Abstract
Tumor nekrose faktor-relatert apoptose inducing ligand (TRAIL) induserer apoptose i en rekke kreftcellelinjer med liten eller ingen effekt på normale celler. Imidlertid er dens virkning begrenset som noen kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen showet de novo motstand mot Trail indusert apoptose. I denne studien rapporterer vi at GSK-3-inhibering ved hjelp av farmakologiske midlet AR-18, som forsterkes TRAIL følsomhet i en rekke bukspyttkjertel og prostata cancercellelinjer. Denne sensibilisering ble funnet å være caspase-avhengige, og både farmakologisk og genetisk knock-down av GSK-3 isoformer resulterte i apoptotiske egenskaper som vist ved spaltning av PARP og caspase-3. Forhøyede nivåer av reaktive oksygenmellomprodukter og forstyrrelse av mitokondriell membranpotensiale punkt til et mitokondrie forsterkning sløyfe for TRAIL-indusert apoptose etter GSK-3-hemming. I samsvar med dette, overekspresjon av anti-apoptotiske mitokondrielle mål som BCL-XL, Mcl-en, og BCL-2 reddet PANC-en og PPC-1 celler fra TRAIL sensibilisering. Imidlertid overekspresjon av caspase-8-inhibitor CrmA også hemmet de sensibiliserende virkningene av GSK-3-inhibitor, noe som tyder på en ytterligere rolle for GSK-3 som hindrer død reseptorsignalisering. Akutt behandling av mus med PANC-1-xenografter med en kombinasjon av AR-18 og TRAIL resulterte også i en signifikant økning i apoptose, som målt ved hjelp av caspase-3 spalting. Sensibilisering til TRAIL skjedde til tross for en økning i β-catenin grunn av GSK-3-hemming, noe som tyder på at tilnærmingen kan være effektivt selv i kreft med feilregulert β-catenin. Disse resultatene tyder på at GSK-3-hemmere kan være effektivt kombineres med TRAIL for behandling av bukspyttkjertelkreft
Citation. Mamaghani S, Simpson CD, Cao PM, Cheung M, Chow S, Bandarchi B, et al. (2012) glykogensyntasekinase-3 Hemming sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler i Trail-indusert apoptose. PLoS ONE syv (7): e41102. doi: 10,1371 /journal.pone.0041102
Redaktør: Shawn B. Bratton, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 02.12.2011; Godkjent: 21 juni 2012; Publisert: 19.07.2012
Copyright: © 2012 Mamaghani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av Campbell Family Institute for Cancer Research. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Rekombinant human Apo2L /TRAIL var en gave fra Genentech, South San Francisco, CA. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den ytre apoptose sti starter med binding av døden reseptorligander som Fas ligand, tumor nekrose faktor-α (TNF-α), og tumor nekrose faktor-relatert apoptose induserende ligand (TRAIL) til døden reseptorer, aktivere en serie av signaler som kan føre til to separate, men innbyrdes, moduser av apoptose-induksjon. I noen tilfeller, aktivering av død reseptor-4 (DR-4) og død reseptor-5 (DR-5) fører til rekruttering av adapter proteiner for å danne den dødsinduserende aliserte kompleks (DISC), og etterfølgende aktivering av initiatoren caspaser-8 eller -10 er tilstrekkelig til å aktivere kaspaser effektor-3, -6 og -7 og apoptose resultater [1]. Imidlertid binding av TRAIL til DR-4 eller DR-5 og aktivering av kaspaser-8 eller -10 er ofte utilstrekkelig til å indusere apoptose, og krever frigivelse av mitokondrielle mediatorer så som cytokrom C for å forsterke den død induserende signal [2]. Dette krysstale mellom ytre og indre apoptose trasé krever caspase-8 mediert spalting av BCL-2 familiemedlem Bud [2], [3]. Avkortet Bud (tBid) virker som en sperremekanisme for inhibering av virkningen av anti-apoptotiske Bcl-2 proteiner som Bcl-2, Mcl-1, og Bcl-XL, som fører til mitokondriene-indusert celledød [3].
