78 på ulike GRP78 belegg konsentrasjoner. Konsentrasjonene av PAT-SM6 og løselig GRP78 som ble brukt var 5 mikrogram /ml og 4 mg /ml.
samspillet mellom PAT-SM6 med GRP78 i Solution
Sedimentasjon hastighetsanalyse ble brukt til å undersøke samspillet mellom PAT-SM6 og GRP78. De radielle skanner i figur 5A, fremstilt for en blanding av PAT-SM6 (0,4 mm) og GRP78 (10 mm), viser en langsom og en rask bevegelse grenser som tilsvarer omtrent til grense hastigheter oppnås for separate prøver av GRP78 og PAT-SM6 henholdsvis (figur 2 og 4). Kontinuerlig størrelsesfordelingen analyse av data innhentet for PAT-SM6-GRP78 blanding bekreftet to store populasjoner preget av gjennomsnittssedimente koeffisienter som ligner på gjennomsnittsverdier for GRP78 og PAT-SM6. Analyse av området under populasjonen svarende til PAT-SM6 indikerte en liten nedgang i området på ca. 10%, i samsvar med tap av materiale. Dette tap ble tilskrevet dannelse og rask uttømming av store antistoff-antigen-komplekser. Ytterligere bevis for tap av materiale på grunn av kompleksdannelsen er levert av en sammenligning av de radiale skanninger tatt ved et enkelt tidspunkt for PAT-SM6 alene, GRP78 alene og blandingen av PAT-SM6 og av GRP78. Resultatene viser at platået verdien for PAT-SM6-GRP78 blandingen er lavere enn kombinerte skanninger den optiske tettheten for de enkelte komponenter, som tyder på kompleksdannelsen. En vanskelighet i analysen av data for svake reversible komplekser er dynamikken i samspillet og kompleksiteten i å tilpasse dataene til spesifikke modeller [36]. Ikke desto mindre er dataene i Figur 5C viser tap av bare en liten mengde av PAT-SM6 som store komplekser, tilsvarende ca. 10% av PAT-SM6. Siden den totale konsentrasjon av PAT-SM6 og GRP78 anvendt i disse eksperimentene var 0,4 uM og 10 uM, henholdsvis dette estimatet for den delen av komplekset utbytte et anslag for dissosiasjonskonstanten, forutsatt at en 01:01 kompleks, på omtrent 90 pM. Denne relativt lav bindende affinitet er typisk for IgM-antigeninteraksjoner forhold til samspillet mellom affinitet maturated IgG antistoffer og deres beslektede antigener [37].
ELISA analyse av samspillet mellom PAT-SM6 og GRP78
interaksjonen av PAT-SM6 med GRP78 immobilisert på en mikrotiterplate ble analysert ved anvendelse av en ELISA-analyse. Resultatene i figur 6 viser et sterkt positivt signal ved hjelp av enten PAT-SM6 eller anti-GRP78 som det primære antistoff. Kontrollforsøk utelate den innledende GRP78 belegget prosedyre eller ved hjelp av en IgM isotype kontroll-antistoff ga et signal som var nær bakgrunn. Størrelsen av det positive signal for interaksjonen av PAT-SM6 med immobilisert GRP78 var lik for prøvene inkubert i 20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4 i forhold til PAT-SM6 prøvene i PBS mens signalet ble signifikant redusert når NaCl konsentrasjonen ble øket til 500 mM. Bindingen av PAT-SM6 til immobilisert GRP78 ble lignende for inkubasjoner ble utført ved pH-verdier på 6, 7,4 og 8.
I lys av den forholdsvis sterkt signal ble observert for interaksjonen av PAT-SM6 med GRP78 i ELISA-analyser (figur 6) i forhold til den forholdsvis svake interaksjon utledet fra sedimenteringshastigheten studier (figur 5B og C) ytterligere forsøk ble utført for å bestemme styrken av interaksjonen observert under ELISA-betingelser. Resultatene i figur 7A viser ELISA-signalet bestemmes som en funksjon PAT-SM6 konsentrasjonen for forskjellige konsentrasjoner av belegg GRP78. Resultatene viser typiske kurver metninger hvor størrelsen av ELISA-signalet ved metning øker systematisk som belegget konsentrasjonen av GRP78 PAT-SM6 økes. Også vist i figur 7 er kontrollforsøk ved bruk av forskjellige konsentrasjoner av anti-GRP78, PAT-SM6-heks og PAT-SM6 IgG. I hvert tilfelle er det en systematisk økning i størrelsen av metningskurvene med øket GRP78 belegg konsentrasjon.