TRAIL kan også binde to sett av ikke-funksjonelle lokkereseptorer, i hvilket tilfelle er det apoptoseinduksjon blokkerte [1]. Balansen mellom dødsinduserende reseptorer og lokkefugl reseptorer er en viktig faktor for apoptoseinduksjon i målcellene [4]. I motsetning til TNF-α og Fas, synes TRAIL for å vise større spesifisitet overfor apoptose-induksjon i tumorceller
in vivo
, med tilsvarende mindre toksisitet overfor verten [1], [4], [5], [ ,,,0],6]. Selv om den eksakte mekanismen for mål-spesifisiteten av TRAIL ikke er kjent, er mangelen på toksisitet hos normale celler delvis tilskrives den lavere ekspresjon av døds reseptorer (DR-4 og DR-5) og den økte ekspresjon av lokke reseptorer på overflaten av normale celler [4], [7]. I motsetning til en rekke kreftformer viser en økt ekspresjon av DR-4 og -5-reseptorer, hvilket gjør dem utsatt for Trail-indusert apoptose [3]. Mens tumorici-dal effekten av TRAIL er lovende, det har begrenset effekt og mange svulster er motstandsdyktig mot TRAIL [5], [8], [9], [10], [11].
Tidligere arbeid av vår laboratorium og andre foreslår at NF-kB er positivt regulert av glykogen syntase kinase-3 (GSK-3) og er involvert i kjemoterapi-motstand, kreftcelleoverlevelse, vekst og metastase [12], [13], [14]. GSK-3-hemming indusert anti-overlevelse virkninger i kreft i bukspyttkjertelen celler, forbundet med nedregulering av NF-kB aktivitet og redusert uttrykk for anti-apoptotiske målgener som XIAP, BCL-XL, og cyclin D1 [14].
GSK-3 kan også beskytte celler fra TNF-α-mediert cytotoxity, noe som indikerer at GSK-3 har en rolle i å blokkere døds reseptor-mediert apoptose [15], [16], [17]. Interessant nok har de inhiberende virkninger av GSK-3 blitt utvidet til andre døds reseptorer så som TRAIL og Fas [18], [19]. Hemming av GSK-3 har vist å forsterke TRAIL-indusert apoptose i menneskelever og prostata kreft cellelinjer [10], [20]. I løpet av forsøk som er beskrevet i vårt tidligere arbeid, ble det bemerket at GSK-3-inhibering blokkert aktivering av NF-kB av TNF-α [14]. Siden NF-kB aktivering har tidligere blitt foreslått å undertrykke TRAIL-indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler [21], dette funnet antydet muligheten for GSK-3-hemming å bevisstgjøre kreft i bukspyttkjertelen til TRAIL. I denne rapporten har vi testet om GSK-3-hemming hadde en sensibiliserende effekt på TRAIL-indusert apoptose begge
in vitro
bruker bukspyttkjertelen og prostata kreft cellelinjer og
in vivo
hjelp Panc-1 xenografter .
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer PANC-en og BxPC-3 (ATCC, Rockville, MD) ble opprettholdt som beskrevet tidligere [ ,,,0],14]. PPC-1 prostatakreftcellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2 i luft.
Rekombinant human Apo2L /TRAIL var en gave fra Genentech, South San Francisco CA. Den generelle kaspaseinhibitor z-VAD-FMK var fra Alexis-Enzo Life Sciences, Inc. Plymouth Meeting, PA.
Stabil transfections
For overekspresjon studier pcDNA3.1-Myc konstruerer inneholder anti -apoptotic markører: BCL-2, BCL-XL, CrmA, og MCL-en inneholder pcDNA3.1-His tag konstruksjon ble brukt (Sidnet, Toronto, Canada)
PANC-1 og PPC-1 celler. ble transfektert bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) med 0,95 ug /brønn DNA. Transfektanter ble selektert med G418 i 14 dager for å generere stabile kloner som tidligere beskrevet [22]. Funksjonaliteten til de uttrykte proteiner ble bekreftet ved hjelp av staurosporin apoptoseinduksjon analyse [23].
Cell Proliferation Assay
Den doseavhengig effekt av AR-A014418 (AR-18) (tilpasset syntetisert, Toronto Forskning Chemicals Inc., North York, Ontario, Canada), TRAIL (rh-TRAIL, R E og kløyvet caspase-3 som beskrevet tidligere [26] og visualisert under et Olympus BX41 mikroskop bruker 4X og 40X forstørrelse objektiv
Kvantifisering av Spaltet Caspase-3
Presentasjoner farget for spaltede caspase-3 ble analysert på en blindet måte for å oppnå en H-stillingen. Fargeintensitet av hver prøve ble bedømt i forhold til intensiteten av en styreskyveren fra mus som mottok bære behandling. En score på 1+ indikert svak flekker i forhold til bakgrunnen, 2+ = moderat farging, og 3+ = sterk farging. Fargeintensitet ble rapportert på det høyeste nivået av intensitet observert i alle vev elementer. For sammenligning av farging mellom vevene ble resultatene kvantifisert ved beregning av en komplett H-stillingen som tar hensyn til både fargeintensitet og prosentandelen av celler farget ved et bestemt utvalg av intensiteter. En komplett H-poengsum ble beregnet ved å multiplisere intensiteten i andelen positivt fargede celler (H = P × I) som beskrevet tidligere [26].
Statistical Analysis
For å undersøke mulige synergi virkningen ved å kombinere AR18 med TRAIL ble interaksjon mellom de to medikamentelle behandlinger testet ved å sette den inn i en modell som tar hensyn til det faktum at noen eksperimenter ikke ble utført på samme tid. Verdiene av optisk tetthet (for SRB) var log transformert for å stabilisere variansen av restene. De resulterende verdier ble analysert ved å sammenligne mellom forskjellige konsentrasjoner av hvert legemiddel ved hjelp av lineære regresjonsmodeller. Et legemiddel interaksjon ble ansett synergistisk når effekten av medikamentkombinasjonen var signifikant større enn summen av effektene av begge legemidler, og sub-additiv når det var mindre enn. Behandlingseffekter ble sammenliknet med Student t test og forskjeller mellom midler ble ansett for å være av betydning når P≤0.05. Analysen ble utført ved hjelp av «R» programvare som beskrevet tidligere [14]. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE.
Statistisk analyse av hele H-score ble utført ved hjelp av tosidige t-test med uparede data med lik varians. Statistisk signifikans ble vurdert hvor verdien p =. 0,05
Resultater
GSK-3 Hemming sensitizes Trail-Resistant kreft i bukspyttkjertelen celler til apoptose
Behandling av PANC-en og BxPC-3-celler med AR-18 (25 og 50 uM) eller DMSO i 24 timer, etterfulgt av tilsetning av TRAIL (5, 10, 20, 40 ng /ml) i ytterligere 24 timer viste at behandling med begge legemidler fører til konsentrasjonsavhengig vekst-inhibering som bestemt ved SRB-analysen, selv om PANC-1-celler var relativt resistente mot TRAIL (figur 1). Vesentlig større toksisitet ble observert i begge cellelinjer ved kombinasjon av de to midlene, og denne effekten er svært synergistisk når analysert som beskrevet tidligere [14] (for BxPC-3, p = 0,0002 ved hjelp av en kombinasjon av 40 ng /ml TRAIL og 50 uM AR-18 og p 0,005 for alle de gjenværende doseringsregimer, for PANC-1, s 0,005 for alle doseringsregimer med unntak av 25 uM AR-18 i kombinasjon med 5 og 10 ng /ml TRAIL som ikke var signifikant) (fig 1 og tabell S1). Virkningen var mer tydelig etter forbehandling med 50 uM AR-18, noe som tyder på at den synergistiske virkning avhenger av omfanget av GSK-3-inhibering i stedet for TRAIL-konsentrasjon.
PANC-1 (A) og BxPC- 3 (B) ble behandlet med TRAIL etter 24 timer før eksponering til AR-18 ved de angitte konsentrasjoner, og celleproliferasjon måles ved SRB-analysen. Hver bar graf betyr at fra tre separate forsøk med seks paralleller. feilfelt = ± SEM.
Immunoblot-analyse av PARP spalting i cellelysater ekstrahert fra PANC-1 og BxPC-3-celler behandlet med 25 uM AR-18, 10 ng /ml TRAIL eller kombinasjonen viste at det ikke var noen påvisbar PARP-spaltning ved hjelp av AR-18 alene, den kombinerte behandling med TRAIL betydelig forbedret PARP-spaltning i begge cellelinjer. I samsvar med effektene observert av SRB analysen BxPC-3 celler viste følsomhet for TRAIL basert på PARP cleavage, mens PANC-1 celler var resistente.
For å teste om TRAIL sensibilisering av kreft i bukspyttkjertelen celler av GSK-3 hemning er kaspase-avhengig, PANC-1 og BxPC-3-celler ble behandlet med 25 uM AR-18 og /eller 10 ng /ml TRAIL i nærvær av den generelle kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK. Som vist i figur 2B, selv om z-VAD seg produsert noen toksiske virkninger, men det vesentlig reddet begge cellelinjer fra AR-18 pluss TRAIL kombinasjon. Videre TRAIL hadde en caspase-avhengig effekt på BxPC-3, men ikke PANC-1-celler, i overensstemmelse med deres større TRAIL følsomhet vist ved SRB-analysen. Som vist i figur 2B, delvis redning fra AR-18 forekom med Z-VAD-FMK, noe som tyder på at de inhiberende virkninger av GSK3-hemming er, til en viss grad, caspase-avhengig. Disse data indikerer at TRAIL allergi ved GSK-3-inhibering innebærer caspaseaktivering.
(A) BxPC-3 og PANC-1-cellene ble behandlet med AR-18, i kombinasjon med eller uten TRAIL i 24 timer og analysert ved for PARP cleavage. (B) BxPC-3 (venstre) og PANC-1 (høyre) celler ble behandlet med AR-18 (25 UM), TRAIL (10 ng /ml), z-VAD-FMK 50 mikrometer, eller kombinasjoner indikert og SRB analysen etter 22 timers inkubering. Hver bar graf betyr at fra tre eksperimenter med seks paralleller. feilfelt = ± SEM. * P 0,005, ** p. 0,0001
Effekter av genetisk knockdown av GSK-3 på TRAIL Sensibilisering av kreft i bukspyttkjertelen celler
For å teste om TRAIL-sensibiliserende effekt av AR-18 var på grunn av GSK-3-inhibering, og for å teste for funksjonell redundans i GSK-3-isoformer, vi neste undersøkte ekspresjonsnivåene av spaltede PARP og spaltet caspase-3 i cellelysater fra PANC-1-celler forbigående transfektert med siRNA rettet mot GSK-3α, β, eller begge deler, i nærvær eller fravær av 10 ng /ml TRAIL. Celler transfektert med egge siRNA eller mottar ingen behandling ble anvendt som negative kontroller, mens celler behandlet med AR-18 alene eller i kombinasjon med TRAIL ble betraktet som positiv kontroll. Immunoblotting viste 80% reduksjon av total protein i hver isoform (figur 3) i respons til 3-dagers inkubering med sirnas mot GSK-3-isoformer hvis sammenlignet med ubehandlede eller egge behandlede celler. Behandling med TRAIL (10 ng /ml) alene hadde en mindre effekt på apoptose målt ved PARP eller caspase-3 spalting, mens forbigående knockdown av GSK-3 α eller p-isoformer alene hadde ingen signifikant effekt. Kombinasjonen av TRAIL med GSK-3β genetisk knockdown, i motsetning til dette i det vesentlige forbedret PARP og caspase-3 spaltning når sammenlignet med ubehandlede, enkle behandlinger, eller kryptert siRNA. GSK-3α knockdown i kombinasjon med TRAIL indusert liten effekt på PARP og caspase-3 cleavage, men samtidig knockdown med GSK-3 hadde en signifikant effekt som var sammenlignbar med den til AR-18 (figur 3). Disse resultatene støtter ideen om at GSK-3-hemming er ansvarlig for TRAIL sensibiliserende effekter av AR-18, og videre foreslå at GSK-3β spiller en mer fremtredende rolle. Men rollen som GSK-3α er mindre klart fordi vi ikke var i stand til å oppnå samme grad av knockdown som GSK-3β.
Panc-1 celler ble forbehandlet ved hjelp av AR-18 eller siRNA mot både isoformer av GSK-3, og deretter utsatt for TRAIL. Immunoblotting bekrefter vellykket knockdown av GSK3α og β. Dette resulterte i økt spalting av PARP og caspase-3 etter eksponering for TRAIL. Scr. Egge uspesifikk siRNA
TRAIL Sensibilisering ved GSK-3 Hemming Innebærer Mitokondrier
Dødsfall reseptor signalisering initierer en kaskade av hendelser som fører til aktivering av effektor caspase- 3 og induksjon av apoptose [6]. Men i enkelte celler kaspase-3 aktivering krever signalforsterkning via Bid spalting og mitokondrier aktivering [2], [6]. Dette i sin tur fører til en ubalansert fysiologiske status av mitokondrier som resulterer i økt produksjon av reaktive oksygenmellomprodukter og forstyrrelse av mitokondriemembranpotensialet [24]. For å teste for involvering av mitokondriene i løpet TRAIL allergi ved AR-18, flowcytometri ble brukt til å måle mitokondriemembranen potensial (ΔΨm) og ROI generasjon. Kombinasjonen av TRAIL og AR-18 induserte dannelsen av heterogene populasjoner av PANC-1 og BxPC-3-celler som hadde egenskapene til øket avkastning generasjon, tap av ΔΨm, og PI opptak, sammenlignet med ubehandlet kontroll eller enkeltbehandlinger (figur 4) . I samsvar med resultatene fra SRB-analysen og PARP-spaltning, ble AR-18-behandling ikke fremkalle apoptotiske egenskaper i noen av de testede cellelinjer. Behandling med TRAIL alene produsert noen tap av ΔΨm og økt avkastning i BxPC-3, men ikke PANC-1 celler, selv om denne effekten var ikke så omfattende som kombinasjonsbehandling. Disse resultatene tyder på at TRAIL allergi ved GSK-3-hemming innebærer mitokondriene.
PANC-1 og BxPC-3 celler var ubehandlet eller inkubert med AR-18 (25 mm), TRAIL (10 ng /ml), eller deres kombinasjon i 24 timer, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Dot tetthet plott av propidiumjodid (PI) opptak vs ΔΨm viser at tap av ΔΨm forut PI opptak. TRAIL indusert tap av ΔΨm i BxPC-3, men ikke i PANC-1, i samsvar med deres større følsomhet sett ved hjelp av SRB-analysen (figur 1). Kombinert behandling med TRAIL og AR18 klart sensitivisert begge cellelinjer til tap av ΔΨm, og dette ble fulgt av økt avkastning generasjon og tap av ut membranintegritet.
molekylære mekanismer av TRAIL allergi ved GSK-3 Hemming
for ytterligere å undersøke mekanismene for TRAIL allergi ved GSK-3-hemming, vi ansatt PPC-en prostatakreft celle overekspresjon BCL-2, BCL-XL, og Mcl-en for å hemme mitokondrie vei, eller cytokinrespons modifiseringsmiddel A (CrmA) for å hindre død-reseptoren vei av kaspase-aktivering. Vurdering av villtype PPC-1-celler ved hjelp av SRB og flowcytometri analyser viste at medikamentkombinasjon var mer effektiv enn den enkle midler (figur S1). Neste, vi evaluert effekten av anti-apoptotiske proteiner på følsomhet for TRAIL og AR-18. PPC-1-celler som overuttrykker CrmA, Mcl-1, Bcl-XL, og Bcl-2 viste signifikant forbedret celleproliferasjon etter behandling med TRAIL + AR-18 kombinasjon, sammenlignet med celler som ikke overuttrykker enten anti-apoptotiske markører (figur 5A) .
PPC-1 (A) og PANC-1 (B) stabile kloner transfektert med Bcl-2, Bcl-XL, CrmA, og MCL-1 inneholdende pcDNA3.1-His-tag-konstruksjonen ble behandlet med den kombinasjonen av AR-18 (50 pM) og TRAIL (10 ng /ml) i 24 timer. Resultatene uttrykkes som cellenes levedyktighet målt ved SRB-analysen. Hver graf betyr at fra tre eksperimenter med seks paralleller. feilfelt = ± SEM.
I likhet med de resultatene som er oppnådd ved hjelp av PPC-1 celler, overekspresjon av CrmA og BCL-2 i Panc-1 celler beskyttet fra TRAIL + AR-18 kombinasjon, selv om det var forskjeller i de relative virkninger av Bcl-2-familiemedlemmer og virkningene av Bcl-XL ble ikke statistisk signifikant i PANC-1-celler. Den beskyttende virkning overekspresjon CrmA, som virker til å undertrykke dødsreseptor caspaseaktivering, foreslår muligheten for at GSK-3-inhibering kan sensitiv til sti gjennom forbedring av initiator caspaser som caspase-8, samt via anti-apoptotiske molekyler slik som Bcl- 2 og Mcl-1 i kreft i bukspyttkjertelen celler. Imidlertid vil videre arbeid være nødvendig for å etablere dette.
AR-18 sensitizes Panc-1 celler til TRAIL
in vivo
For å undersøke effekten av kortsiktige eksponering for kombinasjonen av AR-18 og TRAIL på apoptoseinduksjon i Panc-1 xenografttumorer, først etablert vi at den maksimale dosen av AR-18 tolerert av SCID-mus som brukes av vårt laboratorium var 20 mg /kg, gitt to ganger daglig ved intraperitoneal injeksjon (ip). Mann SCID-mus med PANC-1 xenotransplantater ble delt inn i fire forskjellige behandlingsgrupper og behandlet i.p. injeksjon med DMSO eller AR-18 (20 mg /kg, hver 12. time i 2 dager), etterfulgt av i.p. injeksjon av TRAIL (25 mg /kg) i løpet av 24 timer etter den siste AR-18 dose. 24 timer etter siste behandling ble musene avlivet og svulster høstet (Figur 6A).
(A) Skjematisk av
in vivo
behandling protokollen. (B) β-catenin ekspresjonsnivåer ble kvantifisert ved hjelp av densitometri, og de resulterende verdier ble normalisert mot α-tubulin. T-test viste at kombinasjonen vs kontroll: p = 0,0012, og for AR-18 vs kontroll: p 0,0001. (C) Kvantifisering av apoptose i tumorprøver ved anvendelse av H- stillingen. Spaltes caspase-3-fargede objektglass (som vist i figur S2) ble bedømt for intensitet av farging (I) så vel som prosentandelen av celler som var positive for den tilsvarende flekk (H = I × P). Resultater av uparet student t-test (n = 5 i hver behandlingsgruppe) er som følger: TRAIL vs kontroll (p = 0,0002), kombinasjon vs kontroll (p = 0,0004), kombinasjon vs TRAIL (p = 0,0261), kombinasjon vs AR -18 (p = 0,0035). (D) Evaluering av dyr vekt under behandlingen.
Som avlesning for de farmakodynamiske effektene av AR-18, målte vi nivået av β-catenin som reguleres av GSK-3 gjennom Wnt veien. Det var et signifikant (p 0,0001) økning i β-catenin nivåer sammenlignet med DMSO behandlede prøver etter behandling med AR18 (figur 6B), noe som tyder på at GSK-3-inhibering ble oppnådd med hell i de PANC-1-xenografter. Uventet, nivåene av β-catenin ble betydelig økt i TRAIL behandlet mus. Dette synes å være en ny oppdagelse, betydning som for tiden er usikker. Videre er en kombinasjon av begge medikamenter betydelig økt β-catenin nivåer sammenlignet med kontroller DMSO, men verdiene ikke var signifikant høyere enn AR-18 alene.
kombinasjonsterapi Økninger spaltet Caspase-3
in vivo
H-rille målinger av kløyvde caspase-3 indikerte at TRAIL alene produserte signifikant (p = 0,0002) apoptoseinduksjon i PANC-1 tumorer (figur 6C og Figur S2), mens AR-18 som monoterapi hadde ubetydelige effekter. Imidlertid er kombinasjonen av AR-18 og TRAIL viste en større effekt i indusering av apoptose i forhold til enkeltbehandlinger eller DMSO behandlede kontroller: kombinasjon versus kontroll (p = 0,0004), kombinert vs. TRAIL (p = 0,0261), kombinert vs. AR-18 (p = 0,0035). For å undersøke eventuelle toksiske effekter hos de dyrene som fikk 20 mg /kg AR-18 alene eller i kombinasjon med TRAIL, lever og nyrer ble formalin-fiksert, parafin innleiret og seksjonene ble farget med H E og spaltet caspase-3. Ingen åpenbare morfologiske endringer av skade inkludert nekrose eller apoptose ble sett. Kroppsvekten til dyrene målt daglig i løpet av denne akutte doserings eksperimentet viser ingen signifikante forskjeller mellom behandlingsgrupper, bortsett fra at dyrene som fikk TRAIL alene opprettholdt deres veie i forhold til DMSO-kontroll (figur 6D).
diskusjon
Denne studien tyder på at potensialet for å bevisstgjøre bukspyttkjertel kreft til TRAIL av GSK-3-hemming. Først observerte vi TRAIL allergi via GSK-3-hemming i både prostata og bukspyttkjertel kreft cellelinjer. For det andre, ble fremgangs TRAIL sensibilisering vist seg å være caspase-avhengig. Tredje, genetisk knockdown av GSK-3 bruker isoform spesifikke sirnas var like effektive i TRAIL-allergi som var lite molekyl hemmer AR-18. Fjerde, ble GSK-3-hemmerindusert TRAIL allergi forbundet med tap av mitokondriemembranen potensial ledsaget av økt avkastning generasjon. Femte, overekspresjon studier i kreft i bukspyttkjertelen celler indikerte at både caspase-8 (CrmA) og NF-kB-avhengige mitokondrie proteiner (BCL-2, og MCL-1) var involvert i prosessen med TRAIL sensibilisering. Bruk av TRAIL i kombinasjon med GSK-3-inhibering er relevant for behandling av kreft i bukspyttkjertelen som disse tumorer har en høy frekvens av K-ras og p53-mutasjoner som sannsynligvis bidrar til deres resistens mot standardmidlene [27], [28], mens TRAIL følsomhet er rapportert å være p53-uavhengig og TRAIL er effektiv i svulster med inaktive p53 [29]. Også har aktive K-ras mutasjoner blitt rapportert å bevisstgjøre kreftceller til TRAIL-indusert apoptose [30], [31].
Vi testet først stien sensibilisering fenomen og optimalisert vår studie ved hjelp av prostata kreft celler på grunn av forrige proof of concept i disse kreftformene [20]. Interessant nok, selv om det var variasjon i følsomhet TRAIL blant de testede cellelinjer, med PANC-1 er den mest motstandsdyktige TRAIL, i kombinasjon med GSK-3-undertrykkelse gitt en konsistent og svært signifikant sensibilisering til TRAIL i alle cellelinjene som ble testet. Dette allergi syntes å være mer avhengig av nivået av GSK-3-hemming, snarere enn på TRAIL konsentrasjonen.
Tidligere studier tilskrives TRAIL motstand av kreft i bukspyttkjertelen celler til overekspresjon av X-bundet hemmer av apoptose (XIAP ) [32]. Volger
et al.
Viste at blokkering XIAP lysfølsomt kreft i bukspyttkjertelen celler i Trail-indusert apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo product: [33]. Andre studier har understreket betydningen av NF-kB i motstand mot TRAIL gjennom oppregulering av hemmere av apoptose som XIAP, BCL-2, BCL-XL, og Mcl-1 [21], [34], [35], [ ,,,0],36], [37]. GSK-3-hemming nedregulerer uttrykket nivået av disse NF-kB målgener [14], [38] og kan også blokkere død reseptor vei [15], noe som tyder på at GSK-3-hemming kan bevisstgjøre kreftceller til TRAIL behandling gjennom flere mekanismer .
i tråd med tidligere funn at GSK-3 kan blokkere død reseptor signalisering oppstrøms caspase-8 [15], CrmA overekspresjon reddet fra TRAIL + AR18 kombinasjon. Selv tyder på en ytterligere rolle for GSK-3 i døden reseptor signalisering, ville videre eksperimenter være nødvendig for å bekrefte det. Vi fant også kløyving av caspase-3 og PARP i celler sensibilisert for TRAIL enten AR-18 eller genetisk knockdown av GSK-3 isoformer. Interessant, effekten av GSK-3β i TRAIL-fremkalt apoptose var mer fremtredende enn GSK-3α, selv om intensiteten av dobbelt isoform knockdown ble betydelig forbedret sammenlignet med GSK-3β alene, og var sammenlignbare med det som ses med AR-18. Disse resultatene var lik våre tidligere rapport som indikerer at genetisk blokade av GSK-3β og dobbel knockdown av GSK-3-isoformene er forholdsvis mer effektive enn GSK-3α i å undertrykke NF-kB aktivitet [14]. Men det ble ikke formelt testet i disse forsøkene, og vil kreve ytterligere undersøkelser.
Flere av NF-kB target proteiner hemme mitokondrie vei, og vi spurte derfor om AR-18 + TRAIL kombinasjon forstyrrer mitokondrienes funksjon . Vi fant en forbedret utgave av ROI i forbindelse med redusert mitokondriemembranen potensial i celler behandlet med TRAIL + GSK-3-hemmer, noe som tyder på involvering av mitokondrier. Selv generasjon av ROI som effektormekanisme under medikamentindusert apoptose i kreftceller er velkjent [39], våre resultater er av interesse som de foreslår en sammenheng mellom TRAIL allergi ved GSK-3-hemming og mitokondrie respiratoriske kjeden. En slik effekt ble tidligere observert i en studie av Jung
et al
., ved hjelp av curcumin for å bevisstgjøre nyrekreftceller til Trail [40]. Curcumin behandling forbedret avkastning generasjon i TRAIL sensibilisert celler. I tillegg har vi også observert en økning i DR-5 til uttrykk i en ROI-avhengig måte [40]. Lignende resultater ble tidligere rapportert i menneskelige astroglial celler, med vekt på ROI-avhengig oppregulering av TRAIL døds reseptorer [41]. Kløyving av caspase-3 observert i vår studie kan fremme innflytelse ROI produksjon, som aktivert caspase-3 kan indusere en feedback loop på mitokondrie respiratoriske kjeden [42]. Enten økning i avkastningen generasjon i kreft i bukspyttkjertelen celler er den avgjørende årsaken til TRAIL allergi etter GSK-3-hemming, eller det er generert som en Tilskuereffekten av apoptose gjennomføring, gjenstår å bli undersøkt. Det er også verdt å merke seg at avkastningen generasjon igjen kan knytte NF-kB til prosessen med TRAIL sensibilisering av GSK-3-hemmere i bukspyttkjertelkreft.
